向日葵列當毛蕊花糖苷的提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

孔德興，徐永清，楊 燕，韓瑛琪，賀付蒙，王 雪，馮艷忠，劉 娣，李鳳蘭

(1東北農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院，黑龍江 哈爾濱 150025)

向日葵列當(Orobanchecumana)為列當科列當屬植物，別名毒根草、兔子拐棍[1]，屬于寄生性雙子葉一年生草本植物，全球范圍內(nèi)均有分布，是危害最嚴重的寄生性雜草之一。向日葵列當寄生于向日葵，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，一直以來都被當作雜草防治防控。但向日葵列當與草蓯蓉(Boschniakiarossica)、肉蓯蓉(Cistanchedeserticola)等名貴中草藥在化學成分、藥理作用上有很多相似之處，同時又具有資源豐富、成本低等優(yōu)點，因此，向日葵列當可以作為藥用資源植物進行開發(fā)利用。

列當科植物中主要含有苯乙醇苷類化合物、環(huán)烯醚萜類化合物、木脂素及其苷類等多種化學成分，具有較高的藥用價值[2-3]。趙夢霞[4]對向日葵列當?shù)幕瘜W成分、抗氧化活性和抗菌活性進行了系統(tǒng)研究，證實向日葵列當中的正丁醇段具有很好的抗氧化活性，乙酸乙酯段和正丁醇段均有較好的抗菌活性。毛蕊花糖苷(acteoside)又名類葉升麻苷，為典型的苯乙醇苷類化合物，廣泛存在于植物界[5]。曲正義等[6-7]從向日葵列當中分離提取出6種單體化合物，篩選出抗氧化活性較強的苯乙醇苷類化合物，利用RP-HPLC測定發(fā)現(xiàn)向日葵列當中黃藥苷(crenatoside)和毛蕊花糖苷的總含量達到藥材質(zhì)量的1%左右。孔征等[8]通過Box-Behnken響應面法優(yōu)化管花肉蓯蓉中毛蕊花糖苷的提取工藝，提高了毛蕊花糖苷的提取效率?，F(xiàn)代藥理學研究表明，毛蕊花糖苷具有抗氧化、抗炎殺菌、保護神經(jīng)、抗腫瘤、增強學習記憶、抗病原微生物和保護皮膚等多種功能[9-14]。

向日葵列當?shù)募毎趫杂?，是提取其有效藥用成分的主要障礙，采取破壁法提取其有效成分是解決該障礙的有效策略之一。且中藥材細胞破壁后具有良好的吸收性、溶解性和化學活性等，解決了使用復雜、耗時等問題，甚至個別中藥的藥效可提高4～5倍[15]。利用靈芝和釀酒酵母發(fā)酵物對油菜花粉壁進行破壁的研究表明，發(fā)酵物中含有木質(zhì)素酶、纖維素酶、蛋白酶和果膠酶等，靈芝和釀酒酵母發(fā)酵物對油菜花粉的破壁率可高達85.08%和 88.30%[16]。尚德靜等[17]利用食用菌生長過程中分泌產(chǎn)生的纖維素酶、果膠酶、蛋白酶對植物細胞壁進行生化處理，最終提高了植物細胞壁破壁率，使植物內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)能更好釋放。

對植物細胞進行破壁處理主要是降解細胞壁組分中的纖維素和木質(zhì)素。本研究對木質(zhì)素降解菌和纖維素降解菌進行混合培養(yǎng)，建立混合菌系并用于向日葵列當?shù)陌l(fā)酵破壁，采用單因素試驗和響應面優(yōu)化試驗探索復合菌劑的最佳破壁酵解條件，同時通過測定對OH·自由基、DPPH自由基和超氧陰離子的清除活性，評價向日葵列當毛蕊花糖苷的體外抗氧化活性，以期獲得一種高效提取向日葵列當藥用成分的方法體系，為提高該植物的應用價值和資源合理應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試植物和菌種

向日葵列當全草于2019年采自新疆阿勒泰向日葵種植地。產(chǎn)纖維素酶菌株有真菌雷斯青霉(Penicilliumraistricki)(S1)、產(chǎn)紅青霉(Penicil-liumrubens)(S2)和霉菌(Fungalsp.)(S3)，產(chǎn)木質(zhì)素酶菌株有白腐菌(Phanerochaetcchrysosporium)(S4)和黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)(S5)，以上菌株均由東北農(nóng)業(yè)大學植物資源與分子生物學實驗室提供。

1.2 復合菌拮抗試驗

將3株產(chǎn)纖維素酶和2株產(chǎn)木質(zhì)素酶的菌株分別組合接種到同一個PDA培養(yǎng)基平板中，觀察各培養(yǎng)基中的菌株生長狀況，并觀察各菌株之間是否能生長在一起，以及是否有明顯的分界線。能夠生長在一起、無明顯分界線的菌株不具有拮抗性，可以復配進行后續(xù)試驗；不能生長在一起、有明顯分界線的菌株具有拮抗性，不進行復配，應單獨研究處理。

1.3 向日葵列當藥用成分分析

1.3.1 向日葵列當浸提膏的制備 向日葵列當自然風干后，粉碎過孔徑450 μm(40目)篩，室溫保存?zhèn)溆?。?0 g向日葵列當粉末用10倍體積的90%(體積分數(shù))乙醇振蕩浸提3次(20 ℃、140 r/min)，振蕩提取時間分別為72，48和24 h。合并3次浸提液后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮至15 mL，移裝至廣口瓶中，置4 ℃冰箱內(nèi)保存、備用[18]。

1.3.2 GC-MS分析 通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)對提取得到的向日葵列當浸膏進行組分分析鑒定。參考文獻[19]的方法設置參數(shù)：HP-INNOWAX毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)。升溫程序：起始溫度70 ℃，保持3 min；以5 ℃/min的升溫速率升至150 ℃，保持3 min；再以0.5 ℃/min的升溫速率升至154 ℃，保持2 min；最后以25 ℃/min的升溫速率升至240 ℃，保持4 min。GC-MS條件：電離能70 eV，接口溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，掃描范圍(m/z)45～550。

1.4 向日葵列當發(fā)酵用復合菌劑的篩選

分別用S4-S5、S4-S5-S2、S4-S5-S1和S4-S5-S1-S2組合成不同的復合菌劑對向日葵列當進行酵解，以未用任何菌酵解作為對照(CK),比較酵解液中毛蕊花糖苷含量，篩選適宜的發(fā)酵用復合菌劑。

1.5 毛蕊花糖苷酵解提取的單因素試驗

預設酵解溫度40 ℃、pH值6、酵解時間2 d為單因素試驗中的常規(guī)值，以不同酵解溫度(10，20，30，40和50 ℃)、pH值(5，6，7，8和9)和酵解時間(1，2，3，4和5 d) 3個單因素變量替換試驗中的相應常規(guī)值，測定向日葵列當毛蕊花糖苷的含量，研究3個因素對毛蕊花糖苷提取效果的影響。

1.6 毛蕊花糖苷提取工藝的響應面優(yōu)化

以單因素試驗結果為基礎，利用Design-Expert V8.0.6軟件進行響應面設計，選取酵解溫度(A)、酵解pH值(B)、酵解時間(C)為考察因素，以向日葵列當毛蕊花糖苷含量(Y)為考察指標，根據(jù)Box-Behnken中心組合原理設定3因素3水平響應面試驗(表1)。

表1 向日葵列當毛蕊花糖苷提取工藝的Box-Behnken 試驗設計因素與水平

1.7 酵解液中毛蕊花糖苷的HPLC檢測

各組發(fā)酵試驗結束后，將發(fā)酵液超聲(功率80 W)提取30 min后蒸干，用乙醇提取制成乙醇提取液，過孔徑0.22 μm有機溶劑濾膜，在高效液相色譜儀器上進樣[20]。色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm×5 μm)，流動相為乙腈/0.1%(體積分數(shù))HAc水溶液，梯度洗脫(0～20 min，10%～20%乙腈；20～25 min，20%～30%乙腈)，檢測波長334 nm，柱溫為室溫(30 ℃)，進樣量100 μL。

1.8 毛蕊花糖苷體外抗氧化活性的測定

采用梯度稀釋法將毛蕊花糖苷配制成0.4，0.2，0.1，0.05，0.025，0.012 5 mg/mL的溶液，以相同質(zhì)量濃度的VC溶液作為陽性對照，研究毛蕊花糖苷的體外抗氧化活性。

1.8.1 對OH·自由基的清除能力 將2 mL毛蕊花糖苷溶液加入到試管中，再加入2 mL FeSO4(2 mmol/L)和2 mL水楊酸(2 mmol/L)，充分混勻后加入2 mL H2O2(2 mmol/L)，在37 ℃水浴鍋中充分反應30 min，冷卻至常溫，在510 nm波長處測定吸光度值。用蒸餾水代替H2O2溶液作為樣品背景，用蒸餾水代替毛蕊花糖苷溶液作為空白對照，計算OH·自由基清除率(D1)。

D1=[1-(As-As0)/A0]×100%。

式中：A0為空白對照的吸光度值，As為毛蕊花糖苷的吸光度值，As0為樣品背景的吸光度值。

1.8.2 對DPPH自由基的清除能力 將2 mL毛蕊花糖苷溶液加入到試管中，再加入無水乙醇配制的2 mL DPPH(0.017 8 mmol/L)溶液，充分混勻后在室溫下避光反應10 min，在517 nm波長處測定其吸光度值。用無水乙醇代替DPPH溶液作為樣品背景，用無水乙醇代替毛蕊花糖苷溶液作為空白對照，計算DPPH自由基清除率(D2)。

D2=[1-(A-As)/A0]×100%。

式中：A為毛蕊花糖苷的吸光度值，As為樣品背景的吸光度值，A0為空白對照的吸光度值。

1.8.3 對超氧陰離子的清除能力 在試管中分別加入4.5 mL Tris-HCl(50 mmol/L)緩沖液和1 mL 毛蕊花糖苷溶液，在37 ℃水浴鍋中恒溫反應25 min后加入0.5 mL鄰苯三酚(3 mmol/L)，迅速振蕩搖勻，加入到比色皿中，在325 nm波長處每隔30 s測定吸光度值。用蒸餾水代替毛蕊花糖苷溶液作為空白對照，計算超氧陰離子自由基清除率(D3)。

D3=(ΔA0-ΔAs)/ΔA0×100%。

式中：ΔAs為毛蕊花糖苷的吸光度值，ΔA0為空白對照的吸光度值。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗數(shù)據(jù)均采用3次生物學重復或3次技術重復的平均值，用Microsoft Excel分析試驗數(shù)據(jù)并繪圖。采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用獨立樣本進行GraphPad Prism 5差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 酵解向日葵列當?shù)膹秃暇g的拮抗作用

酵解向日葵列當?shù)膹秃暇g的拮抗結果見圖1。

A.S3和S4菌株復配正面；B.S3和S4菌株復配背面；C.S3和S5菌株復配正面；D.S3和S5菌株復配背面；E.S4和S5菌株復配正面；F.S4和S1菌株復配正面；G.S5和S1菌株復配正面；H.S4和S2菌株復配正面；I.S5和S2菌株復配正面

如圖1所示，在5種菌株之間，霉菌(S3)與白腐菌(S4)、黃孢原毛平革菌(S5)(圖1-A-D)復配均產(chǎn)生抑菌圈，相互拮抗，不適合進行混合復配；其余菌種復配均無分界線產(chǎn)生，菌絲混合生長在一起，無拮抗現(xiàn)象，具有良好的兼容性。因此，真菌雷斯青霉(S1)、產(chǎn)紅青霉(S2)、白腐菌(S4)和黃孢原毛平革菌(S5)菌株可以建立復合菌系，可用于研究單獨菌株和混合菌株的降解效果。

2.2 向日葵列當中的藥用成分

經(jīng)GC-MS全組分分析，從向日葵列當濃縮浸膏中共檢測出207種化學物質(zhì),其中相對含量較高的40種組分見表2。

表2 向日葵列當中相對含量居前40的組分信息

表2列出的40種組分中酸類化合物有9種，酯類化合物有9種，多醇類化合物有2種，醛類化合物有2種，烷烴類化合物有3種，烯烴和炔烴類化合物有2種，芳香烴類化合物有6種，苯乙醇苷類化合物有1種，萜類化合物有1種，其他化合物有5種。除此之外檢測到具有藥效成分的5-羥甲基糠醛(5-Hydroxymethylfurfural)、亞麻酸(Linoleic acid ethyl ester)、別香橙烯(Alloaromadendrene)、2-吡啶(2-Fluoropyridine)、3-正十七醇(3-Heptanecanol)、鄰苯二甲酸二壬酯(Dinonyl-phthalate)、原兒茶醛(Protocatechual-dehyde)和(Z)-8,11,12,Trihydroxy-9-ocatdecenoic acid等組分。通過化學文摘社CAS(Chemical Abstracts Service)登錄號查詢化學名稱并結合峰圖出峰時間(圖2)發(fā)現(xiàn)，還檢測到重要藥效成分苯乙醇苷類物質(zhì)毛蕊花糖苷?！吨袊幍洹?015年版規(guī)定名貴中藥材肉蓯蓉中主要藥效成分毛蕊花糖苷的總量不得少于0.3%，而向日葵列當中其含量高達2.470%。

圖2 向日葵列當全組分(A)和毛蕊花糖苷(B)的GC-MS分析

2.3 向日葵列當發(fā)酵用復合菌劑的篩選

由圖3可以看出，經(jīng)復合菌S4-S5、S4-S5-S2、S4-S5-S1、S4-S5-S1-S2發(fā)酵后，毛蕊花糖苷含量分別為441，643，1 074和1 191 μg/mL，以S4-S5-S1、S4-S5-S1-S2復合菌劑破壁發(fā)酵向日葵列當?shù)男Ч麨榧?。與CK相比，S4-S5-S1、S4-S5-S1-S2復合菌劑分別可將毛蕊花糖苷含量提升約2.44倍和2.70倍。組合菌劑S4-S5-S1-S2的效果與組合S4-S5-S1無顯著差異(P>0.05)，但組合S4-S5-S1以3種菌復合而成，成本和培養(yǎng)技術要求較低，因此該組合是向日葵列當破壁發(fā)酵的最優(yōu)選擇。

CK.未用菌處理；EG1.復合菌S4-S5；EG2.復合菌S4-S5-S2；EG3.復合菌S4-S5-S1；EG4.復合菌S4-S5-S1-S2。

2.4 向日葵列當毛蕊花糖苷提取的單因素試驗結果

2.4.1 酵解溫度 如圖4-A所示，隨著發(fā)酵溫度的不斷升高，向日葵列當毛蕊花糖苷提取量呈先上升后逐漸下降的趨勢，在30 ℃左右時達最高，說明酵解溫度過高或過低都會降低提取效率。綜合比較確定向日葵列當破壁發(fā)酵的響應面試驗溫度宜為20～40 ℃。

2.4.2 酵解pH值 由圖4-B可知，向日葵列當中毛蕊花糖苷提取量隨著pH上升而升高， pH為7時達到最高，之后逐漸下降。這是因為在最適pH范圍內(nèi)酶活性最大，酸性過大或堿性過大的環(huán)境都會降低酶活性。故酵解pH值應在6～8。

2.4.3 酵解時間 由圖4-C可以看出，隨著酵解時間的延長，向日葵列當中毛蕊花糖苷提取量逐漸升高，酵解3 d左右達最大值，之后逐漸降低。故確定以酵解2～4 d進行響應面優(yōu)化分析。

圖4 向日葵列當毛蕊花糖苷含量的單因素試驗結果

2.5 向日葵列當毛蕊花糖苷提取工藝的響應面優(yōu)化

2.5.1 響應面試驗結果與回歸方程的建立 在單因素試驗基礎上，利用Design-Expert V8.0.6軟件，以毛蕊花糖苷提取量為響應值(Y)，以酵解溫度(A)、酵解pH值(B)和酵解時間(C)為自變量，進行3因素3水平酵解條件響應面優(yōu)化，結果見表3。對試驗結果進行多元回歸擬合分析，得到毛蕊花糖苷提取量對3因素的二次多項回歸方程為：Y=1 343.6-53.87A+5B+38.38C+1.75AB-25.5AC+10.25BC-96.1A2-21.855B2-48.1C2。對回歸模型進行方差分析，結果見表4。由表4可見，該響應面模型具有顯著性，回歸極顯著(P<0.000 1)，方程相關系數(shù)R2為0.976 7，校正決定系數(shù)Radj=0.949 6，說明該模型與實際結果擬合良好，試驗方法可靠；失擬項不顯著(P=0.122 7)，進一步說明該方程與實際結果擬合較好，可用于向日葵列當毛蕊花糖苷提取的分析與計算；變異系數(shù)(1.35%)低，證明該模型可靠性高。從各項 的F值可以看出，影響向日葵列當毛蕊花糖苷提取量的因素依次為：A>C>B，即酵解溫度>酵解時間>酵解pH值。

表3 向日葵列當毛蕊花糖苷提取工藝的響應面優(yōu)化結果

表4 向日葵列當毛蕊花糖苷提取回歸模型的方差分析

2.5.2 酵解溫度與酵解時間的交互作用 酵解溫度與酵解時間的交互作用對向日葵列當毛蕊花糖苷提取量的影響結果如圖5所示，其等高線圖為橢圓形，說明這兩個因素交互作用對結果的影響顯著；同時，從響應面圖可以看出，毛蕊花糖苷提取量隨酵解溫度上升的幅度比酵解時間稍大，說明酵解溫度對毛蕊花糖苷提取量的影響更強。毛蕊花糖苷提取量最大值出現(xiàn)在酵解溫度25～35 ℃、培養(yǎng)時間2.5～3.5 d時。

圖5 酵解溫度與酵解時間對向日葵列當毛蕊花糖苷提取影響的曲面圖和等高線圖

2.5.3 酵解溫度與酵解pH值的交互作用 酵解溫度與酵解pH值的交互作用對向日葵列當毛蕊花糖苷提取量的影響結果如圖6所示，其等高線圖為橢圓形，說明這兩個因素交互作用對結果的影響顯著；同時，從響應面圖可以看出，毛蕊花糖苷提取量隨酵解溫度上升的幅度比酵解pH大，說明酵解溫度對毛蕊花糖苷提取量的影響更強。毛蕊花糖苷提取量最大值出現(xiàn)在酵解溫度25～35 ℃、酵解pH值6.5～7.5時。

圖6 酵解溫度與酵解pH值對向日葵列當毛蕊花糖苷提取影響的曲面圖和等高線圖

2.5.4 酵解時間與酵解pH值的交互作用 酵解時間與酵解pH的交互作用對向日葵毛蕊花糖苷提取量的影響結果如圖7所示，其等高線圖為橢圓形，說明這兩個因素交互作用對結果的影響顯著；同時，從響應面圖可以看出，毛蕊花糖苷提取量隨酵解時間上升的幅度比酵解pH值稍大，說明酵解時間對向日葵列當毛蕊花糖苷提取量的影響更強。毛蕊花糖苷提取量最大值出現(xiàn)在酵解pH值為6.5～7.5、酵解時間在2.5～3.5 d時。

圖7 酵解時間與酵解pH值對向日葵列當毛蕊花糖苷提取影響的曲面圖和等高線圖

2.5.5 優(yōu)化工藝驗證 由Design-Expert.V8.06 軟件求解回歸方程，得出毛蕊花糖苷提取量最大時的條件為：酵解溫度26.53 ℃，酵解pH值7.22，酵解時間3.52 d，此為復合菌劑對向日葵列當毛蕊花糖苷的最佳提取條件。在此條件下，向日葵列當毛蕊花糖苷提取量預測值為1 383 μg/mL。綜合試驗操作的可行性，調(diào)整提取條件為：酵解溫度 27 ℃，酵解pH值7，酵解時間3.5 d，進行3次重復試驗，向日葵列當毛蕊花糖苷提取量為 1 396 μg/mL，與預測值相差不大，說明此酵解工藝可以有效提高向日葵列當中毛蕊花糖苷的提取量。

2.6 向日葵列當毛蕊花糖苷的抗氧化活性

如圖8所示，向日葵列當毛蕊花糖苷對OH·自由基、DPPH自由基和超氧陰離子的清除能力隨其質(zhì)量濃度的升高而不斷提高，但其均始終顯著低于同質(zhì)量濃度的Vc溶液(P<0.05)。此結果表明，毛蕊花糖苷有明顯的抗氧化活性且呈劑量依賴性。

圖8 向日葵列當毛蕊花糖苷的抗氧化活性

3 討 論

田間雜草是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中管理成本升高、產(chǎn)量和經(jīng)濟效益受抑的主要因素之一，然而某些雜草因具有一定的藥用屬性可以作為中藥資源進行開發(fā)利用。對農(nóng)田雜草型藥用植物的藥效物質(zhì)基礎、炮制方法等開展研究，對于雜草的綜合治理和資源有效利用具有重要意義。

近年來，人們對肉蓯蓉過度采挖的現(xiàn)象頻發(fā)，加之土地沙漠化情況愈發(fā)嚴重，肉蓯蓉幾近滅絕，被列為國家二級保護植物。而向日葵列當中的苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類、多糖類等物質(zhì)與肉蓯蓉的成分十分接近，其中苯乙醇苷類化合物具有抗菌、抗炎、增強記憶、保肝、強心等多種藥理作用[21]，且苯乙醇苷類化合物具安全性、低毒性等特點，在開發(fā)新藥上有重大意義，因此向日葵列當具有較好的開發(fā)利用價值。本研究通過GC-MS技術，從向日葵列當浸提膏中檢測到苯乙醇苷類典型化合物毛蕊花糖苷，其含量高達2.470%，進一步證明了將其開發(fā)為中藥資源的潛力。

為了高效利用向日葵列當，使其細胞中的藥用成分充分釋放，首先要將其堅硬的細胞壁破除。向日葵列當細胞壁主要由木質(zhì)素、纖維素等成分構成，通過微生物發(fā)酵進行破壁處理被認為是簡便有效的方法之一。畢京芳等[22]發(fā)現(xiàn)，在中藥藥渣中接入一定的微生物菌劑后，可以加快啟動木質(zhì)素與纖維素的降解，其降解率分別比對照組提高了40.43%和26.14%。楊杭等[23]從中藥材中分離得到2株高效破壁菌株LSX-9和LSZ-1，破壁試驗結果表明，它們不僅能縮短多糖和三萜的釋放時間，還能提高提取率。本試驗利用產(chǎn)木質(zhì)素酶菌株和產(chǎn)纖維素酶菌株對向日葵列當進行酵解，發(fā)現(xiàn)不同組合的復合菌株對向日葵列當?shù)慕徒庾饔糜兴町悺Ｆ渲蠸4-S5-S1-S2和S4-S5-S1組合的復合菌系對向日葵列當?shù)钠票谀芰^強，因后者是3種菌組成，因此更為適用。本研究結果表明，向日葵列當毛蕊花糖苷提取量的影響因素主次順序是酵解溫度>酵解時間>酵解pH值；酵解破壁的最佳條件為：酵解溫度27 ℃，酵解時間3.5 d，酵解pH值7，在此條件下向日葵列當毛蕊花糖苷提取量為1 396 μg/mL，與理論值相差不大。

陳琳琳等[24]發(fā)現(xiàn)，西南貓尾木顆粒保健茶抗氧化能力可能與毛蕊花糖苷有關。本研究結果表明，向日葵列當毛蕊花糖苷對OH·、DPPH自由基和超氧陰離子的清除能力不同，且抗氧化活性均比同質(zhì)量濃度的Vc弱，但在一定劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的抗氧化性能，說明向日葵列當毛蕊花糖苷具有抑制自由基生成的作用，可以作為自由基清除型抗氧化劑應用。