利用FRET技術(shù)檢測(cè)膜受體與胞外配體相互作用的優(yōu)化策略

馬廷政，曹平平，汪徐春，孫玉潔*

1南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系，2江蘇省人類功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211166

細(xì)胞表面膜受體與其配體相互作用參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、分化等多種生物學(xué)過程，并與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［1-4］。因此，研究膜受體與其胞外配體的相互作用及其動(dòng)態(tài)變化有助于闡明細(xì)胞多種生理過程和病理過程的機(jī)制。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）技術(shù)是研究蛋白質(zhì)相互作用的一種經(jīng)典方法［5-6］，能夠精確檢測(cè)10 nm范圍內(nèi)蛋白間的直接相互作用［7-8］。FRET是指能量從一種受激發(fā)的熒光基團(tuán)轉(zhuǎn)移到另一種熒光基團(tuán)的物理現(xiàn)象。前者稱為供體，后者稱為受體。利用熒光供體融合蛋白表達(dá)載體和熒光受體融合蛋白表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，當(dāng)目的蛋白間發(fā)生相互作用時(shí)，使熒光基團(tuán)間的距離小于10 nm，熒光基團(tuán)將通過偶極子耦合作用實(shí)現(xiàn)能量傳遞，供體熒光蛋白的能量可部分轉(zhuǎn)移到受體熒光蛋白，使受體被激發(fā)而發(fā)射熒光。在生物體內(nèi)，如兩個(gè)蛋白質(zhì)分子的距離在10 nm之內(nèi)，一般認(rèn)為這兩個(gè)蛋白質(zhì)分子存在直接相互作用。因此，通過檢測(cè)供體和受體熒光強(qiáng)度的變化可觀察兩種目標(biāo)蛋白在活細(xì)胞中的相互作用及變化。FRET 技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程為，蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)分析、FRET標(biāo)記策略的選擇、熒光對(duì)的選擇、FRET 效率評(píng)估、儀器選擇，最后進(jìn)行FRET 實(shí)驗(yàn)的實(shí)施［9］。但是，應(yīng)用FRET 技術(shù)研究膜受體與胞外配體的相互作用時(shí)存在較多限制因素，其中主要包括膜受體結(jié)構(gòu)對(duì)熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率的影響、熒光標(biāo)簽對(duì)膜受體的亞細(xì)胞定位及功能的影響、細(xì)胞切除成熟膜受體信號(hào)肽時(shí)標(biāo)記在信號(hào)肽氨基端的熒光標(biāo)簽會(huì)被一同切除等。LRP6 是WNT3A 的經(jīng)典共受體［10］，根據(jù)其蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)相互作用模型，WNT3A 蛋白與LRP6 的氨基端都是開放末端，能夠使用熒光蛋白進(jìn)行標(biāo)記，適用于FRET 技術(shù)檢測(cè)。本研究以LRP6 膜受體與WNT3A 相互作用為模型，針對(duì)上述限制因素，通過蛋白截短、調(diào)整熒光標(biāo)簽和信號(hào)肽的相對(duì)位置及增添柔性鏈接肽等方法，有效提高了FRET 的檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性，為利用FRET技術(shù)研究膜受體與胞外配體相互作用提供了新的思路和策略。

1 材料和方法

1.1 材料

FV1200 激光掃描共焦顯微鏡系統(tǒng)（Olympus 公司，日本）；DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基（Invitrogen Life Tech?nologies 公司，美國(guó)）；Lipofectamine 3000 試劑盒（In?vitrogen Life Technologies 公司，美國(guó)）；胎牛血清（Gibco 公司，美國(guó)）；anti?GFP 抗體（Thermofisher 公司，美國(guó)）；3.5 cm 玻璃皿（上海WHB 生物技術(shù)有限公司）；胰蛋白酶（Sigma Chemical 公司，美國(guó)）；青霉素/鏈霉素（上海生工生物公司）；質(zhì)粒小提試劑盒（AXYGEN 公司，美國(guó)）；PCR 試劑（TaKaRa 公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人腎上皮細(xì)胞系293T 所用培養(yǎng)液為DMEM 培養(yǎng)基，并添加10%的胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素。該細(xì)胞傳代比例為1∶4，在CO2濃度5%、溫度37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建

將WNT3A 和LRP6 的蛋白編碼區(qū)（coding se?quence，CDS）序列分別克隆到pEYFP?C1 或pECFP?C1 載體中，構(gòu)建ECFP?LRP6 和EYFP?WNT3A 融合蛋白質(zhì)粒。SP?EYFP?WNT3A 質(zhì)粒是以pCDNA3.1為質(zhì)粒骨架，將EYFP熒光標(biāo)簽插入WNT3A蛋白的信號(hào)肽和成熟蛋白之間。SP?ECFP?LRP6 質(zhì)粒是以pCDNA3.1 為質(zhì)粒骨架，將ECFP 熒光標(biāo)簽插入LRP6蛋白的信號(hào)肽和成熟蛋白之間（由于FRET 檢測(cè)要求熒光標(biāo)簽間距離在10 nm范圍內(nèi)。而LRP6成熟蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域?yàn)楣靼艚Y(jié)構(gòu)，其長(zhǎng)度＞20 nm，超出FRET實(shí)驗(yàn)檢測(cè)范圍。因此，將LRP6成熟蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的P1P2 結(jié)構(gòu)域進(jìn)行截短，保留LRP6 與WNT3A相互作用的P3P4結(jié)構(gòu)域。所有引物序列見表1。所有質(zhì)粒均經(jīng)測(cè)序確認(rèn)（上海生工及安徽通用測(cè)序公司）。

表1 FRET實(shí)驗(yàn)中使用的引物Table 1 Primers used in FRET assays

1.2.3 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)接與分析

在PDB 數(shù)據(jù)庫（https：//www1.rcsb.org/）中獲取LRP6（PDB ID：3S8Z）及WNT3A（PDB ID：7DRT）蛋白的晶體結(jié)構(gòu)文件，下載pdb 格式的蛋白模型數(shù)據(jù)，用Pymol 軟件打開進(jìn)行后續(xù)分析。將需要對(duì)接的兩個(gè)蛋白pdb 格式文件添加到Zdock 網(wǎng)站（https：//zdock.umassmed.edu/）中，經(jīng)對(duì)接后可下載蛋白復(fù)合物模型文件。在Pymol 軟件（https：//pymol.org/2/）中打開對(duì)接模型文件，分析觀察目的蛋白的氨基端與羧基端是否暴露，能否在不影響蛋白質(zhì)相互作用的前提下進(jìn)行熒光標(biāo)簽的標(biāo)記。

1.2.4 FRET實(shí)驗(yàn)

根據(jù)激光共聚焦顯微鏡（FV1200激光掃描共焦顯微鏡，奧林巴斯公司，日本）FRET 實(shí)驗(yàn)手冊(cè)進(jìn)行了FRET實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)與實(shí)施。使用敏化熒光發(fā)射方法進(jìn)行FRET 分析。FRET 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞接種在玻璃底培養(yǎng)皿（上海WHB 生物技術(shù)有限公司）。質(zhì)粒通過Lipofectamine 3000（Invitrogen 公司，美國(guó)）以50%～70%細(xì)胞匯合率轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞24 h 后進(jìn)行FRET 分析。根據(jù)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)調(diào)整相關(guān)的儀器配置，包括激光功率10%、HV 550 V、電壓放大倍數(shù)×1、背景補(bǔ)償0%、圖像采集速度2.0 μs/pixel，并使用1 024×1 024的圖像格式。ECFP 通道由440 nm 激光器激發(fā)，圖像采集使用濾波器（SMD510：480/20）。EYFP 通道由488 nm 激光器激發(fā)，圖像采集使用Mirror：565/50。獲取所有圖像后，使用FV10?ASW軟件（奧林巴斯公司，日本）中的敏化熒光發(fā)射窗口進(jìn)行FRET效率及供受體距離的計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用FV10?ASW 4.0 軟件進(jìn)行FRET 效率及供受體距離的統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算。采用Graphpad 8.0 軟件（https：//www.graphpad.com/）進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和分析，定量結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（）。

2 結(jié)果

2.1 LRP6與WNT3A蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

LRP6膜受體的胞外區(qū)由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，依次為P1P2 結(jié)構(gòu)域（PDB ID：5GJE），可結(jié)合WNT1、WNT2、WNT6等配體；P3P4結(jié)構(gòu)域（PDB ID：3S8Z），可結(jié)合WNT3、WNT3A、DKK1 等配體；LA 結(jié)構(gòu)域（細(xì)胞膜錨定結(jié)構(gòu)域）。利用PDB 網(wǎng)站獲取蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，并使用Zdock 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白對(duì)接模型預(yù)測(cè)顯示，LRP6 的P3P4 結(jié)構(gòu)域（PDB ID：3S8Z）與WNT3A（PDB ID：7DRT）的鉸鏈區(qū)結(jié)合（圖1A），并且LRP6 與WNT3A 的氨基端和羧基端都是處于蛋白質(zhì)外圍開放末端，能夠連接熒光標(biāo)簽進(jìn)行FRET實(shí)驗(yàn)。LRP6胞外結(jié)構(gòu)域?yàn)楣靼魻罱Y(jié)構(gòu)，全長(zhǎng)＞20 nm，超出常規(guī)FRET技術(shù)10 nm檢測(cè)范圍。因此對(duì)LRP6胞外區(qū)進(jìn)行了截短，將LRP6的P1P2結(jié)構(gòu)域截除，保留LRP6的P3P4結(jié)構(gòu)域（LRP6與WNT3A結(jié)合區(qū)域）與LA結(jié)構(gòu)域。

2.2 FRET熒光融合蛋白的構(gòu)建與優(yōu)化

使用經(jīng)典FRET熒光對(duì)ECFP與EYFP作為熒光供受體，分別融合在LRP6 或者WNT3A 蛋白的N 端（圖1B）。當(dāng)兩個(gè)目的蛋白不存在直接相互作用時(shí)，使用440 nm 激發(fā)光激發(fā)ECFP 熒光標(biāo)簽時(shí)不發(fā)生FRET，只能使ECFP發(fā)出自身476 nm熒光，EYFP不發(fā)光；而當(dāng)2 個(gè)目的蛋白存在直接相互作用時(shí)，如LRP6 與WNT3A 相互作用，ECFP 與EYFP 之間的距離≤10 nm而發(fā)生FRET現(xiàn)象，即440 nm激發(fā)光激發(fā)ECFP 后，通過FRET 可檢測(cè)到EYFP 熒光標(biāo)簽發(fā)出的527 nm峰熒光（圖1A）。

圖1 LRP6與WNT3A蛋白相互作用的FRET模式圖Figure 1 A diagram FRET pattern of LRP6 and WNT3A interaction

依據(jù)PDB與Zdock網(wǎng)站對(duì)WNT3A與LRP6的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，將構(gòu)建FRET 熒光融合蛋白熒光標(biāo)簽ECFP及EYFP熒光標(biāo)簽分別融合在LRP6或者WNT3A的氨基端（圖2A，上圖），利用融合蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24 h后進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)LRP6 細(xì)胞膜定位不清晰（圖2B，上圖）。但是，使用pCDNA3.1 作為載體，將ECFP 熒光標(biāo)簽融合在LRP6 蛋白的信號(hào)肽與成熟蛋白之間，并使用柔性連接肽進(jìn)行連接可減少對(duì)成熟蛋白結(jié)構(gòu)與功能的影響（圖2A，下圖）。轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞24 h 后進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，LRP6細(xì)胞膜定位較為明顯（圖2B，下圖白色箭頭指示膜定位）。

圖2 FRET熒光融合蛋白質(zhì)粒的構(gòu)建Figure 2 Construction of FRET fluorescent fusion protein

2.3 FRET 技術(shù)檢測(cè)活細(xì)胞中LRP6 膜受體與WNT3A的相互作用

使用SP?ECFP?LRP6 及SP?EYFP?WNT3A 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，24 h 后進(jìn)行FRET 實(shí)驗(yàn)并計(jì)算FRET效率及FRET距離（圖3）。LRP6?ECFP通道顯示LRP6 膜定位較為明顯；WNT3A?EYFP 通道顯示W(wǎng)NT3A 與LRP6 相互作用后細(xì)胞膜定位也較為顯著；經(jīng)背景校正計(jì)算后的FRET（校正）通道顯示在細(xì)胞膜上LRP6 與WNT3A 有FRET 現(xiàn)象發(fā)生；敏化熒光發(fā)射FRET計(jì)算得到FRET效率圖像（FRET Ef?ficiency）及供受體距離圖像（D?A Distance）。紅色箭頭所指細(xì)胞膜區(qū)域LRP6 及WNT3A 細(xì)胞膜定位較為明顯。對(duì)細(xì)胞膜區(qū)域發(fā)生FRET 現(xiàn)象的細(xì)胞（n=25）進(jìn)行FRET 效率及距離統(tǒng)計(jì)分析，LRP6 與WNT3A平均FRET效率為26.51%，平均供受體距離為7.17 nm，處于FRET 效率（8%～95%）及供受體距離（3～8 nm）的有效區(qū)域。該結(jié)果顯示，通過FRET優(yōu)化策略，在細(xì)胞膜上定量檢測(cè)到LRP6 膜受體與WNT3A的相互作用。

圖3 FRET技術(shù)檢測(cè)WNT3A與LRP6蛋白間的相互作用Figure 3 The interaction between WNT3A and LRP6 protein detected by FRET assays

3 討論

FRET 技術(shù)是研究活細(xì)胞中蛋白質(zhì)相互作用及動(dòng)態(tài)變化的有效手段，為闡明細(xì)胞生理過程和病理過程的機(jī)制提供了重要幫助。然而，F(xiàn)RET 技術(shù)用于檢測(cè)膜受體與胞外配體相互作用及動(dòng)態(tài)變化時(shí)，存在諸多限制因素。首先，經(jīng)典FRET 技術(shù)檢測(cè)距離要求FRET熒光對(duì)的距離在10 nm以內(nèi)。但是，部分膜受體家族成員的胞外段較長(zhǎng)，當(dāng)受體與其配體在三維結(jié)構(gòu)空間上發(fā)生相互作用時(shí)，胞外端和配體熒光對(duì)的距離大于10 nm（如LRP6 及其配體WNT3A［11］、TNFRSF6B 及其配體TNFSF14［12］等），超出FRET 檢測(cè)范圍，因而不能利用FRET 技術(shù)有效檢測(cè)這一類膜受體和配體間的相互作用。本文針對(duì)這一制約因素，以經(jīng)典的LRP6與其配體WNT3A相互作用模型為基礎(chǔ)，提供了一個(gè)可能的解決策略。LRP6胞外域全長(zhǎng)約為25 nm，當(dāng)LRP6與WNT3A相互作用時(shí)，LRP6 的氨基端與WNT3A 之間的距離約為15 nm。本研究依據(jù)LRP6 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)特征，即其胞外域結(jié)構(gòu)為串珠狀具有柔性［13］這一特點(diǎn)，將LRP6 膜受體進(jìn)行截短，截掉P1P2結(jié)構(gòu)域，保留其與WNT3A相互作用的P3P4 結(jié)構(gòu)域。由于結(jié)構(gòu)域之間為柔性連接，截短不影響膜受體與配體的相互作用，同時(shí)滿足了FRET 技術(shù)檢測(cè)要求。對(duì)膜蛋白進(jìn)行截短時(shí)，首先要確定截短對(duì)膜蛋白的結(jié)構(gòu)與相互作用不會(huì)造成影響。該策略適合檢測(cè)細(xì)胞外有多個(gè)結(jié)構(gòu)域的膜受體（如：TNFRSF、LRP 等家族蛋白）與其配體的相互作用；且特別適用于檢測(cè)有明確相互作用但需要進(jìn)一步在活細(xì)胞水平觀察其相互作用動(dòng)態(tài)變化的配體和受體。

其次，膜受體與胞外配體的亞細(xì)胞定位由信號(hào)肽進(jìn)行引導(dǎo)，且成熟蛋白的信號(hào)肽會(huì)被切除［14］，導(dǎo)致標(biāo)記在信號(hào)肽氨基端的熒光標(biāo)簽被一同切除。因此，信號(hào)肽位置的調(diào)整在膜受體與胞外配體相互作用的檢測(cè)中非常必要，不僅可避免熒光標(biāo)簽被切割，也能夠顯著增強(qiáng)融合蛋白的膜定位信號(hào)。本文通過將信號(hào)肽重構(gòu)在熒光標(biāo)簽的氨基末端，可避免熒光標(biāo)簽的切除。該信號(hào)肽重構(gòu)策略普遍適用于FRET質(zhì)粒的構(gòu)建，可避免熒光標(biāo)簽的丟失，增強(qiáng)信號(hào)肽的亞細(xì)胞定位功能。但是，不同膜受體的信號(hào)肽功能多樣［15］，信號(hào)肽重構(gòu)對(duì)于不同膜受體家族的亞細(xì)胞定位作用仍需進(jìn)一步研究。

最后，熒光標(biāo)簽對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能具有一定干擾效應(yīng)，可影響膜受體與胞外配體的亞細(xì)胞定位以及蛋白間相互作用。柔性連接肽在抗體、標(biāo)簽融合蛋白純化等領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用［14］，用于減弱融合蛋白內(nèi)不同結(jié)構(gòu)域之間的相互影響。與柔性連接肽相比，剛性連接肽可顯著降低FRET效率，并且FRET 效率隨著剛性連接肽長(zhǎng)度的增加而降低［16］。并且，柔性連接肽已應(yīng)用于生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（bioluminescence resonance energy transfer，BRET）實(shí)驗(yàn)，用來銜接熒光標(biāo)簽與目的蛋白，可減弱熒光標(biāo)簽對(duì)融合蛋白結(jié)構(gòu)與功能的影響［17-18］。基于以上研究，本文采用柔性連接肽來銜接信號(hào)肽、熒光標(biāo)簽及成熟蛋白，以降低熒光標(biāo)簽對(duì)FRET 體系的影響。柔性連接肽策略同樣適用于其他FRET熒光質(zhì)粒的構(gòu)建，但也有其局限性，與剛性連接肽相比，不能有效分隔融合蛋白的不同結(jié)構(gòu)域，因此不適用于胞外配體與多結(jié)構(gòu)域膜受體相互作用位點(diǎn)的分析。

綜上所述，本文以LRP6 膜蛋白與WNT3A 相互作用為模型，針對(duì)FRET 技術(shù)在研究膜受體與胞外配體相互作用中的限制因素，建立了有效的改進(jìn)策略，包括膜受體截短、信號(hào)肽的改造及柔性連接肽的使用，為充分利用FRET 技術(shù)在活細(xì)胞水平研究膜受體與胞外配體相互作用的動(dòng)態(tài)變化提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)方案。