益生菌復(fù)合制劑對(duì)頭孢曲松鈉作用小鼠的抗氧化指標(biāo)、細(xì)胞因子及腸道菌群的影響

郭子晨，劉 倩，王韻婷，王 涵，趙江燕，趙雅欣，孫雅煊，戴雪伶,

（1.北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 101500；2.北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院保健食品檢測中心，北京 100191）

腸道是人體吸收營養(yǎng)、排出代謝廢物的器官，對(duì)人體營養(yǎng)、代謝、免疫起著重要作用[1]。在人類腸道中生活著約500 種細(xì)菌，數(shù)量多達(dá)100 億。這些細(xì)菌構(gòu)成了一個(gè)龐大復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，與宿主共同維持著腸道微生態(tài)的穩(wěn)定，保護(hù)著人體健康[2?3]。正常情況下腸道菌群處于平衡狀態(tài)，然而在服用抗生素等不利條件影響下，腸道微生態(tài)平衡被打破，有害菌大量繁殖，引發(fā)炎癥性腸病[4?6]。

益生菌是一類主要寄生于腸道中的有益活性微生物，通過改善宿主腸道微生態(tài)平衡來發(fā)揮作用，如調(diào)節(jié)腸道pH、促進(jìn)有益菌繁殖、促進(jìn)腸道營養(yǎng)物質(zhì)吸收等作用[7]。長雙歧桿菌BB536（Bifidobacterium longumsubsp.longumBB536）屬于革蘭氏陽性菌，由日本科學(xué)家從健康嬰兒的腸道中分離得到，可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群、改善腸道微環(huán)境、提高機(jī)體免疫，來促進(jìn)人體健康[8?10]。乳雙歧桿菌HN019（Bifidobacterium animalissubsp.lactisHN019）是一種從酸奶中分離得到的革蘭氏陽性菌，具有促進(jìn)腸道蠕動(dòng)、排便、調(diào)節(jié)免疫等功效，已被廣泛應(yīng)用于嬰幼兒食品中[11?14]。不同菌株效果各異，目前市場上的益生菌保健食品主要以多種益生菌組成的益生菌復(fù)合制劑為主[15?16]。

抗生素主要用于治療各種感染類疾病，若長期服用則會(huì)導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，導(dǎo)致功能紊亂，甚至還會(huì)對(duì)肝臟等器官造成損害。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，通過使用益生菌來減輕抗生素帶來的副作用已受到廣泛關(guān)注，臨床上常用的益生菌主要以各類雙歧桿菌和乳桿菌為主，但如何根據(jù)不同癥狀選擇合適的益生菌以及劑量問題還有待進(jìn)一步研究[17?18]。頭孢曲松鈉屬于第三代頭孢類抗生素，對(duì)革蘭氏陽性菌以及革蘭氏陰性菌均有一定的抑制作用。長雙歧桿菌BB536 與乳雙歧桿菌HN019 是兩種對(duì)機(jī)體有益的菌株，適用于改善腸道健康，目前已被廣泛使用，但關(guān)于該菌株在改善由抗生素造成的損害方面尚未報(bào)道，因此本研究通過灌胃小鼠頭孢曲松鈉建立腸道菌群失調(diào)模型小鼠，探究由長雙歧桿菌BB536 和乳雙歧桿菌HN019 組成的益生菌復(fù)合制劑對(duì)其的改善效果，以期為益生菌復(fù)合制劑在保健食品中的開發(fā)應(yīng)用提供更多數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

頭孢曲松鈉 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；益生菌混合粉（主要原料為長雙歧桿菌BB536 2.5×109CFU/g、乳雙歧桿菌HN019 2.5×109CFU/g）湯臣倍健有限公司；EMB 瓊脂培養(yǎng)基、腸球菌瓊脂培養(yǎng)基、LBS 瓊脂培養(yǎng)基、BBL 瓊脂培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；IL-2、IL-6、IL-1β、TNFα試劑盒 武漢華美生物工程有限公司；MDA、T-SOD、GSH、GSH-PX 試劑盒 南京建成生物科技有限公司；Qiagen Gel Extraction Kit 試劑盒 德國Qiagen公司；Gene JETTM Gel Extraction Kit 試劑盒 賽默飛世爾科技有限公司；TruSeq?DNA PCR-Free 試劑盒 美國Illumina 公司；60 只4 周齡SPF 級(jí)BALB/c小鼠，體重（20±2）g 購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008，小鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度（22±2）℃，濕度50%～60%，每日光照和黑暗各12 h。

GI54DW 高壓滅菌鍋 美國Zealway 公司；5425R臺(tái)式離心機(jī) 德國艾本德公司；DHG-9003 鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；Large Direct-Pure EDI純水系統(tǒng) 上海樂楓生物科技有限公司；NU-9483E超低溫冰箱 美國Nuaire 公司；MS3 漩渦混合器德國IKA 公司；V-1600 可見分光光度計(jì) 上海美普達(dá)儀器有限公司；HHW21.420D 恒溫水箱 天津泰斯特儀器有限公司；Infinite M200 Pro 多功能酶標(biāo)儀上海安景科技有限公司；ZDP-9082 恒溫培養(yǎng)箱上海喆圖科學(xué)儀器有限公司；Qubit@2.0 熒光儀 賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與給藥 60 只雄性BALB/c 小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，隨機(jī)選取48 只小鼠，構(gòu)造腸道菌群失調(diào)模型小鼠，參照李貞貞等[19]、蔣豐嶺等[20]和于海寧等[21]的實(shí)驗(yàn)方法并加以改進(jìn)：連續(xù)灌胃5 d 頭孢曲松鈉（2 mg/g），之后隨機(jī)分為模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組12 只。益生菌復(fù)合制劑灌胃劑量依據(jù)臨床人體用量進(jìn)行計(jì)算，成人益生菌粉的推薦劑量為1 g/d，參考《保健食品功能評(píng)價(jià)方法》，以人體推薦劑量的5、10、30 倍作為本實(shí)驗(yàn)的低、中、高劑量，根據(jù)益生菌混合粉的活菌數(shù)計(jì)算出灌胃小鼠的低、中、高劑量分別為2×105CFU/g、4×105CFU/g、1.2×106CFU/g，各劑量組中的BB536 和HN019 活菌數(shù)比值為1:1。另設(shè)正常鼠為對(duì)照組，對(duì)照組和模型組灌胃生理鹽水，各劑量組灌胃對(duì)應(yīng)劑量的益生菌復(fù)合制劑30 d，每只0.2 mL/d。每天測量小鼠體重和攝食情況并記錄，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后所有小鼠摘眼球取血后脫頸處死，解剖并取出心、肝、脾、肺、腎、胸腺，計(jì)算臟器系數(shù)并保留空腸和肝臟。本實(shí)驗(yàn)方案由北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院保健食品功能檢測中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理委員會(huì)意見書編號(hào)：2021-04）。

1.2.2 益生菌復(fù)合制劑對(duì)小鼠細(xì)胞因子的影響 小鼠血液置于1.5 mL 離心管中，4000 r/min 離心10 min，保留血清待測。血清中白介素2（IL-2）、白介素6（IL-6）、白介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNFα）均采用ELISA 進(jìn)行測定，詳細(xì)步驟嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 益生菌復(fù)合制劑對(duì)小鼠抗氧化活性物質(zhì)的影響 用勻漿器12000 r/min 上下研磨制成組織勻漿，肝臟和空腸中的超氧化物歧化酶（T-SOD）測定采用1%濃度進(jìn)行測定，丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）采用10%濃度進(jìn)行測定，后續(xù)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 腸道菌群計(jì)數(shù) 在灌胃5 d 頭孢曲松鈉后以及灌胃30 d 益生菌復(fù)合制劑后，無菌收集所有小鼠糞便數(shù)粒后，加入稀釋液充分振蕩混勻，依10 倍系列稀釋至10?8，腸桿菌選擇EMB 瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h；腸球菌和乳桿菌分別選擇腸球菌瓊脂培養(yǎng)基和LBS 瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h；雙歧桿菌選擇BBL 瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束后計(jì)算出每克濕便中的菌落數(shù)（lg CFU/g）。

1.2.5 腸道菌群結(jié)構(gòu)測序 灌胃30 d 后，每組選取6 只，無菌收集小鼠糞便進(jìn)行DNA 提取，通過PCR技術(shù)對(duì)16S rDNA V3-V4 區(qū)域擴(kuò)增，區(qū)域引物為：5’-3’CCTAYGGGRBGCASCAG，3’-5’GGACTACNNG GGTATCTAAT，構(gòu)建文庫，通過Illumina NovaSeq測序平臺(tái)對(duì)該文庫進(jìn)行雙末端測序，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾后進(jìn)行OTUs 聚類和物種分類分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過Excel 預(yù)處理后，應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性分析，攝食和體重采用單因素ANOVA 分析，腸道菌群計(jì)數(shù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，所有數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P<0.05 表示有顯著差異，P<0.01 表示有極顯著差異，P>0.05 表示無顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌復(fù)合制劑對(duì)小鼠體重和攝食的影響

由圖1 可知，灌胃頭孢曲松鈉后，小鼠體重和攝食量呈下降趨勢，表明頭孢曲松鈉對(duì)小鼠的體重和攝食有較大影響。模型組與其余四組相比，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中攝食和體重都處于較低水平，在灌胃不同劑量益生菌復(fù)合制劑后小鼠攝食和體重情況均有一定改善，并逐漸恢復(fù)至正常水平，其中高劑量組恢復(fù)效果較為明顯，說明益生菌復(fù)合制劑改善了小鼠腸道紊亂狀態(tài)，促進(jìn)腸道健康。

圖1 益生菌制劑對(duì)小鼠攝食（A）和體重（B）的影響Fig.1 Effect of probiotic preparation on food intake （A） and body weight （B） of mice

2.2 益生菌復(fù)合制劑對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響

由表1 可以，模型組以及各劑量組與對(duì)照組相比，全部臟器系數(shù)均無顯著差異（P>0.05），表明灌胃頭孢曲松鈉以及益生菌復(fù)合制劑對(duì)各臟器無影響。

表1 小鼠各器官臟器系數(shù)（mg/g,±s,n=12）Table 1 Coefficients of various organs in mice (mg/g,± s,n=12)

表1 小鼠各器官臟器系數(shù)（mg/g,±s,n=12）Table 1 Coefficients of various organs in mice (mg/g,± s,n=12)

2.3 益生菌復(fù)合制劑對(duì)小鼠血清中細(xì)胞因子的影響

大量研究表明，部分益生菌除了可以調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，促進(jìn)腸道健康外，還有一定的抗炎能力[22?23]。IL-2、IL-6、IL-1β、TNF-α是與腸道疾病關(guān)系密切的促炎細(xì)胞因子，是機(jī)體炎癥反應(yīng)中的重要炎癥介質(zhì)[24?25]。由表2 可知，模型組與對(duì)照組相比IL-2 水平極顯著提高（P<0.01），IL-6 和TNF-α水平顯著提高（P<0.05）。灌胃益生菌復(fù)合制劑后，低劑量組與模型組相比，IL-2 水平顯著降低（P<0.05）；中劑量組與模型組相比，IL-2、TNF-α、IL-6 水平顯著降低（P<0.05）；高劑量組與模型組相比，IL-6 和IL-1β水平顯著降低（P<0.05），IL-2 水平和TNF-α水平極顯著降低（P<0.01）。上述結(jié)果表明，灌胃頭孢曲松鈉使IL-2、TNF-α、IL-1β、IL-6 水平提高，但在益生菌復(fù)合制劑的幫助下有所改善，說明益生菌復(fù)合制劑減輕了由抗生素引起的炎癥，對(duì)緩解炎癥有著重要幫助。

表2 小鼠血清中各細(xì)胞因子的含量（±s,n=12）Table 2 The content of each cytokine in mouse serum (± s,n=12)

表2 小鼠血清中各細(xì)胞因子的含量（±s,n=12）Table 2 The content of each cytokine in mouse serum (± s,n=12)

注：*：與模型組相比P<0.05；**：與模型組相比P<0.01；#：與對(duì)照組相比P<0.05；##：與對(duì)照組比P<0.01；表3同。

2.4 益生菌復(fù)合制劑對(duì)小鼠肝臟抗氧化活性物質(zhì)的影響

腸道和肝臟作為機(jī)體重要的代謝器官，除了參與各類化合物的分解和代謝外，在維持機(jī)體氧化還原平衡中起到重要作用[26?27]。正常情況下，機(jī)體的氧化與還原能力處于穩(wěn)態(tài)，當(dāng)機(jī)體在受到外界刺激后，引發(fā)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致氧化損傷?？漳c是機(jī)體消化物質(zhì)和吸收營養(yǎng)的重要部位，其代謝水平與健康密切相關(guān)。MDA 是膜脂過氧化所形成的產(chǎn)物，具有一定的細(xì)胞毒性，會(huì)改變細(xì)胞膜的通透性。SOD 是一種廣泛存在于生物體中的活性物質(zhì)，在清除機(jī)體內(nèi)的氧自由基方面具有重要作用。GSH 是一種由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽化合物，是機(jī)體中最重要的抗氧化劑[28]。GSH-Px 是機(jī)體抗氧化能力的指標(biāo)之一，可以減輕過氧化物對(duì)機(jī)體的損傷，維持細(xì)胞膜的正常功能。

結(jié)果由表3 可知，在空腸中，模型組與對(duì)照組相比，MDA 水平顯著提高（P<0.05），T-SOD 水平顯著降低（P<0.05）；低劑量組與模型組相比，MDA 水平極顯著降低（P<0.01），GSH-PX 水平顯著提高（P<0.05）；中劑量組和高劑量組與模型組相比，MDA 水平極顯著降低（P<0.01），GSH 水平顯著提高（P<0.05），GSH-PX 水平極顯著提高（P<0.01），并且高劑量組T-SOD 水平與模型組相比也顯著提高（P<0.05）。在肝臟中，中劑量組和高劑量組與模型組相比，T-SOD 水平顯著提高（P<0.05），GSH-PX 水平顯著提高（P<0.05），并且高劑量組MDA 水平與模型組相比還顯著降低（P<0.05）。此次實(shí)驗(yàn)表明，在頭孢曲松鈉的作用下，激發(fā)了機(jī)體氧化應(yīng)激，使空腸和肝臟的抗氧化功能受到損害，在灌胃益生菌復(fù)合制劑后可以顯著促進(jìn)抗氧化物質(zhì)的產(chǎn)生，并且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴效應(yīng)。此外，肝臟具有解毒作用，機(jī)體產(chǎn)生的毒素都是通過肝臟來進(jìn)行清除，各劑量組與模型組相比，肝臟中的MDA 水平呈下降趨勢，說明益生菌復(fù)合制劑對(duì)肝臟具有一定的保護(hù)作用。

表3 小鼠空腸和肝臟中抗氧化指標(biāo)Table 3 Antioxidant indexes in the jejunum and liver of mice

2.5 益生菌復(fù)合制劑對(duì)腸道菌群影響

腸道菌群計(jì)數(shù)結(jié)果顯示（表4），第0 d（頭孢曲松鈉造模后，益生菌復(fù)合制劑灌胃前），模型組以及各劑量組與對(duì)照組相比，腸桿菌、腸球菌、乳桿菌和雙歧桿菌數(shù)量均極顯著降低（P<0.01），表明通過灌胃頭孢曲松鈉成功構(gòu)造小鼠腸道菌群失調(diào)模型。模型組第30 d 與第0 d 數(shù)據(jù)相比，腸桿菌和腸球菌數(shù)量極顯著提高（P<0.01），且高于同時(shí)期的對(duì)照組，乳桿菌和雙歧桿菌數(shù)量極顯著提高（P<0.01），但仍低于同時(shí)期的對(duì)照組，說明小鼠自身具有一定的恢復(fù)能力，但在缺少益生菌復(fù)合制劑的幫助下無法恢復(fù)至正常水平。灌胃30 d 益生菌復(fù)合制劑后，低劑量組與模型組相比，腸桿菌數(shù)量極顯著降低（P<0.01），腸球菌數(shù)量顯著降低（P<0.05）；中劑量組與模型組相比，腸桿菌數(shù)量顯著降低（P<0.05）；高劑量組與模型組相比，腸桿菌數(shù)量顯著降低（P<0.05），乳桿菌數(shù)量極顯著提高（P<0.01），雙歧桿菌數(shù)量顯著提高（P<0.05）。此外，在各劑量組中，與灌胃前益生菌復(fù)合制劑自身相比，灌胃益生菌復(fù)合制劑后腸桿菌、腸球菌、乳桿菌和雙歧桿菌數(shù)量均極顯著提高（P<0.01）。

表4 第0 d 和30 d 糞便腸道菌群計(jì)數(shù)（lg CFU/g）Table 4 Count of fecal intestinal flora at 0 d and 30 d (lg CFU/g)

腸道菌群計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，在灌胃30 d 益生菌復(fù)合制劑后，各劑量組與模型組相比，腸桿菌和腸球菌數(shù)量均有不同程度降低，但仍高于對(duì)照組，乳桿菌和雙歧桿菌數(shù)量均呈上升趨勢，且與對(duì)照組相當(dāng)，表明益生菌復(fù)合制劑對(duì)小鼠腸道菌群失調(diào)具有顯著調(diào)節(jié)作用。腸球菌和腸桿菌廣泛存在于機(jī)體腸道中，正常情況下與機(jī)體互利共生，不會(huì)對(duì)機(jī)體造成影響，然而當(dāng)機(jī)體免疫力等條件下時(shí)，則會(huì)引起腹瀉、腸炎等疾病[29?30]。雙歧桿菌和乳桿菌是人腸道菌群中重要成員，具有良好的抗炎和抗氧化活性，可以通過抑制有害菌的生長來改善腸道菌群以及調(diào)節(jié)代謝[31?33]。上述結(jié)果顯示，灌胃益生菌復(fù)合制劑后，抑制了腸桿菌和腸球菌的生長，同時(shí)促進(jìn)了乳桿菌和雙歧桿菌的繁殖，說明益生菌復(fù)合制劑的抗炎和抗氧化功效可能與乳桿菌和雙歧桿菌有關(guān)。

各組稀釋曲線（圖2）結(jié)果顯示，稀釋曲線快速升高后逐漸趨于平坦，說明樣本的測序數(shù)據(jù)量充足，可以準(zhǔn)確反映樣本的菌群特征。對(duì)各組微生物進(jìn)行了研究，結(jié)果表明在門水平（圖3）各實(shí)驗(yàn)組主要優(yōu)勢菌包括擬桿菌門（Bacteroidota）和厚壁菌門（Firmicutes），與對(duì)照組相比，在抗生素造損的各組中疣微菌門（Verrucomicrobiota）豐度有所上升、unidentified_Bacteria 豐度有所下降。各劑量組與模型組相比疣微菌門（Verrucomicrobiota）豐度有所恢復(fù)。

圖2 稀釋曲線Fig.2 Dilution curve

圖3 腸道菌群門水平豐富度Fig.3 Abundance of intestinal flora at portal level

在屬水平（圖4），各實(shí)驗(yàn)組主要優(yōu)勢群包括艾克曼菌屬（Akkermansia）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、普雷沃氏菌屬（Prevotellaceae_UCG_001）、毛螺旋菌（Lachnospiraceae_NK4A136_group）。對(duì)組間差異物種（圖5）進(jìn)行分析，結(jié)果表明模型組與對(duì)照組相比，Aerococcus、Candidatus_Saccharimonas、理研菌屬（Rikenella）顯著降低（P<0.05），艾克曼菌屬（Akkermansia）顯著升高（P<0.05），毛螺旋菌（Lchnospiraceae_NK4A136_group）極顯著降低（P<0.01）。低劑量組與模型組相比，副桿菌屬（Parabacteroides）極顯著提高（P<0.01）。中劑量組與模型組相比，乳球菌屬（Lactococcus）極顯著提高（P<0.01），雙歧桿菌（Bifidobacterium）和鼠尾草菌（Muribaculum）顯著提高（P<0.05）。高劑量組與模型組相比，擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）顯著提高（P<0.05），副桿菌屬（Parabacteroides）、普雷沃氏菌屬（Prevotellaceae_UCG_001）極顯著提高（P<0.01），單球菌（Monoglobus）顯著降低（P<0.05）。

圖4 腸道菌群屬水平豐富度Fig.4 Abundance of intestinal flora at genus level

圖5 腸道菌群屬水平組間樣本分析Fig.5 Analysis of samples between groups of intestinal flora at genus level

Akkermansia是對(duì)人體健康有益的益生菌，上述細(xì)胞因子測定結(jié)果已經(jīng)證明頭孢曲松鈉引起了小鼠炎癥反應(yīng)，可能是炎癥刺激了機(jī)體免疫應(yīng)答，通過促進(jìn)Akkermansia的大量繁殖來起到消炎和調(diào)節(jié)機(jī)疫的作用，由于益生菌復(fù)合制劑的作用，小鼠的炎癥逐漸消失，Akkermansia的數(shù)量也隨之下降，但這一結(jié)論還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。Parabacteroides是寄生在人體腸道的革蘭氏陰性厭氧菌，是新型抗代謝綜合癥益生菌，已有研究表明Parabacteroides可以通過降低小鼠血清中IL-6 水平并通過降低結(jié)腸中促炎基因Il1b、Il6、Tnfa、Cxcl2的表達(dá)來減輕機(jī)體炎癥[34]。FABERSANI 等[35]研究發(fā)現(xiàn)，在給予小鼠乳球菌后，小鼠血液中葡萄糖、膽固醇、甘油三脂、TNF-α和IL-6 水平降低，IL-10 水平提高，說明乳球菌在改善肥胖和抑制炎癥方面有一定作用。此外，TIAN 等[36]研究發(fā)現(xiàn)，在膳食纖維的作用下，人體腸道中Parabacteroides和Alloprevotella的數(shù)量明顯提高，表明Alloprevotella是一種潛在的益生菌，但其作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，灌胃益生菌復(fù)合制劑后，腸道中的Parabacteroides、Lactococcus和Alloprevotella的數(shù)量較多，與已有認(rèn)知相符，猜測益生菌復(fù)合制劑可能是通過促進(jìn)小鼠腸道中的Parabacteroides、Lactococcus和Alloprevotella的繁殖來起到減輕炎癥的作用。Bifidobacterium是一株具有抗氧化功效的優(yōu)良菌株，可以增加胸腺和脾臟中T-SOD 和GSH-PX 水平以及清除MDA[37]，從屬水平組間差異物種分析可以看出，中劑量組的Bifidobacterium要高于對(duì)照組和模型組，這與腸道菌群計(jì)數(shù)結(jié)果一致，此外Bifidobacterium還具有清熱解毒作用，前文抗氧化實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)益生菌復(fù)合制劑可以提高肝臟的T-SOD、GSH、GSH-PX 水平并清除MDA，顯示出一定的抗氧化能力，結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)論可知，長期服用益生菌復(fù)合制劑可以提高小鼠腸道中Bifidobacterium的數(shù)量，進(jìn)而起到抗氧化和清除有害物質(zhì)的作用。

Shannon 和Simpson 指數(shù)是腸道菌群豐富度的重要指標(biāo)，由圖6 可知，模型組與對(duì)照組相比，Shannon 和Simpson 指數(shù)顯著降低（P<0.05），各劑量組與模型組相比，Shannon 和Simpson 指數(shù)升高，但無顯著差異（P>0.05），說明灌胃頭孢曲松鈉引起了小鼠腸道菌群紊亂、腸道微生態(tài)平衡被打破降低了小鼠腸道菌群的豐富度，而益生菌復(fù)合制劑均可在一定程度上提高腸道菌群的豐富度。

圖6 腸道菌群Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)Fig.6 Shannon index and Simpson index of intestinal flora

在level2 水平上，如圖7 所示，共獲得35 個(gè)功能豐度。模型組與低劑量組功能類似，其它次級(jí)生代謝物的生物合成（Biosynthesis_of_other_secondary_metabolites）、代謝（Metabolism）、輔助因子和維生素代謝（Metabolism_of_cofactors_and_vitamins）、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)（Cell motility）、免疫系統(tǒng)（Immune_system）、能量代謝（Energy_metabolism）、脂質(zhì)代謝（Lipid_metabolism）基因豐度較低，癌癥（Caners）、神經(jīng)系統(tǒng)（Nervous_system）、老化（Aging）基因豐度較高。對(duì)照組與中、高劑量組功能類似，主要有：能量代謝（Energy_metabolism）、膜轉(zhuǎn)運(yùn)（Membrane_transport）、酶（Enzyme_families）、細(xì)胞生長和凋亡（Cell_growth_and_death）、轉(zhuǎn)錄（Transcription）、細(xì)胞分子和相互作用（Signaling_molecules_and_interaction）、內(nèi)分泌系統(tǒng)（Endocrine_system）、復(fù)制和修復(fù)（Replication_and_repair）、核苷酸代謝（Nucleotide_metabolism）。益生菌除了可以改善腸道微生態(tài)環(huán)境，對(duì)提高機(jī)體免疫和促進(jìn)內(nèi)分泌也有一定的幫助。由功能預(yù)測結(jié)果可知，中高劑量組在免疫、能量代謝和內(nèi)分泌方面的基因豐度較高，說明益生菌復(fù)合制劑對(duì)小鼠腸道微生物的功能具有一定調(diào)節(jié)作用，對(duì)機(jī)體代謝和免疫具有潛在功效。

圖7 功能預(yù)測分析熱圖Fig.7 Heat map of function prediction analysis

3 結(jié)論

近些年，隨著頭孢等藥物在臨床上的應(yīng)用越發(fā)廣泛，抗生素濫用問題引起人們擔(dān)憂，如何減輕抗生素帶來的副作用已成為當(dāng)下需要解決的問題。益生菌是臨床上常用的微生態(tài)活菌制劑，大量研究證實(shí)可以有效緩解由抗生素引發(fā)的不良反應(yīng)。本研究首先利用頭孢曲松鈉構(gòu)建了腸道菌群紊亂模型小鼠，在連續(xù)給藥5 d 后，小鼠除了腸道中有害菌大量增加導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)外，IL-2、IL-6、IL-1β和TNF-α水平上升，表明機(jī)體出現(xiàn)了炎癥，同時(shí)抗氧化能力也受到一定損害。然后，將由長雙歧桿菌BB536 和乳雙歧桿菌HN019 組成的益生菌復(fù)合制劑對(duì)小鼠進(jìn)行30 d的灌胃，IL-2、IL-6、IL-1β和TNF-α均呈下降趨勢，并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。在高劑量的益生菌復(fù)合制劑的幫助下，抗氧化能力有所恢復(fù)，空腸和肝臟中MDA 水平大幅降低，T-SOD、GSH、GSH-PX 水平均有不同程度提高，其中GSH-PX 最為明顯，顯示出一定的護(hù)肝作用。腸道微生物方面，灌胃益生菌復(fù)合制劑在一定程度上提高了腸道菌群的豐富度，主要體現(xiàn)在對(duì)腸桿菌和腸球菌的抑制和促進(jìn)乳桿菌、雙歧桿菌、Parabacteroides、Lactococcus以及Alloprevotella的繁殖，并推測這些有益菌可能與機(jī)體抗炎和抗氧化作用有關(guān)。關(guān)于BB536 和HN019 在調(diào)節(jié)腸道菌群、抗炎和抗氧化方面已經(jīng)有大量研究，其結(jié)果與本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果大致相同，但這兩種益生菌在減輕抗生素副作用方面少有報(bào)道，通過本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，由BB536 和HN019 組成的益生菌復(fù)合制劑改善了小鼠由于頭孢曲松鈉引起的腸道菌群失調(diào)狀態(tài)，并在一定程度上恢復(fù)了抗炎和抗氧化能力，說明BB536 和HN019 組成的益生菌復(fù)合制劑可以有效緩解抗生素帶來的副作用，此外16S rDNA 高通量測序的功能預(yù)測結(jié)果顯示，這兩種益生菌在提高免疫、促進(jìn)代謝以及促進(jìn)細(xì)胞生長方面可能會(huì)有一定的有益效果，這一發(fā)現(xiàn)為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供了思路。