梔子黃色素提取、精制及藥理活性的研究進展

湯麗琴，劉昊澄，溫 靖，徐玉娟，李 俊,

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部功能食品重點實驗室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東廣州 510610；2.江西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，江西南昌 330045）

梔子（Gardenia jasminoidesEllis）是一種茜草科灌木，又名山梔子、黃梔子等，廣泛分布于溫帶地區(qū)，屬藥食同源植物資源[1]。梔子黃色素是梔子果實提取物的主要活性成分之一，是目前應用比較廣泛的天然水溶性色素。梔子黃色素的主要成分為藏花素和藏花酸[2]，其結構式如圖1 所示。與合成色素相比，梔子黃色素安全性更高且具有一定的營養(yǎng)價值和保健功能，可作為食品添加劑應用于面條、飲料等的著色。此外，大量的研究也證明了梔子黃色素的主要成分具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等藥理活性，具有廣闊的開發(fā)前景[3]。然而，目前用于梔子黃色素提取精制的技術主要包括傳統(tǒng)浸提法、超聲波提取法、大孔吸附樹脂法以及膜分離法等。這些方法較為落后，導致國內(nèi)市場上高色價梔子黃色素產(chǎn)品較少，且價格昂貴，阻滯了梔子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，需要研究出較為先進實用的提取精制技術，這對梔子黃色素產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。此外，加大梔子黃色素功能活性的研究可以進一步擴大梔子黃色素的應用范圍。本文主要對梔子黃色素的提取、精制及藥理活性的相關研究進展進行了綜述，以期為梔子黃色素在食品、藥品及化工工業(yè)的深入研究和開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

圖1 藏花素（a）和藏花酸（b）的化學結構Fig.1 The chemical structure of crocin (a) and crocetin (b)

1 梔子黃色素的提取

1.1 傳統(tǒng)溶劑浸提法

傳統(tǒng)溶劑浸提法是根據(jù)相似相溶原理獲取目標成分的提取技術，具有工藝簡單、設備投資少等優(yōu)勢。然而卻需要較長的提取時間及較高的溫度，增加了不耐熱活性物質熱降解的風險。此外，大量提取劑的回收也是阻礙該方法廣泛應用的一大難題。傳統(tǒng)水浸提法提取梔子黃色素的過程中會導致大量糖類物質浸出，且得率較低，因此研究人員常加入有機試劑進行強化提取[4]。劉和平[5]以安徽奕龍梔子為原料，采用50%乙醇浸提3 次，每次浸提2 h，最終得到得率為2.05%的梔子黃色素。張鶴[6]采用熱回流法對浙江安吉梔子進行提取，所得梔子黃色素的產(chǎn)率為7.00%。梔子黃色素的得率與提取條件密切相關，進行相應的工藝優(yōu)化可進一步提高梔子黃色素得率[7]。Yang 等[8]通過響應面法對江西梔子果實中梔子黃色素的提取進行了工藝優(yōu)化，并確定了梔子黃色素的最佳提取條件：乙醇質量分數(shù)為51.3%，溫度為70.4 ℃，提取時間為28.6 min，梔子黃色素的得率為8.41%。綜上結果可知，不同產(chǎn)地梔子得率差異顯著，這可能與梔子種植環(huán)境差異有關。

1.2 超聲波提取法

超聲波是一種浸提輔助方式，它是一種機械波，可以被介質吸收，具有一定的振動空化、機械粉碎作用。色價和得率是評價梔子黃色素品質的重要指標，梔子黃色素色價越高其品質越好。鄒立君[9]比較了傳統(tǒng)浸提法和超聲輔助提取法對梔子黃色素得率和色價的影響，結果表明超聲輔助提取法獲得的梔子黃色素色價和得率均更高，超聲輔助提取法制備的梔子黃色素色價達45.2，相較于傳統(tǒng)浸提法提高了1.2 倍。然而在張鶴[6]的研究結果卻發(fā)現(xiàn)超聲輔助提取法和傳統(tǒng)浸提法對梔子黃色素含量的影響并無顯著性差異。雖然超聲輔助提取相對傳統(tǒng)浸提設備資源花費更高，但是卻顯著縮短了提取時間，這對后期的研究與發(fā)展具有重要意義。

1.3 其它提取法

除上述提取方法外，梔子果實中梔子黃色素的提取方法還有微波提取法和機械化學法等。涂華等[10]比較了微波輔助提取技術與熱回流提取技術對梔子黃色素品質的影響，結果表明微波輔助提取技術獲得的梔子黃色素具有更高的色價（79.09），較熱回流提取技術提高了1.16 倍。Jun 等[11]利用微波輔助提取系統(tǒng)，對梔子黃色素的提取率進行了研究，結果表明梔子黃色素含量比常規(guī)提取方法高出50%。與傳統(tǒng)溶劑浸提法相比，微波輔助提取是在有機溶劑浸提的基礎上增加了微波處理以提高梔子黃色素的得率，為實現(xiàn)天然產(chǎn)物高效工業(yè)化提取提供了新的路徑。另外，Xu 等[12]采用一種基于機械化學方法從梔子中選擇性提取梔子黃色素，確定球磨條件為30%（g/g）活性炭，200 r/min 行星式球磨機球磨5 min。然后用80%乙醇溶液和1%（g/g）吐溫20 在75 ℃下提取5 min，得到得率為1.45%的梔子黃色素。與傳統(tǒng)的溶劑浸提方法相比，這種新的萃取技術大大簡化了分離過程，具有有機溶劑消耗少、操作簡單、過程快、效率高等優(yōu)點。

從上文提及的幾種提取方法可以看出，傳統(tǒng)溶劑浸提法比較常用，但效率較低；微波輔助提取技術雖然具有較高的梔子黃色素得率，但微波提取時原料內(nèi)外溫度不均一，易造成活性成分的損失；機械化學法和超聲輔助提取不僅具有能夠加快提取速度，還能獲得較高的提取得率，是用來提取梔子黃色素的較為理想的提取技術。目前，較少研究者采用酶法技術提取梔子果實中的梔子黃色素。酶法提取是較為溫和、綠色的提取技術，在未來有很大的發(fā)展前景，后期研究人員可著手于這方面的研究。此外，若能進一步優(yōu)化梔子黃色素提取工藝體系，將推動梔子黃色素的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，經(jīng)濟效益可觀。

2 梔子黃色素的精制

梔子黃色素粗提物存在色價低，雜質多等問題，不能直接用作食品添加劑，需要對其進行純化。梔子黃色素粗提物的雜質主要有以梔子苷為主的環(huán)烯醚萜苷類化合物和綠原酸等。梔子苷容易引起著色食品綠變，綠原酸的存在會導致食品顏色變暗[13]。因此，需要去除這些雜質以獲得較高品質的梔子黃色素。目前，用來分離純化梔子黃色素的方法有柱層析法（大孔吸附樹脂法、聚酰胺層析法、制備液相色譜法）、膜分離法以及不同分離方法的結合等（表1）。

表1 梔子黃色素純化方法比較Table 1 Comparison of purification methods of gardenia yellow pigment

2.1 柱層析法

大孔吸附樹脂由于具有多種官能團、高機械強度和多孔能力，被廣泛用于富集生物活性化合物。周厚寧等[14]研究了5 種不同類型的大孔樹脂對梔子黃色素的靜態(tài)吸附及解吸性能，結果表明HP2MGL 大孔樹脂具有最優(yōu)的解吸與吸附性能，并以此樹脂為填充材料得到色價為340，得率為2.2%的梔子黃色素。任志軍[15]采用大孔樹脂精制梔子黃色素，在考察的13 種大孔樹脂中，HPD100A 對梔子黃色素的吸附量大，選擇性高，所得梔子黃色素色價值高于360，產(chǎn)率為0.87%。聚酰胺是一種高分子聚合物，由酰胺鍵聚合而成，可與酚類、酸類等富含羥基的化合物形成氫鍵而被吸附，常被用來純化天然產(chǎn)物。王先敏[16]以聚酰胺為梔子黃色素的純化劑，建立了富集純化梔子黃色素的工藝路線，純化前后樣品中的梔子黃色素含量由1.83%提升至25.96%，色價高于500，得率為3.89%。制備液相色譜法是通過高負載、高分離度的制備柱來實現(xiàn)化合物較高程度的分離與純化。Choi 等[17]首先將梔子黃色素粗提液通過硅藻土層過濾，然后再采用半制備液相色譜法對梔子黃色素濾液進行分離。用水-甲醇（1:1）混合物洗脫該柱15 min，然后以2.5 mL/min 的流速用甲醇-水（1:1）至100%甲醇線性梯度洗脫50 min，收集保留時間為16.1 min 的黃色液體，真空干燥得到分析純黃色固體藏花素，得率為0.7%。目前，大孔吸附樹脂法和聚酰胺層析法是梔子黃色素純化的常用方法，這是因為其具有低成本、高產(chǎn)量的優(yōu)點。雖然制備液相色譜法純化效果遠高于大孔吸附樹脂法及聚酰胺層析法，但無法實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)且得率較低。

2.2 膜分離法

膜分離技術是以化學位差及外界能量差形成的推動力而實現(xiàn)不同成分分離的方法。姚立霞[18]通過陶瓷微濾膜分離純化梔子黃色素提取液，確定了微濾膜工藝條件：操作壓力差為0.12 MPa，溫度為35 ℃，孔徑大小為0.2 μm。該技術實現(xiàn)了梔子黃色素的富集及其它雜質大分子的去除，最終得到的梔子黃色素中藏花素含量為68%，色價為124.5，得率為18%。鄭光耀等[19]將梔子黃色素粗提液經(jīng)微濾膜過濾后，用石油醚純化微濾液，再將微濾液用反滲透膜減重濃縮，最后冷凍干燥得梔子黃色素粉末樣品，其色價為589，得率為56%。郭晶瑩[20]以梔子果粉為原料得到梔子粗提液，采用多級低分子醇-鹽雙水相體系分離純化，得到梔子黃色素濃縮液，再經(jīng)過有機溶劑重結晶得到純度為95.5%，收率為86.6%，色價為535 的梔子黃色素。李宏文等[21]通過膜分離技術獲得色價高于500，得率為70%的梔子黃色素。該方法操作簡單，條件溫和，但膜容易受外界環(huán)境污染，過濾時間長，此外膜的使用壽命也是一個值得考慮的問題。

2.3 其它方法

當單一的分離方法達不到預期的分離效果時，研究者通常會結合多種分離純化方法實現(xiàn)目標成分的有效分離。劉超等[22]首先采用孔徑為200 nm的陶瓷膜在溫度為30 ℃，壓力為0.2 MPa 的條件下對梔子黃色素粗提液進行澄清處理，再分別用石油醚、乙酸乙酯及正丁醇進行萃?。换厥照〈驾腿∫?，選用HP2MGL 大孔樹脂進行柱層析，收集20%～70%乙醇洗脫液；最后采用3000 Da 超濾膜對20%～70%乙醇洗脫液進行分離純化，冷凍干燥得到色價為760，得率為19.3%的梔子黃色素。聶斡等[23]結合聚酰胺柱和大孔樹脂柱純化梔子黃色素粗提液，得到色價為853，得率為7.28%的梔子黃色素。Feng等[13]首先采用LX-60 大孔樹脂對梔子黃色素進行初步純化，梔子黃色素中藏花素含量達29.6%，再通過反相中壓液相色譜進行二級分離，得到色價為756，藏花素含量為60.8%的梔子黃色素，回收率為81.2%?，F(xiàn)有的提純方法尚不能同時滿足純度高、環(huán)保且大規(guī)模生產(chǎn)的要求，而目前國內(nèi)外對梔子黃色素的純化技術正在向綠色、安全方向推進。因此，仍需探索更為簡單快速且環(huán)保的提取純化技術。

3 梔子黃色素的藥理活性

藏花素和藏花酸是梔子黃色素的主要成分，能夠對某些疾病起到預防及治療的作用。藥理學研究結果已經(jīng)證明梔子黃色素中的藏花素及藏花酸類成分具有各種藥理活性，如抗氧化、抗腫瘤、抗抑郁、抗炎、保肝活性以及降血糖、降血脂等。

3.1 抗氧化活性

藏花素是梔子黃色素抗氧化活性的主要貢獻者，包括清除不同類型自由基和亞硝酸鹽的能力、抑制3-乙基苯并噻唑烷-6-磺酸自由基陽離子以及延長脂質過氧化等[24]。陳麗萍等[25]研究表明梔子黃色素具有較強的抗氧化活性，其中對DPPH 自由基、ABTS 自由基、羥基自由基的IC50分別為0.19、0.51、0.19 mg/mL。在一定濃度范圍內(nèi)，抗氧化活性隨梔子黃色素濃度的增加而增強。Shang 等[26]比較了江西、安徽、湖南、四川以及河南五省的梔子黃色素的清除ABTS 和DPPH 自由基的能力，結果表明湖南梔子具有最高的抗氧化活性，這可能與其具有較高的藏花素含量有關。Soeda 等[27]研究表明，藏花素可通過抑制N-SMase 激活、神經(jīng)酰胺生成和JNK 磷酸化參與對氧化應激誘導細胞死亡的保護作用。與此研究不同的是，在體外抗氧化研究中，總藏花素含量與體外抗氧化性能之間存在直接相關性[28]，而這種抗氧化功能可能與藏花素結構中附著的糖有關，這在Chen 等[29]的研究中已有證明。梔子黃色素的抗氧化潛力是其許多藥理活性的基礎，這也是梔子黃色素具有較多藥理活性的原因之一。此外，由于其抗氧化特性，梔子黃色素可以顯著保護視網(wǎng)膜免受缺血/再灌注（IR）損傷[30]?？偟膩碚f，梔子黃色素可能具有作為一種抗氧化劑應用于食品及醫(yī)藥行業(yè)的潛力。

3.2 抗腫瘤活性

很多研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)藏花素和藏花酸具有抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡的特性。細胞凋亡是導致細胞生長減少的重要機制。如圖2 所示，細胞凋亡機制主要可分為兩條途徑：線粒體介導的內(nèi)部途徑和死亡受體介導的外部途徑[31]。藏花素在人肺癌中的獨特促凋亡特性已被證明是通過 Caspase-8-9-3級聯(lián)反應實現(xiàn)的[32]。在人宮頸癌細胞系和耐藥細胞系中，藏花素可誘導Bax 的上調(diào)以及Bcl-2 的下調(diào)[33]。此外，抗腫瘤活性的其它分子機制也有報道。Chong等[34]報道了藏花素可以抑制AKT/mTOR 活性從而誘導肝癌細胞自噬凋亡。Wang 等[35]發(fā)現(xiàn)藏花素對人皮膚癌細胞SGL-1 和A431 的增殖有劑量依賴性影響，這可能與下調(diào)JAK/STAT 通路有關。Mir 等[36]證明了藏花酸通過抑制雌激素受體α和組蛋白去乙?；? 介導的信號級聯(lián)抑制MCF-7 細胞增殖，但對正常細胞系（L-6）無明顯影響。其他研究表明，梔子中的藏花素和藏花酸可以通過細胞毒性抑制癌細胞的增殖。在頭頸部癌細胞系（HN-5）中，藏花素通過細胞毒性誘導細胞凋亡，并且使細胞對輻射誘導的毒性和凋亡更敏感[37]。另一項對MCF-7、A549 和HeLa 人癌細胞的研究表明，藏花酸誘導細胞毒性，抑制癌細胞生長，并以時間和濃度依賴的方式導致癌細胞死亡[38]。

圖2 藏花素/藏花酸對細胞凋亡途徑影響的機制圖Fig.2 The mechanism diagram of the effect of crocin/crocetin on the apoptosis pathway

3.3 抗抑郁活性

Ghalandari-Shamami 等[39]的研究表明，藏花素治療可減少青春期雄性大鼠的抑郁行為和慢性束縛應激誘導的形態(tài)學變化。Ardebili 等[40]研究發(fā)現(xiàn)藏花素對OP 誘導的小鼠抑郁行為具有抗抑郁作用，這可能是因為藏花素對海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子發(fā)揮了作用。在強迫游泳和習得性無助試驗中進行連續(xù)7 d 的梔子黃色素治療處理，結果表現(xiàn)出顯著的抗抑郁反應，并抑制海馬中真核延伸因子2 的磷酸化[41]。此外，在Bahareh 等[42]進行的一項研究中，使用小鼠在兩種不同的急性和亞急性給藥方案中評估了藏花素和藏花酸的抗抑郁作用。結果表明，藏花酸在治療抑郁癥方面比藏花素更有效。Nikbakht 等[43]評估了藏花素對志愿者的影響，結果顯示藏花素顯著減輕了受試者的抑郁癥狀。Razavi 等[44]揭示了藏花素的長期抗抑郁活性也可能是通過CREB 介導的。盡管試驗顯示了積極和有希望的效果，但仍需要全面和深入地研究來分析梔子中梔子黃色素成分的毒性和副作用。

3.4 抗炎活性

Liu 等[45]以40 mg/kg 的藏花素給藥Ⅱ型膠原誘導性關節(jié)炎大鼠，發(fā)現(xiàn)大鼠的MMP-1、MMP-3 和MMP-13 水平恢復至正常水平。藏花素還能抑制CIA大鼠踝關節(jié)組織和血清中促炎細胞因子的表達。同樣，另一項研究發(fā)現(xiàn)，藏花素顯著抑制LPS 誘導的人成纖維樣滑膜細胞中促炎細胞因子的表達[46]。藏花素通過阻斷小鼠NF-κB/STA T6 信號通路從而下調(diào)Th2 細胞介導的免疫反應，改善特應性皮炎癥狀[47]。Godugu 等[48]發(fā)現(xiàn)藏花素通過上調(diào)Nrf2 的表達，下調(diào)IL-6、TNF-α以及NF-κB 的表達對雨蛙素誘導的急性胰腺炎有潛在的調(diào)節(jié)作用，結果揭示定期攝入藏花素有利于胰腺健康。Hossein 等[49]在腎缺血-再灌注（IR）損傷的大鼠模型中，表明用藏花素（400 mg/kg）預處理導致細胞氧化還原狀態(tài)（硫代巴比妥酸活性物質）顯著降低，隨后抗氧化能力升高。采用維生素D3誘導的大鼠冠狀動脈粥樣硬化模型的研究證實了藏花素通過促進M2 巨噬細胞極化和可能通過抑制NF-κB p65 核易位來抑制脂肪生成和減輕炎癥，這有助于冠狀動脈粥樣硬化的治療[50]。

3.5 保肝活性

20 mg/kg 的藏花素可以改善雙酚A 處理大鼠的肝損傷程度，并提高甘油三酯和肝酶的水平[51]。在一項雙盲臨床實驗中，藏花素降低了脂肪生成相關基因的mRNA 表達以及非酯化脂肪酸和膽固醇的含量，顯著改善了非酒精性脂肪肝病患者的肝功能和甘油三酯[52]。Ping 等[53]證明了藏花素治療可以顯著減少四氯化碳處理小鼠肝細胞的破裂及變形性。Ke 等[54]發(fā)現(xiàn)藏花素預處理可有效預防脂多糖/D-半乳糖胺誘導的暴發(fā)性肝功能衰竭。其潛在機制與NF-κB 的調(diào)節(jié)、Bcl-2 家族和Caspase 家族中凋亡蛋白的調(diào)節(jié)有關。此外，藏花素對嗎啡和尼古丁誘導的小鼠肝毒性具有保護作用，這是通過增加肝臟重量、降低平均肝細胞直徑和肝中靜脈直徑、降低肝酶和一氧化氮水平來實現(xiàn)的[55]。此外，藏花素還可以通過激活AMPK信號來抑制脂肪的形成，促進脂肪酸的β氧化，從而改善脂肪肝和代謝紊亂[56]。這些研究表明藏花素可能是臨床治療肝病和相關代謝紊亂的潛在選擇。

3.6 降血糖

據(jù)研究報道，藏花素作為梔子黃色素中的主要成分，對心血管疾病的治療具有較好的效果。α-葡萄糖苷酶可以將機體內(nèi)的碳水化合物酶解成單分子的葡糖糖并進入血液，從而升高血糖水平，這和許多代謝紊亂疾病有著密不可分的聯(lián)系。黎硯書等[57]將梔子黃色素作用于四氧嘧啶糖尿病模型小鼠，結果表明，梔子黃色素可抑制α-葡萄糖苷酶活性，抑制小腸吸收，并且在一定程度上能夠降低小鼠體內(nèi)的血糖水平。此外，另一項研究結果表明，在飲食誘導的高脂血癥大鼠中，在25～100 mg/kg 的日劑量范圍內(nèi)，總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、血清甘油三酯和極低密度脂蛋白膽固醇的水平在經(jīng)西紅花苷治療10 d后均顯著降低[58]。

3.7 降血壓

高血壓是一種病因尚不清楚的慢性病。Razavi等[59]的研究結果表明，藏花素對二嗪農(nóng)（DZN）亞慢性毒性大鼠有升高收縮壓、減慢心率的作用。Imenshahidi 等[60]發(fā)現(xiàn)藏花素可劑量相關性的降低醋酸去氧皮質酮誘導的高血壓大鼠的平均動脈血壓和心率。相似的研究結果在另一項研究中也有發(fā)現(xiàn)，Higashino 等[61]確定了藏花素對心血管系統(tǒng)的影響，他們發(fā)現(xiàn)藏花素可顯著提高易中風的自發(fā)性高血壓大鼠的收縮壓，此外，進一步的實驗結果表明，藏花素的降壓作用可能與增加NO 的生物利用度有關。

4 結語

近年來，伴隨著研究者對梔子黃色素的日益重視，梔子黃色素的藥理活性及功能逐漸進入人們的視野。本文圍繞梔子黃色素的提取、精制技術以及藥理活性三個方面的研究進展進行綜述，從以上結果可以得出梔子黃色素提取精制的常見方法有：傳統(tǒng)溶劑浸提法、超聲波提取法、柱層析法以及膜分離法等。此外，梔子黃色素具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎及降血糖降血壓等藥理活性。

就目前研究成果而言，未來亟需解決的問題仍然存在。其一，對于梔子黃色素的提取精制可以采用多種方法聯(lián)用技術，使提取純化后的產(chǎn)品達到理想效果；其二，針對梔子黃色素的抗氧化、抗腫瘤等藥理活性在動物模型、代謝組學、腸道微生物菌群宏基因組學水平上進行構效關系研究；其三，雖然梔子黃色素在體內(nèi)外模型中均表現(xiàn)出較好的活性，但仍需要進一步證實梔子黃色素地有效利用及其在臨床上的可能應用；其四，需要補充對梔子黃色素的毒理學研究和安全性評價，以保證人們對梔子黃色素的安全性要求。綜上所述，梔子黃色素作為一種天然色素，市場前景廣闊。鑒于梔子黃色素具有多種功能特性，未來可大力發(fā)展其作為新型食品強化劑和重要的藥物載體原料。