小球藻胞內(nèi)多糖提取純化及其抗氧化活性

李思雨，劉紅全, ，孫 寒，徐琰杰，黃磊恒，龍 寒，凌宏林，成江弈，楊堃峰

（1.廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院，廣西多糖材料與改性重點實驗室，廣西民族大學(xué)海洋生物資源保護與利用重點實驗室，廣西南寧 530007；2.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東青島 266003）

小球藻是一類普生性單細胞綠藻，生態(tài)類型多樣，分布廣泛。由于其生長速度快、飼養(yǎng)簡單、有效成分含量高等特點，已發(fā)展成為微藻養(yǎng)殖最廣泛的種類之一。多糖是小球藻活性提取物中重要的組成部分[1]，小球藻多糖具有良好的抗氧化活性[2?3]，并且在調(diào)節(jié)機體免疫[4?5]、抗病毒[6?7]、抗菌[8]、抗腫瘤[9]、抗炎[10]、抗糖尿病[11]等諸多方面表現(xiàn)優(yōu)異?？寡趸芰ψ鳛槎嗵堑闹匾钚灾唬呀?jīng)成為了國內(nèi)外多糖研究的熱點，在海藻中檢測得到的抗氧化化合物具有廣闊的應(yīng)用前景，在人類健康和營養(yǎng)中發(fā)揮重要作用[12]，而抗氧化研究大多集中在大型海藻中，對微藻多糖抗氧化的研究開展較少[13]，故本試驗針對小球藻多糖抗氧化性展開研究。

小球藻胞內(nèi)粗多糖的得率較低，多糖種類多樣，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且水溶性較差，導(dǎo)致小球藻多糖的開發(fā)利用較為困難[14]。關(guān)于多糖的提取，目前常用的提取方法有酸堿溶液浸提法、熱水浸提法、微波輔助法、超聲波輔助法及酶法等。在高溫、酸性、堿性提取條件下，可導(dǎo)致多糖降解，并且會使粗多糖的樣品顏色變深[15]；微波輔助法提高了得率，但是產(chǎn)熱高，在試驗前需要花費大量時間根據(jù)提取物的耐熱性來確定最佳作用周期，導(dǎo)致試驗過程繁瑣且周期長[16?17]；酶法提取雜質(zhì)較多，不益于后期的分離純化[18]；超聲波輔助法具有產(chǎn)熱少、耗時短、抽提率高等優(yōu)點[19]。通過兩種或多種技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，能夠提高多糖得率，同時具有提取迅速、節(jié)能和簡便等優(yōu)點[16]，故本試驗采用超聲波輔助熱水浸提法提取小球藻胞內(nèi)粗多糖。

本研究以小球藻為原料，采取超聲波破碎和熱水浸提相結(jié)合的方法提取小球藻胞內(nèi)粗多糖，利用響應(yīng)面法進行提取條件的優(yōu)化，并對粗多糖進行分離純化、表征分析和體外抗氧化試驗，以期為小球藻多糖的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小球藻（Chlorella vulgaris） 上海光語生物科技有限公司，由本實驗室培育并保藏；1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH） 北京博奧拓達科技有限公司；羥自由基清除能力檢測試劑盒 索萊寶生物科技有限公司；DEAE-52 纖維素、葡聚糖凝膠Sephadex G-100上海瑞永生物科技有限公司；葡聚糖系列標(biāo)準(zhǔn)品（分子量分別為5000、11600、23800、48600、80900、148000、273000、409800、667800 Da）與單糖標(biāo)準(zhǔn)品：巖藻糖（Fucose，F(xiàn)uc）、鹽酸氨基半乳糖（Galactosamine hydrochloride，GalN）、鼠李糖（Rhamnose，Rha）、阿拉伯糖（Arabinose，Ara）、鹽酸氨基葡萄糖（Glucosamine hydrochloride，GlcN）、半乳糖（Galactose，Gal）、葡萄糖（Glucose，Glc）、N-乙酰-D 氨基葡萄糖（N-acetyl-d-glucosamine，GlcNAc）、木糖（Xylose，Xyl）、甘露糖（Mannose，Man）、果糖（Fructose，F(xiàn)ru）、核糖（Ribose，Rib）、半乳糖醛酸（Galactouronic acid，GalA）、葡萄糖醛酸（Glucuronic acid，GlcA）、古羅糖醛酸（Guluronic acid，GulA）、甘露糖醛酸（Mannuronic acid，ManA） 分析純，博睿糖生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

60 L 封閉式光生物反應(yīng)器 上海光語生物科技有限公司；UV-1800 紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；LGJ-10 真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；LC-10A 高效液相色譜儀 日本Shimadzu 公司；ICS5000 離子色譜儀、Nicolet IS10 傅里葉變換紅外光譜儀 美國ThermoFisher 公司；Epoch酶標(biāo)儀 美國伯騰公司；TG1850-WS 臺式高速離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；C184322 閃式層析柱、C195324 球磨口閃式層析柱 重慶欣維爾玻璃有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小球藻胞內(nèi)粗多糖提取條件優(yōu)化

1.2.1.1 小球藻培養(yǎng)及小球藻粉制備 將小球藻按照15%的接種量培養(yǎng)于含f/2 培養(yǎng)基[20]的封閉式光生物反應(yīng)器中，溫度為24±1 ℃，光照強度3500 Lux，光暗周期12/12 h[21]。

取培養(yǎng)至生長穩(wěn)定期[22]藻液，利用高速離心機8000 r/min 離心10 min 收集藻泥，冷凍干燥成小球藻粉備用。

1.2.1.2 小球藻胞內(nèi)粗多糖提取及得率測定 精確稱取干燥小球藻藻粉0.1 g，與一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaOH 溶液以不同料液比混合，利用超聲波細胞粉碎機進行超聲破碎以破除小球藻細胞壁，不同水浴溫度反應(yīng)一定時間進行提取，8000 r/min 離心10 min，取上清液加入4 倍體積無水乙醇，4 ℃靜置過夜[23]。次日8000 r/min 離心10 min，舍棄上清液，將沉淀復(fù)溶于蒸餾水中，得多糖溶液。利用Sevage 法[24]對多糖溶液進行脫蛋白處理，得到上清液后再加入4 倍體積無水乙醇，4 ℃靜置過夜，次日8000 r/min 離心10 min，將離心得到的沉淀冷凍干燥即得小球藻胞內(nèi)粗多糖。

采用蒽酮-硫酸比色法[25]測定小球藻粗多糖濃度，以葡萄糖濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以620 nm 處的吸光值為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到葡萄糖濃度與吸光值關(guān)系的線性方程為：

按照以下公式計算小球藻胞內(nèi)粗多糖得率[26]：

式中：C-標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度（μg/mL）；V-粗提液體積（mL）；N-稀釋倍數(shù)；m-小球藻粉質(zhì)量（mg）。

1.2.1.3 單因素實驗設(shè)計 小球藻胞內(nèi)粗多糖提取的基本條件固定為：NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%，料液比1:30（g/mL），超聲功率300 W，超聲時間20 min，提取溫度80 ℃，提取時間2 h。改變其中一個條件，分別考察NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、超聲功率（C）、超聲時間（D）、提取溫度（E）、提取時間（F）6 個因素對粗多糖得率的影響，試驗設(shè)計見表1，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算粗多糖得率。

表1 單因素設(shè)計因素及水平Table 1 Factors and levels of univariate design

1.2.1.4 Plackett-Burman 試驗設(shè)計 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，對小球藻粗多糖提取工藝中6 個因素進行Plackett-Burman 試驗設(shè)計，根據(jù)結(jié)果得到影響粗多糖得率的顯著因素[27]，以粗多糖得率為響應(yīng)值，并對試驗結(jié)果進行方差分析，試驗設(shè)計因素與水平見表2。

表2 Plackett-Burman 試驗因素及水平Table 2 Factors and levels of PB design experiment

1.2.1.5 最陡爬坡試驗設(shè)計 根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果設(shè)計最陡爬坡試驗。在后續(xù)的爬坡試驗設(shè)計中，應(yīng)增大呈正效應(yīng)的因素，減小呈負效應(yīng)的因素，設(shè)置合適的步長，從而使顯著因素更經(jīng)濟快速地逼近最佳響應(yīng)區(qū)域[28]，即提取粗多糖的最優(yōu)條件。

1.2.1.6 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗 根據(jù)最陡爬坡試驗結(jié)果，采用 Box-Behnken（BBD）設(shè)計原理，選擇NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、超聲功率、提取時間為自變量，以粗多糖得率為響應(yīng)值，設(shè)計四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗，試驗因素及水平設(shè)計見表3。

表3 響應(yīng)面試驗因素及水平Table 3 Factors and level of response surface experiment

1.2.2 小球藻胞內(nèi)粗多糖分離純化及表征

1.2.2.1 陰離子交換柱層析 采用閃式層析柱以DEAE-52 纖維素為填料進行裝柱，對小球藻胞內(nèi)粗多糖進行分離純化[29]。將粗多糖配成5 mg/mL 的多糖溶液，多糖溶液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，依次使用超純水、0.2、0.5、0.75、1 mol/L 的NaCl 溶液進行洗脫，流速為2 mL/min，每管收集8 mL，利用蒽酮-硫酸法于620 nm 處測定每管吸光度，根據(jù)出峰位置進行收集，得到的五種組分（CIP-1、CIP-2、CIP-3、CIP-4、CIP-5），將收集的各組分濃縮，利用截留分子量為3500 Da 透析袋透析除鹽，冷凍干燥備用。

1.2.2.2 葡聚糖凝膠柱層析 采用球磨口閃式層析柱以Sephadex G-100 為填料進行裝柱，利用葡聚糖凝膠柱Sephadex G-100 對經(jīng)DEAE-52 纖維素柱分離得到的組分進一步純化[30]，選擇酸性多糖CIP-3 進行進一步純化。將CIP-3 配成8 mg/mL 多糖溶液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后，使用超純水洗脫，流速為0.3 mL/min，每管收集3 mL，利用蒽酮-硫酸法于620 nm 處測定每管吸光度，根據(jù)出峰位置進行收集，得到純化后組分SCIP，將收集得到的SCIP濃縮后冷凍干燥備用。

1.2.2.3 SCIP 紫外光譜分析 取SCIP 配成0.5 mg/mL的多糖溶液，以蒸餾水作空白對照，在200～400 nm范圍內(nèi)進行紫外光譜掃描，檢測多糖組分中是否有蛋白質(zhì)和核酸的干擾[31]。

1.2.2.4 SCIP 紅外光譜分析 取SCIP 1 mg 與100 mg干燥KBr 粉末在紅外燈下研磨均勻，進行壓片[8]，在4000～400 cm?1范圍內(nèi)進行紅外光譜掃描。

1.2.2.5 SCIP 分子量測定 通過高效液相色譜儀測定SCIP 分子量。在Aipire 等[32]基礎(chǔ)上，進行調(diào)整，精密稱取SCIP 和葡聚糖系列標(biāo)準(zhǔn)品，均配制成5 mg/mL 溶液，12000 r/min 離心10 min，上清液用0.22 μm 微孔濾膜過濾，將樣品轉(zhuǎn)置于1.8 mL 進樣瓶中。

色譜條件為：色譜柱（BRT105-104-102 串聯(lián)凝膠柱）；流動相（0.05 mol/L NaCl 溶液）；流速（0.6 mL/min）；柱溫（40 ℃）；進樣量（20 μL）；檢測器（示差檢測器RI-10A）。與標(biāo)準(zhǔn)品對照，分析處理數(shù)據(jù)。

1.2.2.6 SCIP 單糖組成分析 通過離子色譜儀測定單糖組成。在趙丹等[33]的基礎(chǔ)上進行改進，取16 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品配成10 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液，取各單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液精密配置成不同濃度梯度（0.01、0.1、0.5、1、5、10、20 mg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)絕對定量方法，測定不同單糖質(zhì)量，根據(jù)單糖摩爾質(zhì)量計算出摩爾比。

樣品準(zhǔn)備：精密稱量10 mg SCIP 置于安瓿瓶中，加入3 mol/L 三氟乙酸10 mL，120 ℃水解3 h。準(zhǔn)確吸取酸水解溶液轉(zhuǎn)置于管中氮吹吹干，加入10 mL 水渦旋混勻，吸取100 μL 加入900 μL 超純水，12000 r/min 離心5 min。取上清進行離子色譜分析。

色譜條件為：色譜柱（Dionex Carbopac TMPA20）；流動相（A：H2O；B：15 mmol/L NaOH 與100 mmol/L NaOAC 等比例混合液）；流速（0.3 mL/min）；進樣量（5 μL）；柱溫（30 ℃）；檢測器（電化學(xué)檢測器）。

1.2.3 SCIP 體外抗氧化能力研究

1.2.3.1 對DPPH 自由基清除能力 取不同濃度SCIP溶液（0.5、1、2、4、8、12、16、20 mg/mL）1 mL，加入0.004%的 DPPH 甲醇溶液1 mL，搖勻，避光保存30 min，517 nm 處測吸光度（Ai），1 mL 甲醇與1 mL 多糖溶液混合在517 nm 處吸光度（Aj），1 mL DPPH 甲醇溶液與1 mL 甲醇混合在517 nm 處吸光度（A0）[34]，以稀釋100 倍VC（0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2 mg/mL）作為陽性對照。DPPH自由基清除率公式為：

1.2.3.2 對羥基自由基清除能力 配制不同濃度（0.5、1、3、5、10、15、20、25 mg/mL）SCIP 溶液，根據(jù)羥自由基清除能力檢測試劑盒在536 nm 處進行測定[22]，以稀釋100 倍VC（0.005、0.01、0.03、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg/mL）作為陽性對照。羥自由基清除率公式為：

式中：S測：待測樣品吸光值；S對：對照管吸光值；S空：空白管吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

Plackett-Burman 試驗及方差分析、響應(yīng)面試驗及方差分析采用 Design-Expert 10.0.7 軟件。IC50預(yù)測采用IBM SPSS Statistics 25 軟件。本試驗所作圖譜均采用 OriginPro 9.1 軟件作圖，且每個試驗均做3 個重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小球藻胞內(nèi)粗多糖提取條件優(yōu)化

2.1.1 小球藻胞內(nèi)多糖提取單因素實驗結(jié)果 由圖1A 和1B 可知，隨著NaOH 質(zhì)量濃度和料液比的增加，粗多糖得率都呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，且分別在2.5%和1:30（g/mL）時，多糖得率達到最大值。此后，隨著NaOH 質(zhì)量濃度和料液比的繼續(xù)增加都會使堿的濃度過大，從而使多糖被降解而造成得率下降[28]，還會造成試劑的浪費?？紤]到綜合利用和節(jié)約成本，所以選擇NaOH 質(zhì)量濃度為2.5%、料液比為1:30（g/mL）時作為多糖提取的最優(yōu)值。

由圖1C 和1D 可知，超聲功率為300 W、超聲時間為20 min 時，多糖得率為最大值。繼續(xù)增大超聲功率和超聲時間，多糖的得率會下降，這是因為增加功率和延長時間都會造成熱量的增加，從而引起小球藻多糖發(fā)生降解[35]。因此，選擇超聲功率300 W、超聲時間為20 min 時作為多糖提取的最優(yōu)值。

由圖1E、1F 可知，提取溫度80 ℃、提取時間4 h時多糖得率最大。溫度和提取時間的增加，有助于多糖的溶出，但是溫度過高會引起多糖的降解[35]，不利于后續(xù)的回收。因此，選擇提取溫度80 ℃、提取時間4 h 時作為多糖提取的最優(yōu)值。

圖1 不同提取因素對多糖得率的影響Fig.1 Effects of different extraction factors on the yield of polysaccharides

2.1.2 Plackett-Burman 試驗設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)單因素結(jié)果設(shè)計Plackett-Burman 試驗見表4，將表4 試驗結(jié)果進行顯著性及方差分析見表5。

表4 Plackett-Burman 試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Design and results of PB experiment

根據(jù)表4 分析可得，第4 組的多糖得率最高，為17.422%，即NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）2.5%、料液比（B）1:30（g/mL）、超聲功率（C）300 W、超聲時間（D）20 min、提取溫度（E）80 ℃、提取時間（F）3 h。根據(jù)表5 分析，A、B、C、F 這4 個因素對多糖得率影響顯著（P<0.05），顯著性影響C>B>A>F，且均呈負效應(yīng)（T<0）[36]。因此，固定超聲時間20 min、提取溫度80 ℃，進一步研究A、B、C、F 之間的交互影響。

表5 Plackett-Burman 試驗方差分析Table 5 Variance analysis of PB experiment

2.1.3 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)Plackett-Burman 試驗結(jié)果，選擇4 個主效應(yīng)因素NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X1）、料液比（X2）、超聲功率（X3）、提取時間（X4）進行最陡爬坡試驗，因為此四個因素均為負因素，所以應(yīng)減小其數(shù)值，故設(shè)計最陡爬坡試驗見表6。

表6 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Design and results of the steepest ascent experiment

分析表6 最陡爬坡試驗結(jié)果，4 號的多糖得率最高，選擇4 號作為響應(yīng)面設(shè)計的中心點，即NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%、料液比為1:25（g/mL）、超聲功率200 W、提取時間2.0 h。

2.1.4 響應(yīng)面結(jié)果及分析 利用Design-Expert 10.0.7軟件的Box-Behnken 法設(shè)計響應(yīng)面試驗方案，見表7，回歸模型及方差分析見表8。

根據(jù)表7 試驗結(jié)果，運用軟件對響應(yīng)值進行分析，得到小球藻胞內(nèi)多糖提取工藝的實際因素回歸方程為：

表7 Box-Behnken 試驗設(shè)計與結(jié)果Table 7 Design and results of Box-Behnken experiment

由表8 可知，回歸模型的P值<0.0001（P<0.01），對結(jié)果影響極其顯著，失擬項P值為0.0984（P>0.05）不顯著，說明該模型充分?jǐn)M合試驗數(shù)據(jù)，誤差小，未知因素對結(jié)果干擾小[37]，不同因素對粗多糖得率的影響為X3>X2>X1>X4，即超聲功率>料液比>NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)>提取時間。該模型的決定系數(shù)為0.9801>0.9，變異系數(shù)CV 為4.61%<10%，信噪比RSN 為21.588>4.0，說明試驗結(jié)果可靠性高，相關(guān)性良好[38]。

表8 回歸方程及方差分析Table 8 Variance analysis of regression equation

通過軟件繪制的響應(yīng)面三維圖可以清晰的反映出各因素間的交互作用對多糖得率的影響，兩因素間的交互作用可以通過等高線來體現(xiàn)[39]，等高線為橢圓，說明交互作用顯著，等高線為圓形，說明交互作用不顯著。各因素對多糖得率呈拋物線，即有最大值的存在[40]。如圖2 顯示，有X4存在的三維圖，均呈馬鞍狀，無最大值的存在，其余三個因素之間均存在交互作用，有最大值的存在，其中，X2料液比和X3超聲功率的交互作用對多糖得率影響最大。

圖2 NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、超聲功率、提取時間交互作用對多糖得率影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface map of the effects of NaOH concentration,solid-liquid ratio,ultrasonic power and extraction timeon the yield of polysaccharides

2.1.5 響應(yīng)面驗證結(jié)果 根據(jù)Design-Expert 10.0.7軟件預(yù)測最優(yōu)方案為NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.965%、料液比1:24.696（g/mL）、超聲功率197.906 W、提取時間1.500 h，此時多糖得率為17.974%?？紤]到實際操作情況，并驗證響應(yīng)面結(jié)果的真實性，故選取NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%、料液比為1:25（g/mL）、超聲功率為200 W、提取時間為1.5 h，固定超聲時間20 min、提取溫度80 ℃，進行3 組試驗，取平均值。最終實際測得小球藻胞內(nèi)粗多糖得率為18.086%±0.143%，與預(yù)測結(jié)果僅相差0.112%。證明了所構(gòu)建的模型對小球藻胞內(nèi)粗多糖得率的預(yù)測是準(zhǔn)確可靠的。

2.2 小球藻胞內(nèi)粗多糖分離純化及表征

2.2.1 陰離子交換柱層析 利用超純水和不同濃度的NaCl 溶液對粗多糖溶液進行洗脫后，得到五個獨立多糖組分，從左到右依次命名為CIP-1、CIP-2、CIP-3、CIP-4、CIP-5，見圖3。其中，CIP-1 為超純水洗脫組分，為中性多糖，其余四種為不同濃度NaCl溶液洗脫組分，為酸性多糖[31]。對五種組分分別進行濃縮、冷凍干燥并回收，發(fā)現(xiàn)CIP-3 回收率最高，回收率≥35%，且CIP-3 所含多糖含量最高，故選擇CIP-3進行后續(xù)試驗。

圖3 DEAE-52 纖維素柱洗脫圖Fig.3 Eluent diagram of DEAE-52 cellulose column

2.2.2 葡聚糖凝膠柱層析 利用葡聚糖凝膠柱Sephadex G-100 對CIP-3 溶液進行洗脫，見圖4，CIP-3峰型單一對稱，表明多糖樣品的純度高[41]，且回收純度≥85%，回收濃縮并冷凍干燥CIP-3 洗脫后組分，命名為SCIP。

圖4 CIP-3 葡聚糖凝膠柱洗脫圖Fig.4 Elution diagram of CIP-3 by Sephadex G-100

2.2.3 SCIP 紫外光譜 經(jīng)紫外光譜掃描（圖5），SCIP在260 nm 和280 nm 處無吸收峰，依次表明多糖中核酸和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)已去除[42]。

圖5 SCIP 紫外光譜圖Fig.5 UV spectrum of SCIP

2.2.4 SCIP 紅外色譜 SCIP 經(jīng)傅里葉紅外光譜掃描（圖6），在3407.65 cm?1有一處寬而強的吸收峰，為-OH 的伸縮振動引起的吸收峰[43]；2931.32 cm?1為飽和C-H 的伸縮振動引起的吸收峰，說明存在鼠李糖甲基或其它飽和碳氫鍵的伸縮振動[44]；1633.44 cm?1的中強峰為糖醛酸C=O 伸縮振動引起的吸收峰[45]；1384.66 cm?1為C-H 變形振動引起的吸收峰[46]；1145.53 cm?1是吡喃環(huán)上的C-O-C 伸縮振動引起的吸收峰[47]，以上說明SCIP 是一種含有糖醛酸的吡喃糖。

圖6 SCIP 紅外光譜圖Fig.6 IR spectrum of SCIP

2.2.5 SCIP 分子量分布 通過高效凝膠滲透色譜對SCIP 分子量進行測定，見圖7，SCIP 為單一的洗脫峰，且峰型對稱，證明SCIP 為均一的純化多糖。經(jīng)計算得到lgMw-RT（重均分子量）的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=?0.1889x+12.007，R2=0.9943，x 為保留時間，本試驗為42.425 min，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算SCIP 的分子量為9838 Da。

圖7 SCIP 分子量分布圖Fig.7 Molecular weight distribution of SCIP

2.2.6 SCIP 單糖組成 16 種混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品和SCIP離子色譜圖如圖8 所示，SCIP 是由9 種單糖組成的均一多糖。出峰時間和摩爾比如圖8、表9 所示，分析可得，葡萄糖和鼠李糖及半乳糖含量最高，摩爾比為0.300:0.190:0.163，說明SCIP 主要由葡萄糖、鼠李糖及半乳糖成分組成。

圖8 SCIP 單糖組成分析圖Fig.8 Monosaccharide composition analysis of SCIP

表9 SCIP 單糖組成Table 9 Monosaccharide composition of SCIP

2.3 SCIP 體外抗氧化能力研究

SCIP 對DPPH 自由基的清除率如圖9（a）所示，當(dāng)多糖濃度從0.5 mg/mL 增加到12 mg/mL 時，對DPPH 自由基的清除率迅速上升，從12 mg/mL 增加到20 mg/mL 時，增長速度平緩。SCIP 質(zhì)量濃度在20 mg/mL 時，對DPPH 自由基的清除能力達到最大為75.64%±1.56%，IC50為6.42 mg/mL。

SCIP 對OH 自由基的清除率如圖9（b）所示，當(dāng)多糖濃度從0.5 mg/mL 增加到5 mg/mL 時，對OH 的自由基清除率迅速上升，從10 mg/mL 增加到25 mg/mL 時，增長速度平緩。SCIP 質(zhì)量濃度在25 mg/mL 時，對OH 自由基的清除能力達到最大為71.08%±0.58%，IC50為8.59 mg/mL。孫建瑞等[48]研究表明C.vulgaris224 胞內(nèi)多糖對DPPH 自由基的清除率在60 mg/mL 最高可達到61.62%，對羥基自由基的清除率在30 mg/mL 時超過50%。本試驗得到的小球藻胞內(nèi)多糖純化組分SCIP 抗氧化活性相比而言有所提升。

圖9 SCIP 體外抗氧化能力Fig.9 Antioxidant activity of SCIP in vitro

3 結(jié)論

本研究采用響應(yīng)面法對小球藻粗多糖提取過程中的6 個條件進行探索，最終確定粗多糖得率的最適值，即NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%，料液比為1:25（g/mL），超聲功率為200 W，超聲時間為20 min，提取溫度為80 ℃，提取時間為1.5 h，在此條件下，小球藻胞內(nèi)粗多糖的得率為18.086%±0.143%。

采用DEAE-52 纖維素柱和葡聚糖凝膠柱Sephadex G-100 對小球藻胞內(nèi)粗多糖進行分離純化得到均一組分SCIP。SCIP 是一種含有糖醛酸的吡喃糖，分子量為9838 Da，主要由葡萄糖、鼠李糖及半乳糖成分組成。對SCIP 進行抗氧化試驗，對DPPH自由基的清除率在20 mg/mL 達到最大為75.64%±1.56%，IC50為6.42 mg/mL，對OH 自由基的清除率在25 mg/mL 時最大為71.08%±0.58%，IC50為8.59 mg/mL，表明小球藻胞內(nèi)多糖具有良好的抗氧化能力，有望應(yīng)用到天然抗氧化劑開發(fā)等方面，同時在醫(yī)藥和功能食品中具有廣闊的應(yīng)用前景。