蝦夷扇貝肌肉絲氨酸蛋白酶的研究

任秋穎，謝 淵，翁 凌，張凌晶，章 騫，劉光明，曹敏杰,2,3,

（1.集美大學食品與生物工程學院，福建廈門 361021；2.水產(chǎn)品深加工技術國家地方聯(lián)合工程中心，福建廈門 361021；3.海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，大連工業(yè)大學，遼寧大連 116034）

扇貝是我國主要經(jīng)濟貝類，2020 年，全國扇貝養(yǎng)殖產(chǎn)量達175 萬噸[1]。扇貝的主要食用部位是閉殼肌，肉質(zhì)細嫩、味道鮮美、營養(yǎng)豐富，具有很高的食用價值，深受消費者喜愛[2]。扇貝蛋白質(zhì)含量豐富，脂肪、碳水化合物含量低，是優(yōu)質(zhì)的蛋白源。此外，還含有較豐富的維生素A、維生素B 族、維生素E 等[3?4]。

扇貝收獲后的運輸過程中，為了保持和延長其新鮮度和適口性，需要采取良好的冷藏手段[5]。對去殼后的扇貝閉殼肌而言，在冷藏過程中，其質(zhì)地、風味等感官品質(zhì)會不可避免發(fā)生下降，對產(chǎn)品的商品價值產(chǎn)生不利影響[6]。這主要是因為水產(chǎn)動物死后，維持肌肉結構特性的肌原纖維蛋白和結締組織蛋白等結構蛋白發(fā)生變化，包括肌纖維斷裂、保水性能降低等[7?9]。研究發(fā)現(xiàn)，由內(nèi)源蛋白酶水解蛋白質(zhì)引起的肌肉蛋白結構變化是影響水產(chǎn)動物蛋白質(zhì)地下降的主要原因[10?12]。例如，羅氏沼蝦在冷藏期間，絲氨酸蛋白酶的作用使其肌肉軟化、品質(zhì)下降[13]。魚類肌肉中肌原纖維結合型絲氨酸蛋白酶對肌球蛋白重鏈的降解引起魚糜制品的凝膠劣化[14?15]。扇貝中結構蛋白的完整性與肌肉質(zhì)地指標密切相關。最近，有學者對海灣扇貝的研究表明，絲氨酸蛋白酶可以同時降解肌原纖維蛋白和結締組織蛋白，進而改變肌肉微觀結構，使其持水力降低，最終引起扇貝肌肉質(zhì)地的劣化[16]。

絲氨酸蛋白酶（Serine proteinase，SP）是蛋白酶家族中的重要一員，作為內(nèi)肽酶，SP 特異性作用于大分子蛋白質(zhì)中肽鍵C 端的精氨酸或賴氨酸殘基，使之斷裂成為小分子蛋白質(zhì)或多肽。該酶的關鍵活性位點通常是一組含有絲氨酸、組氨酸和天冬氨酸的催化三聯(lián)體。在無脊椎動物中，絲氨酸蛋白酶及其同源物廣泛存在并被證明在生物體的各種生理生化過程發(fā)揮重要作用[17?19]。作為主要經(jīng)濟貝類，扇貝在冷藏加工過程中的品質(zhì)保持尤為重要。但是，對影響扇貝品質(zhì)的絲氨酸蛋白酶的分離純化和性質(zhì)研究尚未有報道。因此，本研究擬以蝦夷扇貝為研究對象，探究其閉殼肌在冷藏過程中的質(zhì)地變化，并分離純化出絲氨酸蛋白酶，對其酶學性質(zhì)進行研究，以期為貝類在保鮮貯藏和加工過程的品質(zhì)保持提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原產(chǎn)河北秦皇島的鮮活蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis） 廈門市集美區(qū)新華都商場，去殼后貝柱個體重量（15±0.5）g；DEAE-Sepharose、Superdex 200、Phenyl-Sepharose 美國GE Healthcare 公司；Boc-Phe-Ser-Arg-MCA 等各類熒光合成底物 日本Peptide Institute 公司；蛋白酶抑制劑：PMSF、EDTA、EGTA、1,10-phenanthroline 美國Sigma 公司；E-64、Leupeptin、Triton X-100 美國Amresco公司；Pefabloc 德國SC Roche 公司；牛明膠 美國Genebase 公司。

Avanti J-26S XP 高速冷凍離心機 美國Beckman 公司；Centrifuge 5417 小型冷凍離心機 德國Eppendorf 公司；UB-7 Starter 3100 pH計美國Ohaus公司；UPC900 AKTA 蛋白純化系統(tǒng) 美國GE Healthcare 公司；FP-8200 熒光分光光度計 日本Jasco公司；TA new plus 質(zhì)構儀 美國Isenso 公司；WB-10L1數(shù)顯恒溫水浴鍋 德國Memmert 公司；PT-2100 組織破碎機 瑞士Kinematica 公司；G-BOX 凝膠成像儀 英國Syngene 公司；Mini-PROTEAN 垂直電泳槽 美國Bio-Rad 公司；ND-1000 微量蛋白核酸測定儀 美國Nano Drop 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 冷藏過程中肌肉質(zhì)構相關指數(shù)的測定 參照游銀川[20]的方法稍加改動，具體方法為新鮮蝦夷扇貝，去殼去內(nèi)臟團，取其肌肉，浸泡于0.2% NaN3溶液中5 min，瀝干后用自封袋真空密封，儲藏于4 ℃，每隔24 h 取樣直至一周。

1.2.1.1 冷藏過程中肌肉質(zhì)構參數(shù)（TPA）的測定參照游銀川[20]的方法稍加改動，具體方法為將蝦夷扇貝貝柱肌肉裁剪成高（15.0±0.1）mm、直徑（35.0±0.2）mm 的圓柱體，采用TA new plus質(zhì)構儀，通過P/36R 探頭，對樣品進行全質(zhì)構分析（TPA）。壓縮變形模量為25%，探頭速度為1.0 mm/s，每個樣品分別進行2 次循環(huán)壓縮分析，循環(huán)之間的松弛時間為5 s。得到硬度、咀嚼性、粘性和彈性等質(zhì)構參數(shù)。每組數(shù)據(jù)用4 個貝柱獨立測定，取其平均值。

1.2.1.2 冷藏過程肌肉全蛋白的降解 參照游銀川[20]的方法稍加改動，具體方法為取2 g 扇貝肌肉，加入4倍含0.15 mol/L NaCl 的20 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）緩沖液，組織搗碎后離心（3000×g，4 ℃，5 min），取上清，即為肌肉全蛋白。樣品加入SDS 化緩沖液，振蕩混勻，95 ℃加熱10 min 后4 ℃保存。采用SDS-PAGE對肌肉全蛋白降解進行分析。

1.2.1.3 冷藏過程絲氨酸蛋白酶酶活力的測定方法參照游銀川[20]的方法稍加改動，具體方法為取2 g扇貝肌肉，加入4 倍體積的20 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）緩沖液，組織搗碎后離心（12000×g，4 ℃，15 min），上清即為測定內(nèi)源酶粗酶活力的樣品。

酶活力測定參照林怡晨等[21]的方法稍加改動，具體方法為，以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA 為絲氨酸蛋白酶底物測定酶活力。取50 μL 粗酶液置于900 μL 20 mmol/L Tris-HCl（pH9.0）緩沖液中，加入50 μL濃度為10 μmol/L 的底物后，振蕩混勻后在37 ℃下孵育10 min，立即加入1.5 mL 終止液（甲醇:正丁醇:蒸餾水=35:30:35，v/v/v）終止反應。用熒光分光光度計在激發(fā)波長380 nm，發(fā)射波長450 nm 下測定釋放的7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin，AMC）的熒光強度。酶活力單位（U）定義為每分鐘釋放1 nmol AMC 所需要的酶量。以同樣的反應體系但不加酶液（緩沖液替代）的樣品為空白對照組。

1.2.2 絲氨酸蛋白酶的分離純化 所有純化過程均在4 ℃或冰上進行。將250 g 蝦夷扇貝肌肉加入4 倍體積的20 mmol/L Tris-HCl（pH9.0）緩沖液，組織搗碎后離心（12000×g，4 ℃，20 min），上清進行30%～60%硫酸銨鹽析，離心后將沉淀用少量的緩沖液溶解，用20 mmol/L Tris-HCl（pH9.0）緩沖液充分透析后離心（12000×g，4 ℃，20 min），上清液用4 層紗布過濾后上樣于DEAE-Sepharose 離子交換層析柱。先用20 mmol/L Tris-HCl（pH9.0）緩沖液流洗，再用含0.5 mol/L NaCl 的緩沖液進行線性洗脫，收集目的蛋白組分，用10 kDa 的超濾濃縮膜濃縮至3 mL。隨后上樣于Superdex 200 凝膠過濾柱，用20 mmol/L Tris-HCl（pH9.0）緩沖液洗脫，收集目的蛋白組分加入（NH4）2SO4至終濃度為1.0 mol/L，然后上樣于Phenyl-Sepharose 疏水層析柱（5 mL）。用含1.0 mol/L（NH4）2SO4的緩沖液洗脫，收集目的蛋白組分，用20 mmol/L Tris-HCl（pH9.0）緩沖液充分透析，再次上樣于DEAE-Sepharose 柱層析（5 mL），洗脫收集目的蛋白組分即為高度純化的絲氨酸蛋白酶。

1.2.3 SDS-PAGE 和明膠酶譜分析 SDS-PAGE 凝膠為12%分離膠和5%濃縮膠。明膠酶譜參考麻金花等[22]的方法，略作修改，分離膠中用 0.5 mL 濃度為10 mg/mL 明膠替換 0.5 mL 去離子水，其余與SDS-PAGE 膠的制備相同。4 ℃條件下電泳結束，用2.5% Triton X-100 孵育20 min，洗去SDS。然后置于20 mmol/L Tris-HCl（pH9.0）緩沖液中，于37 ℃下孵育14 h?？捡R斯亮藍R-250 染色后，凝膠未著色的亮帶表示明膠被蛋白酶降解，鑒定蛋白酶對明膠的分解活性。

1.2.4 扇貝肌肉絲氨酸蛋白酶的酶學性質(zhì)分析

1.2.4.1 最適溫度及熱穩(wěn)定性分析 測定SP 的最適溫度，以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA 為底物，在10、20、30、35、37、40、50、60、70 ℃等溫度下測定酶活力。將酶活力最高所對應溫度的相對活力定義為100%，以此來判定其它溫度下的相對酶活力。

測定SP 的熱穩(wěn)定性，將SP 于上述不同溫度下孵育30 min 并冷卻至室溫后，在37 ℃下測定相對酶活力。

1.2.4.2 最適pH 及pH 穩(wěn)定性分析 測定SP 的最適pH，以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA 為底物，在不同pH（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0）下測定酶活力。將酶活力最高pH 下的相對活力定義為100%，以此來判定其他pH 下的相對酶活力。

測定SP 的pH 穩(wěn)定性，將SP 置于不同pH（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0）緩沖液中，4 ℃孵育4 h 后，在20 mmol/L Tris-HCl（pH9.0）緩沖液中測定酶活力。

各pH 所用緩沖液：pH4.0～5.0 為20 mmol/L HAc-NaAc 緩沖液、pH6.0 為20 mmol/L PBS 緩沖液、pH7.0～9.0 為20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液、pH10.0～11.0 為20 mmol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液。

1.2.4.3 底物特異性分析 參照林怡晨等[21]的方法稍加改動，具體方法為采用Boc-Phe-Ser-Arg-MCA等各類熒光合成底物，參照酶活力測定方法來分析SP 對不同底物的水解能力。以熒光值最高的底物為空白對照。

1.2.4.4 蛋白酶抑制劑對SP 活力的影響 參照林怡晨等[21]的方法稍加改動，具體方法為將PMSF，EDTA，EGTA，1,10-phenanthroline 等蛋白酶抑制劑與SP混勻后4 ℃下孵育30 min，測定剩余酶活力。以不加抑制劑的樣品為對照。

1.2.4.5 金屬離子對SP 酶活力的影響 在20 mmol/L Tris-HCl（pH9.0）緩沖液中，加入50 μL 的酶液，加入不同金屬離子（Mn2+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+、Ba2+）至終濃度分別為0.01、0.05和0.1 mmol/L，混勻后室溫下孵育30 min，在37 ℃下進行酶活力測定。以不加金屬離子的樣品為對照。

1.2.5 絲氨酸蛋白酶對蝦夷扇貝肌原纖維的分解參考Cao 等[23]的方法提取肌原纖維蛋白。具體方法為：取10 g 扇貝肌肉，加入10 倍體積20 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）緩沖液，組織搗碎后離心（8000×g，4 ℃，10 min），取沉淀重復該步驟4 次后，將沉淀溶于含0.5 mol/L NaCl 的20 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）緩沖液，即為肌原纖維蛋白。

取上述制備的肌原纖維蛋白50 μL，溶于220 μL含0.5 mol/L NaCl 的20 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）緩沖液中，加入30 μL 絲氨酸蛋白酶，37 ℃反應0、5、10、15、30、60、90、120 min，分別取出10 μL 加入10 μL 4×SDS 緩沖液混勻后，進行SDS-PAGE 分析。以不加酶的肌原纖維在37 ℃孵育120 min 為對照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有實驗數(shù)據(jù)均重復3 次進行測定。應用Origin 8.0 軟件進行繪圖，Image J 軟件進行光密度分析。

2 結果與分析

2.1 冷藏過程中肌肉質(zhì)構相關指數(shù)的變化

2.1.1 冷藏過程中肌肉的質(zhì)構參數(shù)（TPA） 對蝦夷扇貝在冷藏過程中的質(zhì)構變化進行測定，結果如表1所示。與新鮮樣品相比，冷藏1 d，扇貝肌肉的硬度由670±42 gf 增至736±52 gf，粘性321±2 gf 增至372±17 gf，彈性0.34±0.07 gf 增至0.37±0.04 gf，除咀嚼性外，都有增加。這與海灣扇貝[24]、鯛魚[25]和蝦[26]等有相同的變化趨勢，推測這是由于蝦夷扇貝肌肉冷藏1 d 期間發(fā)生僵直所致。在此后的整個貯藏過程中，肌肉硬度、彈性、咀嚼性和粘性均不斷下降，肉質(zhì)劣化。水產(chǎn)動物肌肉在冷藏過程中的質(zhì)構變化有類似之處，如鮭魚（Salmo salar）在冷藏期間肌肉容易變軟、失去彈性，硬度下降等現(xiàn)象[27]。

表1 冷藏過程中蝦夷扇貝肌肉質(zhì)構參數(shù)變化Table 1 The change of texture parameters in Yesso callop muscle during cold storage

2.1.2 冷藏過程中肌肉蛋白的自身降解 采用SDSPAGE 對蝦夷扇貝肌肉全蛋白進行分析，以確定冷藏中蛋白的變化。肌原纖維蛋白是肌肉中的主要蛋白質(zhì)[8]。隨著冷藏時間的延長，全蛋白逐漸降解，觀察到肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）（200 kDa）和肌動蛋白（Actin）（45 kDa）條帶濃度逐漸減弱（圖1A）。對其進行光密度分析密度，結果顯示MHC 和肌動蛋白的蛋白含量逐漸降低（圖1B），表明冷藏過程中以肌球蛋白重鏈為代表的肌肉結構蛋白逐漸降解。有研究證明，肌球蛋白重鏈是肌原纖維蛋白中最容易被分解的蛋白[11,28]。此外，分子量為62 kDa 的蛋白也在冷藏2 d 后發(fā)生明顯降解。分子量為100 kDa 的副肌球蛋白是貝類的特征蛋白，該蛋白穩(wěn)定性良好，在7 d 的冷藏過程中幾乎沒有發(fā)生降解。水產(chǎn)動物結構蛋白在冷藏過程中隨著時間的推移而降解是普遍現(xiàn)象，而內(nèi)源性蛋白酶的作用是導致結構蛋白降解，肌肉質(zhì)構下降的主要原因[29]。

圖1 蝦夷扇貝冷藏過程中肌肉蛋白的自身降解（A）和光密度分析（B）Fig.1 Protein degradation in Yesso scallop muscle during cold storage (A) and densitometry analysis (B)

2.1.3 冷藏過程中絲氨酸蛋白酶酶活力水平的變化對冷藏過程中蝦夷扇貝絲氨酸蛋白酶的酶活力進行測定（圖2）。結果發(fā)現(xiàn)，絲氨酸蛋白酶酶活力在2 d后開始下降。內(nèi)源蛋白酶水解蛋白質(zhì)引起肌肉蛋白結構的破環(huán)與質(zhì)地下降密切關聯(lián)[10?11]。內(nèi)源性蛋白酶中，最適pH 為弱堿性的絲氨酸蛋白酶可同時降解肌原纖維蛋白和結締組織蛋白[28]。對海灣扇貝的相關研究結果顯示，絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF 顯著抑制了扇貝冷藏過程中肌球蛋白重鏈（MHC）和肌動蛋白（Actin）的降解，說明絲氨酸蛋白酶是導致肌原纖維主要結構蛋白降解的酶[16]。因此，內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶值得重點關注。

圖2 蝦夷扇貝肌肉冷藏過程中絲氨酸蛋白酶活力的變化Fig.2 Changes of SP activity in Yesso scallop muscle during cold storage

2.2 絲氨酸蛋白酶的純化結果

通過30%～60%飽和度硫酸銨鹽析從蝦夷扇貝肌肉中提取SP 粗酶液，上樣于預先平衡好的DEAE-Sepharose 陰離子交換層析柱。圖3A 顯示，酶活性峰在0.25～0.5 mol/L NaCl 下被洗脫下來。將樣品濃縮后經(jīng)Superdex 200 凝膠過濾層析柱，可去除小部分的低分子量蛋白（圖3B）。收集活性峰后上樣于Phenyl-Sepharose 疏水層析柱，目的蛋白酶在（NH4）2SO4濃度為0 mol/L 時被洗脫下來（圖3C）。收集活性峰后上樣于DEAE-Sepharose（圖3D），收集25～40 管樣品，用10 kDa 超濾濃縮管濃縮后進行SDS-PAGE 分析，經(jīng)過連續(xù)柱層析可獲得高純度目的蛋白酶樣品用于后續(xù)實驗。

圖3 絲氨酸蛋白酶分離純化柱層析圖Fig.3 Chromatography for purification of SP

對純化蛋白的SDS-PAGE 和明膠酶譜分析結果顯示，該酶主要以分子量為52 kDa 的形式存在。但在還原條件下明膠酶譜結果出現(xiàn)有降解明膠的分子量為52 kDa 和26 kDa 的2 個條帶（圖4，泳道2），推測其在天然條件下存在兩種結構，即單體和二聚體，單體的分子量為26 kDa，二聚體的分子量為52 kDa（圖4）。其單體分子量26 kDa 和南美白對蝦（28 kDa）[30]消化腺中分離純化得到的絲氨酸蛋白酶相近，但與皺紋盤鮑（34 kDa）[31]中克隆表達得到的絲氨酸蛋白酶不同，提示不同物種中絲氨酸蛋白酶的差異性。

圖4 蝦夷扇貝SP 的SDS-PAGE 和明膠酶譜分析Fig.4 SDS-PAGE and gelatin zymography of SP from Yesso scallop

2.3 SP 的酶學性質(zhì)分析

2.3.1 最適溫度和熱穩(wěn)定性 由圖5 可知，SP 酶活力的最適溫度為37 ℃，即便在10 ℃時，SP 仍有最高活性的40%。根據(jù)熱穩(wěn)定性結果分析，在溫度40 ℃以下，酶活力能夠保持較高水平，40 ℃以上酶活力急劇降低，70 ℃時SP 基本失活。說明該酶屬于低溫酶，在低溫下能較好保持絲氨酸蛋白酶酶活力。該結果與來自南美白對蝦[30]、藍圓鲹[32]等水產(chǎn)動物中的絲氨酸蛋白酶性質(zhì)相似，都屬于低溫酶，應與它們生活環(huán)境溫度有關。

圖5 蝦夷扇貝絲氨酸蛋白酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性分析Fig.5 Optimum temperature and thermal stability of SP from Yesso scallop

2.3.2 SP 最適pH 和pH 穩(wěn)定性 由SP 的pH 性質(zhì)分析結果可知，圖6 表明，SP 在pH9.0 條件下相對酶活力最高，即pH9.0 為SP 最適pH；在pH8.0～11.0 條件范圍內(nèi)，SP 的酶活力都較為穩(wěn)定，當pH 小于7.0 時，SP 酶活力急劇下降，在pH6.0 條件下SP活性只有18%。在pH 穩(wěn)定性方面，SP 在pH7.0～11.0條件下，酶活力能夠穩(wěn)定保持在較高水平；pH5.0 時，SP 活性基本失活。表明SP 為一種弱堿性酶。這和南美白對蝦[30]消化腺中SP 及藍圓鲹[32]中SP 結果相似。但蝦夷扇貝SP 的耐堿性更好，在pH8.0～11.0范圍內(nèi)，SP 酶活力都能穩(wěn)定保持在80%以上，而南美白對蝦[30]SP 在pH11.0 時，其酶活力基本失活。SP 為弱堿性蛋白酶的性質(zhì)可能對肌肉在冷藏過程前期肌原纖維蛋白降解有影響。

圖6 蝦夷扇貝絲氨酸蛋白酶的最適pH 及pH 穩(wěn)定性分析Fig.6 Optimum pH and pH stability of SP from Yesso scallop

2.3.3 底物特異性研究 為了分析SP 的底物特異性，選用幾種不同類型的熒光底物，結果如表2 所示。結果表明，SP 特異性水解羧基側P1位置含有精氨酸或賴氨酸殘基的底物，特別是對Boc-Gln-Ala-Arg-MCA 的相對活力最高，其次是Boc-Leu-Lys-Arg-MCA、Boc-Ala-Gly-Pro-Arg-MCA 和Boc-Phe-Ser-Arg-MCA，對Boc-Val-Pro-Arg-MCA、Boc-Glu-Lys-Lys-MCA 等類蛋白酶的水解率分別為82%和36%。而該酶對糜蛋白酶的底物Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA 或Suc-Ala-Ala-Pro-MCA 無活性。該酶也不能水解氨肽酶底物Arg-MCA。與大多數(shù)水產(chǎn)動物絲氨酸蛋白酶結果相似，SP 對組織蛋白酶類底物（Z-Phe-Arg-MCA、Z-Arg-Arg-MCA）也有微弱的水解能力。底物特異性表明該酶為類胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶。

表2 蝦夷扇貝絲氨酸蛋白酶的底物特異性分析Table 2 Substrate characterization of the SP from Yesso scallop

2.3.4 不同蛋白酶抑制劑對SP 的影響 由表3 可知，絲氨酸蛋白酶抑制劑Pefabloc SC、Benzamidine和胰蛋白酶抑制劑Leupeptin 均能明顯抑制SP 活性。當PMSF 濃度為1 mmol/L 時，對SP 的抑制作用不明顯，但當濃度增至10 mmol/L 時，幾乎能夠完全抑制其活性。金屬離子蛋白酶抑制劑EGTA 和1,10-phenathroline 對絲氨酸蛋白酶均有不同程度的抑制作用。半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64 對該酶活力有微弱的抑制作用。結合底物特異性和蛋白酶抑制劑結果表明，SP 為一種類胰蛋白酶的絲氨酸蛋白酶。

表3 蛋白酶抑制劑對絲氨酸蛋白酶活力的影響Table 3 Inhibitory effect of different proteinase inhibitors on the activity of SP

2.3.5 不同金屬離子對SP 的影響 由抑制劑結果得知SP 酶活力可能與金屬離子有關，由表4 可知，F(xiàn)e2+、Zn2+、Cu2+能夠明顯抑制SP 的酶活力，在0.1 mmol/L時，F(xiàn)e2+可抑制其初始活性的83%。Zn2+對SP 酶活力的抑制作用與濃度相關，0.01 mmol/L 時只抑制其活性10%，0.05 mmol/L 時抑制其64%活性，濃度增至0.1 mmol/L 抑制84%的SP 活性。0.01 mmol/L Ca2+能夠抑制SP 約50%的酶活力；0.1 mmol/L 的Ba2+能抑制約20%酶活；而Mg2+、Mn2+對SP 酶活力幾乎沒有明顯的抑制作用。該結果與藍圓鲹中SP 的性質(zhì)有差異，表明不同物種SP 其性質(zhì)略有不同[32]。

表4 金屬離子對絲氨酸蛋白酶活力的影響Table 4 Effect of metal ions on the activity of SP

2.3.6 絲氨酸蛋白酶對蝦夷扇貝肌肉肌原纖維的分解 為探究絲氨酸蛋白酶對蝦夷扇貝肌原纖維蛋白的作用，將扇貝肌原纖維蛋白后與絲氨酸蛋白酶在37 ℃下孵育后進行SDS-PAGE 分析。由圖7 可知，隨著反應時間延長，肌原纖維蛋白逐漸被降解為小分子蛋白片段。反應120 min 后，肌球蛋白重鏈幾乎被完全降解。結果證明，絲氨酸蛋白酶是參與蝦夷扇貝肌肉蛋白降解的主要蛋白酶之一，對蝦夷扇貝肌肉冷藏過程中質(zhì)構變化有顯著的影響。

圖7 絲氨酸蛋白酶對蝦夷扇貝肌肉肌原纖維的分解作用Fig.7 Effect of SP on myofibrillar proteins of Yesso scallop muscle

3 結論

蝦夷扇貝肌肉在4 ℃的冷藏過程中，質(zhì)地逐漸劣化，肌肉結構蛋白逐漸降解，特別是肌球蛋白重鏈有明顯的降解趨勢，絲氨酸蛋白酶活力整體呈持續(xù)下降趨勢。從蝦夷扇貝肌肉中分離純化得到一種絲氨酸蛋白酶，推測其單體的分子量為26 kDa，二聚體的分子量為52 kDa。SP 的最適溫度為37 ℃，最適pH 為9.0，特異性水解羧基側P1位含有精氨酸或賴氨酸殘基的底物。絲氨酸蛋白酶特異性抑制劑（Pefabloc SC、Benzamidine、PMSF）和胰蛋白酶抑制劑（Leupeptin）能明顯抑制SP 的酶活力；金屬離子Fe2+、Zn2+、Cu2+對SP 有明顯的抑制作用。從SP對蝦夷扇貝肌肉的分解作用可推測其參與扇貝死后肌肉結構蛋白自身降解，進而影響其肌肉質(zhì)構。但關于SP 的更詳細情況，如一級結構，內(nèi)源性抑制劑存在情況等需要進一步研究。