食用木薯塊根凍結(jié)特性及代謝產(chǎn)物分析

林立銘，王琴飛，余厚美，徐 緩，張振文

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所/國家薯類加工專業(yè)技術(shù)研發(fā)分中心，海南儋州 571737）

木薯（Manihot esculentaCrantz.）是重要的熱帶糧食作物，其塊根收獲時(shí)的機(jī)械損傷會(huì)使其在采后72 h 內(nèi)迅速腐爛。據(jù)報(bào)道[1]，全球每年因采后腐爛而損失的可達(dá)到總產(chǎn)量的10%～30%，已成為制約木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。隨著產(chǎn)業(yè)發(fā)展目標(biāo)從“工業(yè)化”向“食用化”過渡轉(zhuǎn)型，貯藏保鮮技術(shù)顯得格外重要。冷凍貯藏（?20 ℃）是目前最常用且有效的保鮮方式，在廣西南寧、廣東化州等地廣泛應(yīng)用，但成本頗高，且極有可能造成風(fēng)味流失[2]。冰溫技術(shù)是指一種在冰點(diǎn)溫度范圍內(nèi)貯藏果蔬等新鮮食品的貯藏技術(shù)，可最大程度地降低果品、生鮮等活體呼吸速率，從而抑制病原微生物滋生，進(jìn)一步延長果品的貯藏期和保質(zhì)期[3]。冰點(diǎn)是食品冷藏保鮮加工的重要熱物性參數(shù)之一，果蔬冰點(diǎn)的確定對(duì)低溫冷卻、凍傷機(jī)理以及冷藏冷凍加工的研究具有重要意義[4?6]。然而，目前的研究工作主要圍繞生理生化指標(biāo)與貯藏效果等展開，關(guān)于保持其品質(zhì)的影響機(jī)理鮮見報(bào)道，不利于冰溫貯藏技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

有研究表明，果蔬冰點(diǎn)與可溶性固形物含量呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)水平[7?9]，而林向東等[10]的研究結(jié)果表明，原料含水量不同，冰點(diǎn)也不相同。王丹等[11]通過研究桑葚凍結(jié)特性發(fā)現(xiàn)，個(gè)體差異、不同物態(tài)對(duì)冰點(diǎn)影響較大；與一般果蔬不同，高淀粉類果蔬的結(jié)晶釋放較高潛熱對(duì)冰點(diǎn)造成影響[12]。而有關(guān)冬棗冰點(diǎn)的研究顯示，其冰點(diǎn)因果實(shí)成熟度、含糖量等不同而有所差異[13]?？梢姡P(guān)于物料凍結(jié)特性的研究不僅需要考慮內(nèi)含物質(zhì)的區(qū)別，同時(shí)還要兼顧物料表觀特征。

研究顯示，木薯塊根不同部位的營養(yǎng)成分存在極顯著差異[14]。因此，本研究將通過測(cè)定食用木薯塊根不同部位隨溫度下降電導(dǎo)率的變化情況，確定其冰點(diǎn)溫度范圍，了解凍結(jié)特性，分析塊根含水量、可溶性固形物及淀粉含量與冰點(diǎn)的關(guān)系；利用非靶向代謝組學(xué)研究代謝產(chǎn)物的變化，為木薯塊根低溫儲(chǔ)藏技術(shù)提供理論支撐，也為今后木薯食用化利用技術(shù)的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

食用木薯（指新鮮塊根氫氰酸含量低于50 mg/kg的木薯品種）：華南9 號(hào)（South China 9,SC9） 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，種植時(shí)間為10 個(gè)月；二水合氯化鈣、醋酸、硫酸鋅、氯化亞鐵、無水乙醇、亞鐵氰化鉀 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

CP213 電子天平 中國奧豪斯儀器有限公司；HH-S6 恒溫水浴鍋、XH-C 旋渦混合器 金壇儀器廠；DAX-9053 恒溫干燥箱 上海福碼公司；H3-18 KR 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南可成儀器設(shè)備有限公司；FE38 電導(dǎo)率測(cè)試儀 上海右一儀器有限公司；PAL-1 糖度計(jì) 上海安儀科學(xué)儀器有限公司；WZZ-2B 旋光儀 上海精密儀器儀表公司；HS-S 數(shù)顯恒溫油浴鍋 常州隆和儀器制造有限公司；Q Exactive?HF-X 質(zhì)譜儀、Vanquish UHPLC 色譜儀、色譜柱Hypesil Gold column（100×2.1 mm,1.9 μm） Thermo Fisher。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 木薯預(yù)處理 鮮木薯塊根收獲后，隨機(jī)選取無腐爛的薯塊，洗凈去皮。為充分研究塊根營養(yǎng)成分對(duì)凍結(jié)參數(shù)的影響，參照魏艷等[14]的方法將整條薯從頭部、中部和尾部橫切取樣（如圖1），根據(jù)電導(dǎo)率儀兩極孔隙大小分別將各部位切成長方體小塊（長、寬、高約2.0 cm×1.0 cm×0.5 cm），以保證薯塊與電極能夠緊密接觸，長方體小塊用于凍結(jié)參數(shù)測(cè)定，其它樣品置于烘箱中，60 ℃烘干后粉碎過80 目篩，用于其它指標(biāo)的測(cè)定。

圖1 塊根取樣示意圖Fig.1 Sampling for cassava root

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.2.2.1 塊根凍結(jié)參數(shù) 參考宋麗榮等[15]的方法，將電導(dǎo)率測(cè)定儀探頭置于蒸餾水中，打開儀器，預(yù)熱5～10 min；將固態(tài)食品物料切成大小適宜的長方體嵌入電導(dǎo)率儀兩極之間，使物料與之緊密接觸，將電極探頭置于?20 ℃的密閉冷凍環(huán)境中，每分鐘記錄1 次溫度值,待溫度和電導(dǎo)率不再發(fā)生變化時(shí)可結(jié)束測(cè)定；將記錄的溫度值和對(duì)應(yīng)的時(shí)間數(shù)據(jù)輸入Excel 表格中，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，溫度值為縱坐標(biāo)，作出點(diǎn)線曲線圖。

1.2.2.2 含水量（Water content,WC） 采用GB 5009.3-2016 《食品中水分的測(cè)定》[16]。

1.2.2.3 可溶性固形物（Total soluble substance,TSS）

采用NY/T 2637-2014 《水果、蔬菜可溶性固形物含量的測(cè)定 折射儀法》[17]。

1.2.2.4 淀粉含量（Starch content，SC） 采用GB/T 20378-2006 《原淀粉 淀粉含量的測(cè)定 旋光法》[18]。

1.2.3 代謝組學(xué)分析 樣品處理：參考Kim 等[19]的方法，塊根洗凈去皮，冰水浴處理1 h（經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)得出，塊根冰水浴1 h 時(shí)內(nèi)部溫度已達(dá)到冰溫）；然后隨機(jī)稱取250 mg 樣品，分裝至2 mL 離心管中，用錫箔紙包裹并標(biāo)記后，放入液氮中冷凍處理至少15 min。取出后迅速放入自封袋中（每組一袋），在自封袋中放入標(biāo)簽紙標(biāo)明樣本信息后迅速放入?80 ℃冰箱凍存待測(cè)，標(biāo)記為C60。以未經(jīng)冰水浴處理的樣品為對(duì)照，標(biāo)記為C0。

代謝物提?。簠⒖糤ant 等[20]的方法，取100 mg液氮研磨的組織樣本，置于EP 管中，加入500 μL 含0.1%甲酸的80%甲醇水溶液，渦旋振蕩，冰浴靜置5 min，15000 r/min、4 ℃離心10 min，取一定量的上清加質(zhì)譜級(jí)水稀釋至甲醇含量為53%，并置于離心管中15000 r/min、4 ℃離心10 min，收集上清，進(jìn)樣LC-MS 進(jìn)行分析。

質(zhì)控（QC）樣本：從每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本中取等體積樣本混勻作為QC 樣本。

空白（blank）樣本：含0.1%甲酸的53%甲醇水溶液代替實(shí)驗(yàn)樣本，前處理過程與實(shí)驗(yàn)樣本相同。

色譜條件：色譜柱：Hypesil Gold column（C18）；柱溫：40 ℃；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：100 μL；掃描范圍選擇m/z 70～1050；正模式：流動(dòng)相A：0.1%甲酸，流動(dòng)相；B：甲醇；負(fù)模式：流動(dòng)相A：5 mmol/L 醋酸銨，pH9.0；流動(dòng)相 B：甲醇。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)操作均重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±SD 表示。利用Excel 2010 制作圖表，顯著性和相關(guān)性分析采用SAS 8.1 進(jìn)行分析。方差分析中P<0.05 表示差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過KEGG PATHWAY數(shù)據(jù)庫（https://www.genome.jp/kegg/pathway.html）、HMDB 數(shù)據(jù)庫（https://hmdb.ca/metabolites）、LIPID MAPS 數(shù)據(jù)庫（http://www.lipidmaps.org）對(duì)鑒定到的代謝物進(jìn)行注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 食用木薯塊根凍結(jié)特性曲線

一般地，物料的凍結(jié)過程可分為三個(gè)階段：冷卻階段-冰晶生成階段-繼續(xù)凍結(jié)階段[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，SC9 塊根凍結(jié)過程表現(xiàn)為凍結(jié)溫度隨時(shí)間的延長不斷下降，直到到達(dá)某一溫度時(shí)，溫度變化曲線逐漸平緩，呈現(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，其過冷點(diǎn)與冰點(diǎn)重合，此時(shí)的溫度即為塊根的冰點(diǎn)；如圖2 所示，頭部、中部表現(xiàn)為冰點(diǎn)與過冷點(diǎn)重合，溫度分別為?0.6、?1.0、?1.1 ℃；不同部位發(fā)生凍結(jié)的時(shí)間并不一致，這可能與其內(nèi)含物成分及比例不同，細(xì)胞組織對(duì)凍結(jié)過程的阻礙作用相關(guān)，對(duì)于凍結(jié)特性的影響仍有待深入研究[11]。

圖2 塊根不同部位凍結(jié)曲線Fig.2 The freezing curve type of different parts of cassava root

2.2 塊根凍結(jié)特性研究

2.2.1 塊根不同部位成分 物料低溫凍結(jié)主要是由其本身水分冷卻凝固造成的，含水量在一定程度上影響物料的凍結(jié)特性。果蔬細(xì)胞內(nèi)部TSS 主要包含糖、有機(jī)酸、鹽、果膠、多元醇等，其含量高低反映細(xì)胞生理生化特性，且與品質(zhì)密切相關(guān)[22]。淀粉是木薯塊根干物質(zhì)含量占比最大的一種營養(yǎng)成分，因吸水性強(qiáng)，其含量高低影響了塊根中可凍結(jié)水分的含量。表1 結(jié)果顯示，不同部位成分差異比較發(fā)現(xiàn)，除含水量頭部與中部、尾部呈極顯著差異外（P<0.01），可溶性固形物及淀粉含量均無顯著差異（P>0.05）；塊根含水量表現(xiàn)出頭部<中部<尾部的規(guī)律，亦可說明干物質(zhì)含量規(guī)律應(yīng)為頭部>中部>尾部，而可溶性固形物與淀粉含量同樣表現(xiàn)出類似規(guī)律，這與前人研究木薯的結(jié)果一致[14]。甘蔗不同部位含糖量的規(guī)律與該結(jié)果相近[23?24]，原因可能與運(yùn)輸?shù)鞍?、相關(guān)酶活、跨膜運(yùn)輸?shù)扔嘘P(guān)，需進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

表1 塊根不同部位成分差異比較Table 1 Comparison of components for different parts of cassava roots

2.2.2 相關(guān)性分析 由表2 可看出，可溶性固形物和含水量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），冰點(diǎn)溫度（Freezing Temperature，F(xiàn)T）則與可溶性固形物、含水量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與淀粉含量呈正相關(guān)關(guān)系。即可溶性固形物、含水量越高，則冰點(diǎn)溫度越低，但相關(guān)性不顯著（P>0.05），這可能與淀粉類果蔬冰點(diǎn)受細(xì)胞內(nèi)冰晶結(jié)晶速率的影響，造成可溶性固形物含量發(fā)生變化有關(guān)[12]。

表2 冰點(diǎn)影響因素相關(guān)分析Table 2 Effects of relative analysis for freezing temperature

2.3 非靶向代謝組學(xué)分析

2.3.1 樣品偏最小二乘法判別分析 偏最小二乘法判別分析（partial least squares discrimination analysis,PLS-DA）是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計(jì)方法，通過運(yùn)用偏最小二乘回歸建立代謝物表達(dá)量與樣品類別之間的關(guān)系模型，來實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品類別的預(yù)測(cè)[25]。初步的模型構(gòu)建驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，R2數(shù)據(jù)大于Q2數(shù)據(jù)，且Q2回歸線與Y 軸截距小于0 時(shí)，表明模型未“過擬合”（圖3）模型穩(wěn)定可靠。

圖3 兩種離子模式下的PLS-DA 得分圖及驗(yàn)證圖Fig.3 PLS-DA score diagram and valid diagram under two ion modes

2.3.2 差異代謝物篩選結(jié)果 通過KEGG、HMDB、LIPID MAPS 等數(shù)據(jù)庫對(duì)代謝物進(jìn)行功能和分類注釋，其中，差異代謝物的篩選主要參考VIP、FC 和P值三個(gè)參數(shù)，VIP 是指PLS-DA 模型第一主成分的變量投影重要度（Variable Importance in the Projection）[26]，VIP 值表示代謝物對(duì)分組的貢獻(xiàn)；FC 指差異倍數(shù)（Fold Change），為每個(gè)代謝物在比較組中所有生物重復(fù)定量值的均值的比值；P值是通過Ttest 計(jì)算得到[27]，表示差異顯著性水平。設(shè)定閾值為VIP>1.0，F(xiàn)C>1.2 或FC<0.833 且P<0.05[26,28?29]，共篩選出41 個(gè)顯著差異代謝物，包括3 種脂肪酸和共軛物、1 種羥基肉桂酸及其衍生物、2 種苯甲酸及其衍生物、1 種喹啉羧酸、6 種氨基酸、肽和類似物、膽汁酸、醇和衍生物、1 種黃酮苷、1 種嘧啶核苷酸、1 種酮類、1 種黃酮類、1 種吡啶羧酸及其衍生物、1 種線性二芳基庚烷以及22 種未識(shí)別物質(zhì)，其中，31 個(gè)表達(dá)上調(diào)，10 個(gè)表達(dá)下調(diào)。結(jié)果見表3。

表3 冰溫處理與常溫對(duì)照的差異代謝物Table 3 Differential metabolites between ice temperature treatment and normal temperature control

2.3.3 差異代謝產(chǎn)物富集分析 將篩選出的41 個(gè)組間差異代謝物通過KEGG 富集通路分析，繪制出主要的生化代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑富集氣泡圖（圖4）。從圖4 可以看出，P<0.05 的代謝途徑有3 條，分別是苯丙氨酸代謝通路（Phenylalanine metabolism）、脂肪酸生物合成（Fatty acid biosynthesis）和光合固碳作用（Carbon fixation in photosynthetic organisms）。其中，苯丙氨酸代謝通路的氣泡最大，表示該通路中差異代謝物富集程度最高。說明經(jīng)冰溫處理后塊根苯丙氨酸通路中差異代謝物數(shù)目最多。通過ROC 曲線，可以看出，其差異代謝物ROC 曲線下方的面積（AUC）在0.9 以上（圖5），表明該結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確性。

圖4 KEGG 富集氣泡圖Fig.4 KEGG enrichment scatterplot

圖5 差異代謝物ROC 曲線圖Fig.5 ROC curve of differential metabolites

2.3.4 關(guān)鍵代謝通路分析 與對(duì)照相比，冰溫處理下的苯丙氨酸代謝通路如圖6 所示，（圓圈代表代謝物，其中綠色實(shí)心圓圈標(biāo)記為注釋到的代謝物，紅色圓圈標(biāo)記為上調(diào)差異代謝物），通路中共有9 個(gè)顯著差異代謝物，其中，作為水楊酸前體的馬尿酸（Hippuric Acid，HA）和苯甲酸（Benzoic acid，BA）兩種產(chǎn)物表達(dá)上調(diào)，這可能是導(dǎo)致冰點(diǎn)溫度貯藏保鮮效果顯著的主要原因。

圖6 苯丙氨酸代謝通路Fig.6 Phenylalanine metabolism pathway

3 討論與結(jié)論

果蔬在凍結(jié)過程中，細(xì)胞汁液逐漸發(fā)生形態(tài)改變（液態(tài)-固態(tài)），當(dāng)溫度持續(xù)下降至第一個(gè)最低點(diǎn)時(shí)，即為過冷點(diǎn)；隨后，細(xì)胞通過釋放潛熱，溫度會(huì)出現(xiàn)小幅上升，達(dá)到某一高點(diǎn)，即為凍結(jié)點(diǎn)，此時(shí)零度與凍結(jié)點(diǎn)之間的溫度范圍稱為冰溫帶[30]。冰溫貯藏保鮮是一種將物料置于冰溫帶中的非凍結(jié)保鮮技術(shù)，其本質(zhì)是利用細(xì)胞液內(nèi)蛋白質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)形成的一定空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，能阻礙冰晶生成，保持細(xì)胞的完整性，且在該溫度帶內(nèi)呼吸速率大大降低、酶及微生物極大程度受到抑制，相對(duì)于常溫儲(chǔ)藏，可使果品延長2～10 倍的貯藏期[3,31]。

目前，關(guān)于木薯塊根保鮮技術(shù)的研究匱乏，而多采用耗能和成本頗高的凍藏方式進(jìn)行貯藏（?20 ℃）。因此，開展冰溫貯藏利用及基因表達(dá)情況、代謝產(chǎn)物的差異性分析等研究將為轉(zhuǎn)變木薯塊根貯藏方式提供可靠依據(jù)和有力支撐。王二歡等[32]認(rèn)為，關(guān)玉竹不同部位冰點(diǎn)與水分含量關(guān)系有所差異，推測(cè)冰點(diǎn)不僅與水分含量及組成有關(guān)，而且與植物組織內(nèi)成核劑（細(xì)菌性和非細(xì)菌性）、遺傳有一定關(guān)系，這可能是冰點(diǎn)與其水分組成之間相關(guān)性發(fā)生改變的原因；本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，木薯塊根的冰點(diǎn)溫度與可溶性固形物、含水量，淀粉含量分別呈負(fù)、正相關(guān)關(guān)系，但都不顯著，雖然與前人研究結(jié)果有出入，一方面這與木薯塊根含有大量淀粉顆粒，在冷凍前期凍結(jié)速率較低時(shí)，細(xì)胞內(nèi)微細(xì)物質(zhì)會(huì)影響冰晶生長。隨著溫度逐步降低，細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶會(huì)釋放潛熱，影響細(xì)胞凍結(jié)溫度，阻礙冰晶的形成[11]；另一方面木薯作為典型菌根作物，內(nèi)含微生物類型豐富，使得凍結(jié)過程組織內(nèi)成核，從而造成冰點(diǎn)有所差異有關(guān)。

水楊酸（salicylic acid,SA）是植物中普遍存在的一種小分子酚類物質(zhì)，已有研究人員發(fā)現(xiàn)SA 在植物應(yīng)對(duì)高低溫、鹽、重金屬等非生物脅迫方面扮演著重要角色[33?34]，尤其是在ROS 清除[35]，緩解細(xì)胞脫水[36]及與其他信號(hào)分子間相互作用[37]等機(jī)體響應(yīng)低溫脅迫的生理機(jī)理作用已得到證實(shí)。經(jīng)過科學(xué)家多年研究，低溫可促進(jìn)植物組織中水楊酸的合成已取得共識(shí)，其來源途徑主要分為苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase,PAL）途徑和異分支酸合成酶（isochorismate synthase,ICS）途徑，可能與物種、低溫處理時(shí)間及強(qiáng)度等因素有關(guān)[38]。本研究發(fā)現(xiàn)，通過冰溫處理后塊根的非靶向代謝組學(xué)分析，與對(duì)照相比，塊根主要的差異代謝反映在苯丙氨酸代謝通路上，該通路共注釋到9 個(gè)具有顯著差異的代謝物，水楊酸的前體物質(zhì)馬尿酸與苯甲酸二者表達(dá)上調(diào)，推測(cè)水楊酸的差異表達(dá)是塊根冰溫貯藏具有良好保鮮效果的關(guān)鍵，這與張秋明等[39]研究柑桔內(nèi)源水楊酸含量變化對(duì)耐貯性影響的結(jié)論類似。

綜上所述，食用木薯塊根冰點(diǎn)為?0.6～?1.0℃，通過冰點(diǎn)影響因素結(jié)合代謝組學(xué)分析，實(shí)際貯藏溫度建議控制在（?1.0±1）℃間，既能降低低溫貯藏成本，也能有效避免溫度過低而造成冷害發(fā)生。