基于高通量測(cè)序分析不同食鹽濃度的酸菜中微生物多樣性

賈晶晶，魏愛麗，趙虎威，燕平梅

(太原師范學(xué)院 生物系，山西 晉中 030012)

我國人口眾多，物產(chǎn)豐富，地域遼闊，具有民族特色的傳統(tǒng)食品分布全國各地。在傳統(tǒng)食品中極具特色的代表之一就是發(fā)酵蔬菜制品[1]。而酸菜是最具有代表性的發(fā)酵蔬菜之一，在現(xiàn)代生活中扮演著重要的營養(yǎng)角色，是將新鮮蔬菜經(jīng)微生物的作用發(fā)生一些理想的生化反應(yīng)而成的一種蔬菜制品。在發(fā)酵中起主要作用的微生物是乳酸菌[2]。適量食用酸菜有益人體健康，能促進(jìn)腸道菌群的增長，且具有降膽固醇、降血壓、降血脂、提高人體免疫力等一系列益處[3]，還可以降解草酸鹽以防治腎臟疾病，幫助人體吸收鐵元素，因此深受人們的喜愛。

目前酸菜大多采用自然發(fā)酵的方法來制作，其發(fā)酵過程不易控制，且會(huì)因加入不合適的鹽量而產(chǎn)生過量對(duì)人體有害的亞硝酸鹽，帶來嚴(yán)重的食品安全隱患，故一定程度上制約了酸菜的生產(chǎn)數(shù)量和質(zhì)量。適當(dāng)濃度的鹽溶液不僅可以控制酸菜中乳酸菌的生長代謝活動(dòng)，影響其風(fēng)味與品質(zhì)，而且可使酸菜不易腐敗，增加其保質(zhì)期。

傳統(tǒng)的微生物純培養(yǎng)方法是早期對(duì)酸菜中微生物多樣性研究的主要方法，通過培養(yǎng)基培養(yǎng)的微生物根據(jù)微生物的形態(tài)或生化特征進(jìn)行鑒定，然后經(jīng)顯微鏡觀察法和生化鑒定來對(duì)樣品中的微生物種屬進(jìn)行分類鑒定[4]。傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法具有原理簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求較低、微生物形態(tài)觀察和計(jì)數(shù)便捷等優(yōu)勢(shì)，但其也有得到的結(jié)果不能完全反映樣品中微生物多樣性的劣勢(shì)[5]，盡管依賴純培養(yǎng)的方法具有很多局限性，但這種方法依然大大推動(dòng)了微生物學(xué)的發(fā)展。近年來，以克服傳統(tǒng)微生物學(xué)鑒定的局限性，不需要任何培養(yǎng)步驟，通過DNA分析的Culture-Independent方法被開發(fā)出來[6-8]，如基于分子生物學(xué)的高通量測(cè)序技術(shù)[9-10]，此技術(shù)克服了傳統(tǒng)的微生物純培養(yǎng)技術(shù)的限制，能夠更加客觀地分析樣品，以及更為準(zhǔn)確地分析微生物組成、多樣性和動(dòng)態(tài)變化，揭示更為復(fù)雜的細(xì)菌多樣性，包括不可培養(yǎng)的微生物、亞優(yōu)勢(shì)種群和后期生長的物種。高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用在分析水體、發(fā)酵食品、土壤微生物多樣性等領(lǐng)域[11-13]，是目前對(duì)微生物多樣性分析研究的主流方法。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)，通過對(duì)食鹽濃度分別為8%、12%的酸菜樣品中微生物群落多樣性的研究，探討了不同食鹽濃度下酸菜發(fā)酵過程中微生物群落的結(jié)構(gòu)組成及變化，對(duì)于改善酸菜的風(fēng)味、提高酸菜的營養(yǎng)價(jià)值、降低酸菜中的有害物質(zhì)有著積極作用，為酸菜的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮卷白菜；食用鹽；DNA提取試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

DYY-6C型瓊脂糖凝膠電泳儀 北京六一儀器廠；TGL-16B型高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；JB-CJ-1000FX型潔凈工作臺(tái) 蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；YEC4A271069型移液器 大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 材料處理

將新鮮卷白菜置于陰涼通風(fēng)處干燥脫水72 h，洗凈瀝干后分別裝入6個(gè)洗凈晾干的泡菜壇中，每壇裝200 g卷白菜，并用壓菜石壓緊。每3壇為一個(gè)對(duì)照組，分別加入160，240 g食鹽，按一層白菜一層鹽的順序壓緊，最上面用食鹽封頂后，用壓菜石壓緊，倒入2 L冷開水，淹沒白菜，蓋上壇蓋，壇沿加水，置于15 ℃陰涼通風(fēng)處進(jìn)行發(fā)酵。

1.2.2 樣品DNA的提取及PCR擴(kuò)增

待酸菜發(fā)酵至第14天時(shí)，使用移液器分別從酸菜液的上、中、下部各取12 mL樣液總計(jì)36 mL置于離心管內(nèi)，10000 r/min離心10 min，倒掉上清液，收集底部菌體，將每個(gè)對(duì)照組所收集到的3份底部菌體混合后置于2 mL的EP管內(nèi)備用。

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒對(duì)6個(gè)樣品的DNA進(jìn)行提取。提取完成經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳儀檢測(cè)DNA質(zhì)量后，將其置于-20 ℃以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

采用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)、806R(5′-GGACTACHVGGGTWTATAAT-3′)為引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA V3-V4區(qū)序列，然后按照PCR產(chǎn)物的檢測(cè)方法檢測(cè)。

1.2.3 高通量測(cè)序

將提取到的DNA樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行MiSeq測(cè)序。按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)聚類，最后采用RDP Classifier貝葉斯算法對(duì) 97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并在各個(gè)水平統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落組成，細(xì)菌使用Silva數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

利用Mothur軟件構(gòu)建稀釋性曲線；利用QIIME軟件對(duì)樣品的Chao豐富度指數(shù)、香農(nóng)(Shannon)多樣性指數(shù)、辛普森(Simpson)多樣性指數(shù)等進(jìn)行計(jì)算；利用柱形圖和環(huán)狀圖展示不同分類水平下各門和屬的相對(duì)含量；利用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，R語言制作熱圖，Excel軟件繪制柱形圖、群落分布環(huán)狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋曲線

以抽取的數(shù)據(jù)量為橫坐標(biāo)，以Alpha多樣性指數(shù)Shannon多樣性指數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制曲線(見圖1)，根據(jù)曲線是否達(dá)到平緩來判斷本次測(cè)序數(shù)據(jù)量是否足夠，測(cè)序深度是否可以較為可靠地表現(xiàn)出該樣品的微生物組成。

圖1 不同食鹽濃度樣品的稀釋曲線圖Fig.1 The dilution curves of samples with different salt concentrations

由圖1可知，6個(gè)樣品的稀釋曲線趨于平緩，故說明此次測(cè)序數(shù)據(jù)呈飽和狀態(tài)，其測(cè)序結(jié)果可以涵蓋酸菜樣品中絕大多數(shù)的物種，滿足了后續(xù)生物信息學(xué)分析的要求。

2.2 發(fā)酵酸菜中細(xì)菌序列豐度及多樣性分析

利用高通量測(cè)序方法對(duì)不同食鹽濃度的發(fā)酵酸菜液樣品進(jìn)行分析，共得到40769條序列，157個(gè)可操縱分類單元(OTU)。

Shannon多樣性指數(shù)、Chao豐富度指數(shù)、Simpson多樣性指數(shù)是常見的Alpha多樣性指數(shù)。本研究中所得到的Alpha多樣性指數(shù)見表1。群落Alpha多樣性指數(shù)能夠反映出物種的豐富度和多樣性程度[14]。

表1 不同食鹽濃度發(fā)酵酸菜Alpha多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity indexes of fermented Chinesesauerkraut with different salt concentrations

由表1可知，8%食鹽的樣品Chao值和Shannon指數(shù)分別為109和2.14，高于12%食鹽濃度的104.33和1.89，故可說明在8%食鹽濃度的酸菜樣品中，其微生物的豐富度和多樣性較高。

2.3 不同食鹽濃度的發(fā)酵酸菜細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

不同食鹽濃度的酸菜樣品中微生物在門水平上的相對(duì)含量分布見圖2，其細(xì)菌分屬5個(gè)門，Proteobacteria(變形菌門)和Firmicutes(厚壁菌門)為優(yōu)勢(shì)菌門，此外，樣品中還有Actinobacteria(放線菌門)、Cyanobacteria(藍(lán)藻門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)。

圖2 8%、12%食鹽濃度的酸菜液在細(xì)菌門水平上的相對(duì)含量Fig.2 The relative content of Chinese sauerkraut solution with salt concentrations of 8% and 12% at the phylum level

由圖2可知，從門水平上來看，在8%食鹽濃度的酸菜樣品中，Proteobacteria的相對(duì)含量為49.27%，F(xiàn)irmicutes的相對(duì)含量為49.99%，另外3個(gè)門的總相對(duì)含量為0.73%；在12%食鹽濃度的酸菜樣品中，Proteobacteria的相對(duì)含量為67.01%，F(xiàn)irmicutes的相對(duì)含量為32.39%，其他3個(gè)門的總相對(duì)含量為0.60%。結(jié)果表明，盡管食鹽濃度不同，但其中Proteobacteria和Firmicutes均為優(yōu)勢(shì)菌門。高通量測(cè)序結(jié)果與用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳結(jié)合熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)[15]的方法來對(duì)發(fā)酵酸菜中微生物菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析的方法相比，研究結(jié)果更為準(zhǔn)確、全面地揭示了酸菜中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步證明了高通量測(cè)序技術(shù)在分析微生物群落結(jié)構(gòu)方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

研究結(jié)果顯示：在酸菜發(fā)酵的過程中，第一優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門，這一門的細(xì)菌通常構(gòu)成了白菜本身的微生物群落，如假單胞菌和腸桿菌，第二優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門。朱琳等研究在蘿卜酸菜發(fā)酵液中亞硝酸鹽的上升和回落的變化期間酸菜液中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性，表明在峰值期與回落期細(xì)菌多樣性大不相同，而在亞硝酸鹽的回落期酸菜液中第一優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門[16]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在8%食鹽濃度的酸菜樣品中，厚壁菌門(49.99%)的相對(duì)豐度高于變形菌門(49.27%)，說明其細(xì)菌群落符合亞硝酸鹽濃度回落期的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，可說明食鹽濃度在8%的發(fā)酵酸菜安全性相對(duì)較高。

不同食鹽濃度的酸菜液中細(xì)菌在屬水平上的相對(duì)含量(列舉前十種)見圖3和圖4。

圖3 8%食鹽濃度酸菜中微生物在屬水平上分布環(huán)狀圖Fig.3 Ring-like distribution of microorganisms in Chinese sauerkraut with 8% salt concentration at the genus level

圖4 12%食鹽濃度酸菜中微生物在屬水平上分布環(huán)狀圖Fig.4 Ring-like distribution of microorganisms in Chinesesauerkraut with 12% salt concentration at the genus level

由圖3和圖4可知，在8%食鹽濃度的酸菜樣品中，Enterobacter(腸桿菌屬)、Staphylococcus(葡萄球菌屬)、Lactococcus(乳球菌屬)、Bacillus(芽孢桿菌屬)、Weissella(魏斯氏菌屬)為優(yōu)勢(shì)菌屬，其相對(duì)百分比分別為34%、25%、14%、9%、7%，此外，該樣品中還有Providencia(普羅威登斯菌屬)、Acinetobacter(不動(dòng)桿菌屬)、Pseudomonas(假單胞菌屬)、Exiguobacterium(微桿菌屬)等。在12%食鹽濃度的酸菜樣品中，Lactococcus(乳球菌屬)、Enterobacter(腸桿菌屬)、Pseudomonas(假單胞菌屬)為優(yōu)勢(shì)屬，其相對(duì)百分比分別為37%、31%、17%，此外，該樣品中還有Bacillus(芽孢桿菌屬)、Weissella(魏斯氏菌屬)、Delftia(代爾夫特菌屬)、Acinetobacter(不動(dòng)桿菌屬)、Comamonas(叢毛單胞菌屬)、Lelliottia等。

二者對(duì)比，其優(yōu)勢(shì)屬均有Enterobacter(腸桿菌屬)和Lactococcus(乳球菌屬)，且在12%食鹽濃度的酸菜樣品中Lactococcus的相對(duì)含量(37%)遠(yuǎn)高于在8%食鹽濃度的酸菜樣品中的相對(duì)含量(14%)。故可知隨著食鹽濃度的增加，Lactococcus的相對(duì)含量有著升高的趨勢(shì)，且在不同食鹽濃度的酸菜樣品中乳酸菌均為優(yōu)勢(shì)菌，因?yàn)槠溆幸嫔饔?，常作為發(fā)酵劑被廣泛應(yīng)用于各類食品的生產(chǎn)加工過程中。

通過熱圖可視化方法可以直觀研究群落組成。由圖5可知，X1、X2、X3代表8%食鹽濃度的樣品，X4、X5、X6代表12%食鹽濃度的樣品，X2樣品中Enterobacteriaceae含量明顯高于其他樣品，可能是取樣不同造成差異明顯。所有菌群中，Lactococcus(乳球菌屬)在酸菜發(fā)酵中起主要作用，此外，Weissella(魏斯氏菌屬)也有發(fā)現(xiàn)，乳酸菌在酸菜發(fā)酵期間起到非常關(guān)鍵性的作用，這與國內(nèi)外眾多學(xué)者的研究結(jié)果一致[17-18]。

圖5 不同樣品熱圖Fig.5 Heat map of different samples

3 討論

蔬菜的發(fā)酵作用主要是由其微環(huán)境中微生物的生長代謝活動(dòng)引起的，且其中微生物的各種生長代謝活動(dòng)對(duì)發(fā)酵蔬菜的各個(gè)方面都有著一定的影響。除了蔬菜中原本含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)之外，發(fā)酵蔬菜中還有著蔬菜經(jīng)乳酸菌的發(fā)酵作用形成的乳酸、核苷酸、醇類、醛類、酮類和酯類等物質(zhì)，這些物質(zhì)不僅賦予了酸菜獨(dú)特的風(fēng)味，而且對(duì)人體的健康也大有裨益。

由于加工類型的不同，發(fā)酵所用的原材料品種、發(fā)酵溫度、鹽溶液濃度、發(fā)酵工藝等因素都會(huì)對(duì)發(fā)酵過程中的乳酸菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，且發(fā)酵溫度和鹽溶液濃度對(duì)其影響較大。熊濤等的研究表明，在泡菜的發(fā)酵過程中，菌系結(jié)構(gòu)和其生長代謝活動(dòng)對(duì)泡菜的品質(zhì)有著顯著影響[19]，也有研究表明鹽度是影響大腸桿菌生長最主要的因素[20]。

本研究以8%和12%食鹽濃度的酸菜樣品為研究對(duì)象，利用高通量測(cè)序?qū)ζ湓诎l(fā)酵過程中的微生物多樣性進(jìn)行了細(xì)致的研究，直觀地指出：在門水平上，Proteobacteria(變形菌門)和Firmicutes(厚壁菌門)為優(yōu)勢(shì)菌門；在屬水平上，Enterobacter(腸桿菌屬)和Lactococcus(乳球菌屬)為優(yōu)勢(shì)菌屬。且在12%食鹽濃度的酸菜樣品中Lactococcus的相對(duì)含量(37%)遠(yuǎn)高于在8%食鹽濃度的酸菜樣品中的相對(duì)含量(14%)。結(jié)果表明，8%食鹽濃度的酸菜樣品中微生物的多樣性較高，而引起發(fā)酵的主要菌屬Lactococcus隨著食鹽濃度的增加有升高的趨勢(shì)。

研究不同食鹽濃度的酸菜中微生物的種類及群落差異對(duì)優(yōu)化酸菜的發(fā)酵工藝，提高酸菜食品的安全性具有極其重要的作用。揭示特定環(huán)境中的微生物物種多樣性，尋找不同微生物在其特定生態(tài)系統(tǒng)中的相關(guān)作用仍是目前微生物生態(tài)學(xué)的熱門之一。然而目前對(duì)于酸菜中的微生物構(gòu)效、互作關(guān)系及其相關(guān)的生理生化反應(yīng)缺乏科學(xué)性和整體性的研究與標(biāo)準(zhǔn)，特別是缺乏對(duì)于乳酸菌在不同加工方式的酸菜中的生長規(guī)律及其在日常生活和工業(yè)中統(tǒng)一的、系統(tǒng)性的指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)與應(yīng)用，這些都將成為未來在蔬菜發(fā)酵研究過程中的重要課題。