響應(yīng)面法優(yōu)化重組谷氨酸棒桿菌G-BC產(chǎn)脂肪酸的培養(yǎng)條件

楊 青，孫子羽，滿都拉，王 佳，劉 瑾，金晶晶，陳忠軍

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特 010018)

食用油的主要成分為脂肪酸甘油三酯，脂肪酸是生物體內(nèi)必需的有機(jī)物之一[1]，是機(jī)體的重要供能物質(zhì)。另外，脂肪酸作為一種重要的平臺(tái)化合物，可進(jìn)一步合成高能比生物燃料及高附加值油脂化學(xué)品[2-4]。目前，微生物法合成脂肪酸因具有代謝產(chǎn)物易分解、脂肪酸含量高等優(yōu)點(diǎn)，而被越來越多地用來生產(chǎn)特種脂肪酸，如EPA和DHA[5-6]等。

目前，用于脂肪酸合成的微生物主要有酵母[7-8]、霉菌[9]、細(xì)菌[10-12]和藻類[13]等。但這些微生物合成脂肪酸的機(jī)制研究尚不成熟，因此探索高效環(huán)保的生物合成路線是今后脂肪酸合成的發(fā)展趨勢(shì)[14]。谷氨酸棒桿菌作為一種重要的工業(yè)模式菌株，具有底物范圍廣、遺傳背景清楚、易于工程調(diào)控、可高密度發(fā)酵等特點(diǎn)，已經(jīng)成為微生物催化合成化學(xué)品和燃料的理想受體菌[15-16]，且其細(xì)胞壁不含脂多糖，有利于產(chǎn)物脂肪酸的分離純化。但對(duì)谷氨酸棒桿菌的脂肪酸合成及轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控機(jī)制研究尚不深入。

脂肪酸的合成主要包括3個(gè)過程：第一個(gè)過程是從葡萄糖出發(fā)，經(jīng)糖酵解作用和三羧酸循環(huán)，為機(jī)體脂肪酸合成提供底物乙酰輔酶A；第二個(gè)過程是蘋果酸酶催化蘋果酸脫羧轉(zhuǎn)化生成丙酮酸，并釋放NADPH，是脂肪酸合成的主要?jiǎng)恿碓?；第三個(gè)過程是經(jīng)脂肪酸從頭合成，乙酰輔酶A在脂肪酸合成酶系(FAS)的催化下轉(zhuǎn)化生成脂酰輔酶A，脂酰輔酶A在硫酯酶TesA的水解作用下，釋放出游離脂肪酸[17]。乙酰輔酶A羧化酶α亞基是編碼脂肪酸合成途徑中乙酰輔酶A羧化酶的關(guān)鍵基因之一[18]，但目前對(duì)于該基因的研究較少。本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究工作中已經(jīng)構(gòu)建了乙酰輔酶A羧化酶α亞基(accBC)的表達(dá)菌株重組谷氨酸棒桿菌G-BC，本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化該重組菌株產(chǎn)脂肪酸的培養(yǎng)條件，通過對(duì)比其與原始菌株脂肪酸產(chǎn)量的差異確定accBC基因?qū)χ舅岷铣傻挠绊?，從而為后續(xù)通過基因優(yōu)化構(gòu)建脂肪酸高產(chǎn)菌株奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌種

含pXMJ19-accBC重組質(zhì)粒的重組谷氨酸棒桿菌菌株G-BC，谷氨酸棒桿菌ATCC 13032(Corynebacteriumglutamicum)，均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

LB培養(yǎng)基：酵母提取粉(5 g/L)、胰蛋白胨(10 g/L)、氯化鈉(10 g/L)，必要時(shí)添加25 ng/μL的氯霉素抗生素，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。十一烷酸甲酯，購自美國(guó)Sigma公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

H3018DR高速冷凍離心機(jī)，上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司；LGJ-18S 冷凍干燥機(jī)，河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；Clams680 氣相色譜儀，珀金埃爾默儀器有限公司；NanoDrop 2000 超微量分光光度計(jì)，美國(guó) Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 重組谷氨酸棒桿菌G-BC的培養(yǎng)

取重組谷氨酸棒桿菌G-BC甘油保藏菌，在含氯霉素的抗性平板上劃線培養(yǎng)。提取單菌落于含25 ng/μL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min條件下過夜培養(yǎng)。取上述培養(yǎng)液作為種子培養(yǎng)液，按照4%的接種量轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基(含氯霉素25 ng/μL)中，30℃振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.6，分別添加誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至一定終濃度，于一定溫度下誘導(dǎo)培養(yǎng)一定時(shí)間，離心收集菌體，冷凍干燥，測(cè)定菌體中脂肪酸產(chǎn)量。

1.2.2 脂肪酸產(chǎn)量的測(cè)定

采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)(十一烷酸甲酯)法測(cè)定菌體的脂肪酸產(chǎn)量。

甲酯化：稱取約0.12 g菌粉，加入4 mL正己烷-異丙醇(體積比3∶2)溶液、2 mL6.25%的Na2SO4溶液，室溫、5 300 r/min下離心20 min。取上清液于20 mL水解管中，用氮?dú)獯蹈?。加? mL 2% 氫氧化鈉甲醇溶液，在50℃水浴15 min，冷卻后加入2 mL 10%鹽酸甲醇溶液，在80℃水浴1.5 h。冷卻到室溫，加入3 mL超純水和6 mL正己烷，振蕩，靜置或離心分層。吸取上層液體(盡量吸凈)，定容至10 mL，加無水Na2SO4干燥后，待氣相色譜分析。

色譜條件：DB-WAX石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；柱箱升溫程序?yàn)槠鹗紲囟?20℃，保持5 min，以5℃/min的速率升到225℃，保持1 min，以8℃/min的速率升到240℃，保持5 min；氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)溫度260℃；進(jìn)樣口汽化溫度260℃；載氣(N2)流速 1.0 mL/min；氫氣流速45 mL/min；空氣流速450 mL/min；進(jìn)樣量1.0 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 誘導(dǎo)劑濃度對(duì)重組谷氨酸棒桿菌G-BC脂肪酸產(chǎn)量的影響

在培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)時(shí)間20 h條件下對(duì)重組谷氨酸棒桿菌G-BC進(jìn)行培養(yǎng)，分析不同誘導(dǎo)劑濃度(0.5、1、1.5、2、2.5 mmol/L)對(duì)重組谷氨酸棒桿菌G-BC脂肪酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 誘導(dǎo)劑濃度對(duì)重組谷氨酸棒桿菌G-BC脂肪酸產(chǎn)量的影響

由圖1可知，在0.5～1 mmol/L范圍內(nèi)，隨著誘導(dǎo)劑濃度的增加，脂肪酸產(chǎn)量提高，誘導(dǎo)劑濃度為1 mmol/L時(shí)脂肪酸產(chǎn)量達(dá)到最高，隨著誘導(dǎo)劑濃度的繼續(xù)提高，脂肪酸產(chǎn)量大幅度降低。誘導(dǎo)劑濃度的提高并不對(duì)應(yīng)著脂肪酸產(chǎn)量的提高，這是由于IPTG對(duì)微生物細(xì)胞有一定的毒性作用，IPTG終濃度過高和過低均不利于脂肪酸的積累。因此，選擇誘導(dǎo)劑濃度為1 mmol/L。

2.1.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)重組谷氨酸棒桿菌G-BC脂肪酸產(chǎn)量的影響

在誘導(dǎo)劑濃度1 mmol/L、培養(yǎng)溫度 30℃條件下對(duì)重組谷氨酸棒桿菌G-BC進(jìn)行培養(yǎng)，分析不同培養(yǎng)時(shí)間(12、16、20、24、28 h)對(duì)重組谷氨酸棒桿菌G-BC脂肪酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)重組谷氨酸棒桿菌G-BC脂肪酸產(chǎn)量的影響

由圖2可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)脂肪酸產(chǎn)量呈線性增加，在20 h時(shí)達(dá)到最高，隨后略微降低。這是由于在微生物生長(zhǎng)的穩(wěn)定期后期脂肪酸作為一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而被消耗。因此，選擇培養(yǎng)時(shí)間為20 h。

2.1.3 培養(yǎng)溫度對(duì)重組谷氨酸棒桿菌G-BC脂肪酸產(chǎn)量的影響

在誘導(dǎo)劑濃度1 mmol/L、培養(yǎng)時(shí)間20 h條件下對(duì)重組谷氨酸棒桿菌G-BC進(jìn)行培養(yǎng)，分析不同培養(yǎng)溫度(26、28、30、32、34℃)對(duì)重組谷氨酸棒桿菌G-BC脂肪酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)重組谷氨酸棒桿菌G-BC脂肪酸產(chǎn)量的影響

溫度是影響微生物生長(zhǎng)最重要的因素之一，在微生物的代謝過程中也會(huì)影響相關(guān)酶的活力，從而改變功能酶的作用，影響脂肪酸的合成。從圖3可知，培養(yǎng)溫度升高，脂肪酸產(chǎn)量增加，在培養(yǎng)溫度為32℃時(shí)脂肪酸產(chǎn)量最大，之后脂肪酸產(chǎn)量直線下降，這可能是由于過高的溫度降低了酶的活性，最終降低了脂肪酸產(chǎn)量。因此，選擇培養(yǎng)溫度為32℃。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以誘導(dǎo)劑濃度(A)、培養(yǎng)時(shí)間(B)、培養(yǎng)溫度(C)為自變量，脂肪酸產(chǎn)量(Y)為響應(yīng)值，采用Box-Behnken法進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)重組谷氨酸棒桿菌G-BC產(chǎn)脂肪酸的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平見表1，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Design-Expert 8.0軟件，對(duì)表2中3個(gè)因素進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，得到多元二次回歸方程：Y=33.68+1.05A-0.19B+0.029C+0.063AB+0.29AC+0.27BC-3.29A2-1.99B2-2.03C2。對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 方差分析

通過響應(yīng)面模型優(yōu)化，得到重組谷氨酸棒桿菌G-BC產(chǎn)脂肪酸的最優(yōu)培養(yǎng)條件為誘導(dǎo)劑濃度1.04 mmol/L、培養(yǎng)時(shí)間19.83 h、培養(yǎng)溫度32.03℃，在此條件下模型預(yù)測(cè)脂肪酸產(chǎn)量為33.76 mg/g。為了便于操作，修正培養(yǎng)條件為誘導(dǎo)劑濃度1 mmol/L、培養(yǎng)時(shí)間20 h、培養(yǎng)溫度32℃，在此條件下進(jìn)行3組平行驗(yàn)證試驗(yàn)，平均脂肪酸產(chǎn)量可達(dá)34.56 mg/g，與模型的預(yù)測(cè)值接近，說明該模型可靠。

前期試驗(yàn)得到谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的脂肪酸產(chǎn)量為12.88 mg/g，而在最優(yōu)培養(yǎng)條件下重組谷氨酸棒桿菌G-BC的脂肪酸產(chǎn)量為34.56 mg/g，比原始菌株增加了1.68倍，說明accBC基因的引入能夠增加谷氨酸棒桿菌脂肪酸產(chǎn)量。

3 結(jié) 論

本研究探究了誘導(dǎo)劑濃度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度對(duì)于重組谷氨酸棒桿菌G-BC脂肪酸產(chǎn)量的影響，然后通過響應(yīng)面法得到重組谷氨酸棒桿菌產(chǎn)脂肪酸的最佳培養(yǎng)條件為誘導(dǎo)劑IPTG濃度1 mmol/L、培養(yǎng)時(shí)間20 h、培養(yǎng)溫度32℃，在此條件下重組菌株的脂肪酸產(chǎn)量為34.56 mg/g(以菌體干質(zhì)量計(jì))，比原始菌株提高了1.68倍。說明乙酰輔酶A羧化酶α亞基基因?qū)τ诠劝彼岚魲U菌中脂肪酸的合成起到促進(jìn)作用。本研究為后續(xù)通過共表達(dá)脂肪酸合成途徑中的多基因(如脂肪酸合酶、硫酯酶等)來構(gòu)建脂肪酸高產(chǎn)菌株提供了理論依據(jù)。