EBUS-TBNA樣本采用“涂片+液基+細胞塊”細胞學檢查的診斷效能分析

虞紅珍，劉紅艷，秦 蓉，黃 山，吳繼鋒

經(jīng)支氣管內(nèi)超聲引導針吸活檢術(shù)(endo-bronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration, EBUS-TBNA)已成為肺癌診斷和分期的一個重要工具，且對肉芽腫性炎的診斷也有一定的提示作用[1-2]。不同于粗針穿刺組織活檢標本，EBUS-TBNA樣本內(nèi)出血多，組織條細碎、游離分散；臨床上一般采取分別送檢涂片細胞學和組織病理檢查兩種方法，由不同病理醫(yī)師出具2份病理報告。因樣本組織細碎分散，在組織病理檢查的取材、包埋環(huán)節(jié)易流失有效細胞成分，導致制片后組織過少，出現(xiàn)無法診斷的局面；送檢涂片細胞學檢查也存在出血多，有效成分少，易出現(xiàn)大量假陰性或不確定性診斷病例；由于2份報告由不同醫(yī)師閱片診斷，標準尺度不一致的情況經(jīng)常發(fā)生。本院通過細化對EBUS-TBNA樣本的管理，采用“涂片+液基+細胞塊”細胞學檢查的一體化制片診斷模式[3]，由同一細胞學醫(yī)師出具涂片與液基細胞學診斷報告和細胞塊切片(或結(jié)合免疫組化標記)的補充病理報告共2份，展現(xiàn)出較好的效果，本文現(xiàn)收集240例病理報告結(jié)果進行統(tǒng)計分析如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院病理科2019年1月～2021年4月間因胸部CT發(fā)現(xiàn)縱隔淋巴結(jié)腫大、縱隔占位或肺門占位等原因行EBUS-TBNA病理檢查合計240例，其中同時分別送檢常規(guī)涂片細胞學和組織病理檢查21例，采用“涂片+液基+細胞塊”細胞學檢查219例。

1.2 方法“涂片+液基+細胞塊”細胞學一體化制片診斷模式：即穿刺現(xiàn)場涂片2～4張，快速染色評估穿刺是否成功并初步診斷，再將針道內(nèi)所有樣本全部注入液基紅色保存液(BD公司)，與涂片共同送至病理科檢查。病理科對涂片行HE染色及保存液內(nèi)樣本液基制片1張(SurePath 液基制片染色系統(tǒng)，BD公司)，出具涂片+液基的細胞學診斷報告。液基細胞學檢查剩余樣本離心后沉渣包埋、脫水、浸蠟后石蠟包埋，細胞蠟塊切片染色后病理觀察；陽性病例再結(jié)合免疫組化輔助診斷，以確定腫瘤組織來源、病理類型，并由同一細胞學醫(yī)師再補充簽發(fā)同一細胞病理編號的細胞塊補充病理報告。

1.3 結(jié)果判定目前尚無統(tǒng)一規(guī)范的EBUS-TBNA細胞學報告分類系統(tǒng)，本組病理報告綜合參照國際細胞學報告語言系統(tǒng)如甲狀腺細胞學Bethesda系統(tǒng)(TBSRTC)(2017)及胰腺細胞學報告診斷系統(tǒng)(2014)分為6大類[4-5]：無法診斷或標本不滿意(Ⅰ類，僅見出血，未見有核細胞成分或細胞塊制備不成功)、陰性(Ⅱ類，見散在淋巴細胞、纖毛柱狀上皮細胞或炭末成分，未查見惡性細胞或類上皮樣細胞)、提示肉芽腫(Ⅲ類，查見類上皮樣細胞)、非典型細胞(Ⅳ類，細胞存在非典型性但在數(shù)量或質(zhì)量上尚不足以診斷惡性)、可疑惡性細胞(Ⅴ類)及惡性細胞(Ⅵ類)。其中Ⅰ+Ⅱ類定義為陰性報告，Ⅲ類定義為肉芽腫陽性報告，Ⅳ～Ⅵ類定義為惡性腫瘤陽性報告，Ⅵ類定義為確定陽性報告。每例涂片+液基的細胞學報告和細胞塊切片補充報告均由同一細胞病理醫(yī)師判讀簽發(fā)，細胞塊陽性報告病例以細胞塊結(jié)合免疫組化補充診斷為最終診斷，細胞塊陰性報告病例以隨訪術(shù)后或其它活檢組織病理為最終診斷。

1.4 統(tǒng)計學分析運用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，配對計數(shù)資料采用McNemar檢驗，并計算K系數(shù)值反應(yīng)一致性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。陽性檢出率=真陽性/(真陽性+假陰性)×100%，特異性=真陰性/(真陰性+假陽性)×100%。

2 結(jié)果

2.1 涂片細胞學、液基細胞學、細胞塊診斷及組織活檢診斷效能分析240例最終診斷：惡性腫瘤169例，肉芽腫性炎35例，其它良性病變36例(表1)。其中240例涂片細胞學(圖1)的標本滿意率、惡性腫瘤陽性檢出率/確定陽性診斷率、特異性分別為94.2%、76.9%/53.3%、100%，219例液基細胞學(圖2)分別為99.5%、89.2%/66.2%、97.3%，細胞塊診斷分別為98.2%、91.9%/81.1%、97.3%，細胞塊+免疫組化(圖3)對腫瘤分型/來源診斷率為99.2%。涂片細胞學、液基細胞學和細胞塊對肉芽腫的陽性檢出率分別為5.7%、11.4%及80%，且細胞塊切片結(jié)合臨床資料及特殊染色等技術(shù)對肉芽腫的病因診斷率達57.1%。而組織活檢病理的標本滿意率、惡性腫瘤陽性檢出率/確定陽性診斷率分別為38.1%、38.1%/4.8%(表2)。

圖1 EBUS-TBNA標本涂片細胞學：A.肺腺癌；B.肺鱗狀細胞癌；C.肺小細胞癌；D.肉芽腫病變 圖2 EBUS-TBNA標本液基細胞學：A.肺腺癌；B.肺鱗狀細胞癌；C.肺小細胞癌；D.肉芽腫病變 圖3 EBUS-TBNA標本細胞塊+免疫組化或HE染色：A.肺腺癌TTF-1染色，；B.肺鱗狀細胞癌p40染色，；C.肺小細胞癌Syn染色；D.肉芽腫病變HE染色

表1 涂片細胞學、液基細胞學、細胞塊診斷及組織活檢診斷情況

表2 涂片細胞學、液基細胞學、細胞塊診斷及組織活檢診斷效能分析

2.2 細胞塊陽性病例結(jié)合免疫組化輔助診斷腫瘤來源及類型細胞塊報告惡性腫瘤陽性(Ⅳ～Ⅵ類診斷)合計136例，結(jié)合免疫組化明確腫瘤組織來源及腫瘤類型135例，包括71例肺腺癌(圖3A)、19例肺鱗狀細胞癌(圖3B)、37例小細胞癌(圖3C)及8例轉(zhuǎn)移性腺癌(乳腺、胃腸道)，1例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生，系假陽性。腫瘤分型/來源診斷率為99.2%。細胞塊報告肉芽腫陽性(Ⅲ類)28例(圖3D)，結(jié)合臨床資料及特殊染色(抗酸染色)提示結(jié)核12例，結(jié)節(jié)病8例，對肉芽腫的病因診斷率為57.1%(20/35)。

2.3 細胞塊陰性病例隨訪結(jié)果及質(zhì)控分析 細胞塊陰性病例(Ⅰ+Ⅱ類診斷)合計55例。其中Ⅰ類診斷4例，隨訪分析發(fā)現(xiàn)其相應(yīng)涂片+液基細胞學診斷惡性3例，查見類上皮樣細胞1例，但細胞塊制備不成功(因細胞量少)，無法進行細胞塊診斷或免疫組化標記，歸入Ⅰ類診斷。Ⅱ類診斷51例，經(jīng)隨訪術(shù)后或其他活檢組織病理明確其中35例真陰性(包括4例發(fā)育異常)，10例惡性，6例提示肉芽腫性炎。對漏診病例進行回顧性分析，原因分析詳見表3。

表3 細胞塊陰性報告隨訪結(jié)果及漏診質(zhì)控分析

3 討論

EBUS-TBNA是近幾年發(fā)展起來的一項新的內(nèi)鏡技術(shù)，其將內(nèi)鏡醫(yī)師可觀察的范圍由原來的氣管和支氣管腔內(nèi)進一步延伸到支氣管壁外，同時可幫助確認血管的位置，防止誤穿血管，提高了穿刺的準確性和安全性，是目前診斷肺部病變及縱隔腫大淋巴結(jié)性質(zhì)最重要的工具。因探頭上內(nèi)置的穿刺針往往要求柔軟易彎曲折疊、損傷小等，一般均采用內(nèi)徑較細(22～26 G)的穿刺針，缺點是穿刺所得樣本組織條細碎、游離分散。也有報道采用19 G內(nèi)徑的粗針穿刺，與22 G內(nèi)徑對比分析顯示，19 G內(nèi)徑穿刺樣本診斷效能相當，但臨床出現(xiàn)血腫、氣胸等并發(fā)癥多[6]。在行組織病理檢查時，樣本組織細碎分散必然在取材、包埋等環(huán)節(jié)流失部分細碎細胞成分，可能導致制片后組織過少無法診斷。本院開展EBUS-TBNA初期，發(fā)現(xiàn)分別送檢組織病理檢查和涂片細胞學檢查的陽性檢出率極低。本組21例分別送檢涂片細胞學和組織病理學檢查，涂片細胞學檢查4例樣本不滿意，17例陽性，陽性檢出率為80.9%，但組織病理檢查13例標本不滿意，7例不確定陽性，僅1例確定陽性診斷，標本滿意率及陽性檢出率僅為38.1%。將涂片細胞學和組織活檢切片對比分析發(fā)現(xiàn)，除了樣本有效成分可能被丟失、稀少外，還與兩者獨立診斷、不同醫(yī)師間診斷標準的把握度量不一致有關(guān)。

因此，細化對EBUS-TBNA樣本的管理及實施一體化診斷將是改善EBUS-TBNA診斷效能的關(guān)鍵[7-8]。與臨床取材醫(yī)師溝通，確定改善送檢方式，即采用“涂片+液基+細胞塊”的一體化制片診斷模式。與原送檢方式比較，增加液基制片和細胞塊包埋替代活檢組織塊包埋并由同一診斷醫(yī)師先后簽發(fā)涂片+液基細胞學診斷和細胞塊(或結(jié)合免疫組化)補充診斷共2份報告，腫瘤陽性檢測率和診斷正確率明顯提高。

首先，涂片細胞學作用在于穿刺后快速染色、評估穿刺是否成功并進行初步診斷；其診斷特異性及陽性預測值均較高，缺點是血膜片、細胞分散、及時固定率低等致樣本滿意率、陽性檢出率及確定陽性診斷率等均稍低[9]。本組涂片細胞學樣本滿意率、腫瘤陽性檢出率/確定陽性診斷率分別為94.2%、76.9%/53.3%。液基細胞學樣本彌補了涂片的缺點，穿刺后直接注入液基紅色保存液，及時固定確保制片后顯示良好清晰的微細細胞結(jié)構(gòu)，血細胞背景少、細胞集中富集，且制片后剩余樣本制備細胞塊的流程更順暢；本組液基細胞樣本滿意率、腫瘤陽性檢出率/確定陽性診斷率分別為99.5%、89.2%/66.2%，均較涂片細胞學有很大的提高，與文獻報道基本一致[10-11]。本組尚有1例液基細胞學假陽性，報告異型細胞，但涂片及細胞塊檢查均陰性，隨訪術(shù)后病理發(fā)現(xiàn)系炎癥修復性改變，對此類病變的鑒別診斷能力還有待加強。涂片+液基細胞學報告的主要作用是定性診斷，且兩者聯(lián)合觀察可相互補充、互為證據(jù)，升級診斷類別，提高確定陽性診斷率(66.2%vs53.3%)。但兩者對肉芽腫病變檢出的敏感性均較低(5.7%和11.4%)，隨訪質(zhì)控分析發(fā)現(xiàn)可能與類上皮細胞形態(tài)在細胞學涂片及液基片不典型、結(jié)核性肉芽腫壞死多等有關(guān)。

其次，采用細胞塊包埋較活檢組織塊包埋的不同點在于取材流程中多了離心步驟，避免了在取材過程中部分游離成分的丟失；其樣本內(nèi)血細胞的存在可能與凝血酶、血清等成分作用有關(guān)，更有利于分散其間的細碎組織條凝結(jié)成塊，使其在隨后的脫水、浸蠟、石蠟包埋時細碎樣本不會流失。細胞塊樣本滿意率較活檢組織學檢查顯著增加(98.2%vs38.1%)。本組有4例液基剩余樣本包埋不成功，可能與細胞成分分散游離、血液成分被過多的保存液溶解破壞有關(guān)，提示樣本內(nèi)一定血細胞的存在反而是細胞塊制備成功的前提[12]。同時，細胞塊的Ⅰ類診斷(樣本不滿意)因樣本細碎、血細胞填充其間，有效細胞往往小灶、分散，更少見間質(zhì)浸潤等組織結(jié)構(gòu)，單一細胞塊HE圖像往往無法明確病變良、惡性，出現(xiàn)大量不確定性或描述性診斷，給臨床進一步處理帶來困惑。而如果由同一細胞學醫(yī)師閱片診斷，一方面其可結(jié)合涂片或液基細胞學圖像特征給出定性診斷，另一方面細胞塊最大的優(yōu)勢是可反復多次切片進行免疫組化標記或分子檢測，可進一步幫助確定其內(nèi)細胞的可能來源、組織類型、Ki-67增殖指數(shù)等進行綜合分析，相互印證，不僅大大提高了確定陽性診斷率，還明確了腫瘤類型、組織來源等[13]。本組細胞塊136例陽性病例，采用細胞塊結(jié)合免疫組化確診了135例腫瘤的組織類型及來源，診斷率達99.2%；1例免疫組化標記后系淋巴組織良性增生，不支持小細胞腫瘤，系假陽性。因此，細胞塊診斷雖采用的是細胞學診斷術(shù)語，但細胞塊本身也是組織病理樣本的另一種存在形式，借助免疫組化甚至分子病理技術(shù)也能像組織病理診斷一樣提供精準的腫瘤分型/組織來源診斷及分子診斷信息，給臨床醫(yī)師制定治療方案、指導靶向藥物治療提供關(guān)鍵病理依據(jù)，完全可以滿足臨床需求。

本組還對細胞塊陰性病例進行隨訪并質(zhì)控分析，經(jīng)隨訪術(shù)后或其它活檢組織病理，漏診了10例惡性和6例肉芽腫病例。對漏診病例進行回顧性分析，總結(jié)原因主要在細胞醫(yī)師鑒別診斷能力和臨床醫(yī)師取材質(zhì)量兩方面。首先，細胞學醫(yī)師對細胞塊切片內(nèi)小藍細胞認識不足，易與反應(yīng)性淋巴細胞混淆，同時細胞量較少、無組織結(jié)構(gòu)、制片染色不佳也影響閱片效果，致漏診3例淋巴瘤、1例小細胞癌。其次，取材樣本方面，2例鱗狀細胞癌經(jīng)隨訪組織學發(fā)現(xiàn)廣泛膠原化或廣泛壞死，有效癌細胞成分難以取到致漏診；4例腺癌均因出血多、取材不足，罕見惡性細胞，這既有臨床取材操作經(jīng)驗不足的原因，也與腫瘤結(jié)構(gòu)如膠原化難以吸出有效細胞成分等有關(guān)，持續(xù)加強與取材醫(yī)師的溝通交流，將有效提高取材質(zhì)量[14]。對肉芽腫的漏診主要與取材過少、大量壞死、類上皮細胞不典型等有關(guān)[15]。因此，加強細胞學醫(yī)師對淋巴瘤等的進一步形態(tài)學認識和提高臨床取材的質(zhì)和量將更進一步提高診斷的敏感性和準確性。

朱鶯等[16]報道EBUS-TBNA樣本采用涂片細胞學、液基細胞學與組織病理學3種病理檢查方法相結(jié)合的診斷陽性率為76.6%，單獨一種方法的診斷陽性率組織病理為67.0%，涂片細胞學為64.9%，液基細胞學為60.6%，三者間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本實驗結(jié)果顯示：液基細胞學較涂片細胞學的陽性檢出率顯著提高(89.2%vs76.9%，P<0.05)，細胞塊診斷較涂片細胞學的確定陽性率顯著提高(81.1%vs53.3%，P<0.05)，三種細胞學方法均較組織病理的陽性檢出率高(P<0.05)。本組陽性檢出率較朱鶯等[16]報道的數(shù)據(jù)高，可能與細化樣本管理，采用“涂片+液基+細胞塊”細胞學一體化制片診斷模式有關(guān)；且本組統(tǒng)計的確定陽性診斷率的提高對臨床指導更有意義。

總之，EBUS-TBNA樣本采用“涂片+液基+細胞塊”細胞學檢查模式可顯著提高樣本滿意率、陽性檢出率及確定陽性診斷率。細胞塊結(jié)合免疫組化標記可輔助確診腫瘤來源及類型，完全可滿足臨床對病理的需求，值得推廣。提高細胞學醫(yī)師對少見腫瘤如淋巴瘤等形態(tài)學的認識及提高穿刺樣本的質(zhì)和量將能更進一步提高EBUS-TBNA的診斷效能。