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    波紋龍蝦全長轉(zhuǎn)錄組測序分析

    2022-08-04 02:32:28梁妃爽梁華芳孫榕澤徐思行溫崇慶廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院廣東湛江524088
    安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年14期
    關(guān)鍵詞:波紋龍蝦測序

    梁妃爽,梁華芳,孫榕澤,徐思行,溫崇慶,王 偉 (廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,廣東湛江 524088)

    轉(zhuǎn)錄組(Transcriptome)是指特定細(xì)胞或組織中的所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,包含信使 RNA、核糖體 RNA、轉(zhuǎn)運 RNA以及非編碼 RNA。1977年,第1代DNA測序技術(shù)(Sanger雙脫氧鏈終止法)開始探索基因結(jié)構(gòu),但 Sanger 測序方法速度慢、通量低、成本高,難以滿足大量測序要求,因此難以應(yīng)用于組學(xué)測序研究。第2代測序技術(shù)主要基于Roche/454、ABI/Solid、Illumina/Solexa測序平臺,有效解決了速度慢、成本高、通量低的問題,但是其讀長短,拼接得到的轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)不完整。PacBio平臺單分子實時測序技術(shù),也稱為SMRT(Single Molecule Real-Time)測序,因其超長的測序讀長、超高的測序通量、無GC偏好性、無PCR擴增偏向性、直接檢測堿基修飾等諸多優(yōu)勢而廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)領(lǐng)域研究,為基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及DNA甲基化等研究注入了新活力。張金勇等對金烏賊()采用全長轉(zhuǎn)錄組測序,篩選SSR位點并分析出現(xiàn)頻率較高且類型豐富、多態(tài)性潛能較高等特點。Zhang等利用三代測序技術(shù)篩選施氏鱘 () 性腺中早期配子發(fā)生的相關(guān)基因,探討了其生殖調(diào)控機制。Pootakham等利用三代測序技術(shù)對斑節(jié)對蝦生成第1個全長轉(zhuǎn)錄組。因此,利用三代測序技術(shù)對波紋龍蝦全長轉(zhuǎn)錄組測序,分析環(huán)境因子相關(guān)脅迫差異基因,以期為相關(guān)功能基因的研究以及波紋龍蝦養(yǎng)殖過程中水質(zhì)調(diào)控和抗環(huán)境因子變化脅迫等提供理論支持和數(shù)據(jù)支撐。

    波紋龍蝦隸屬于十足目(Decapoda)龍蝦科(Palinuroidea)龍蝦屬(),是我國沿海地區(qū)的重要經(jīng)濟種類,營養(yǎng)豐富,味道鮮美。目前波紋龍蝦基因組尚未測序完成,其基因序列信息比較匱乏,相關(guān)的分子遺傳基礎(chǔ)也很薄弱,分子生物學(xué)水平研究也較少,僅見李斌等研究了波紋龍蝦C-型凝集素PhLecA的基因克隆與表達(dá),Zhuo等研究了波紋龍蝦蛻皮激素受體的分子克隆、特征和表達(dá)分析,羅嘉俊等研究了波紋龍蝦GIH基因克隆、表達(dá)及其對光周期的響應(yīng)等。筆者采用三代測序技術(shù)的PacBio 單分子實時測序平臺對波紋龍蝦()進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測序,通過生物信息學(xué)方法進(jìn)行序列拼接、功能注釋、分類和代謝通路分析,獲取豐富的波紋龍蝦序列信息,旨在為進(jìn)一步挖掘波紋龍蝦相關(guān)功能基因、基因組學(xué)及開發(fā)分子標(biāo)記等研究奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    波紋龍蝦為購自海南省瓊海市青葛村,體質(zhì)量為21~57 g的幼龍蝦,采用干運法運回廣東海洋大學(xué)東海島生物研究基地,在20 m的水泥池中暫養(yǎng),用黑色幕布遮光,24 h不間斷充氣。試驗海水來源于自然海區(qū),鹽度為26‰~30‰,pH 為8.1~8.3,每天換水50%,投喂菲律賓蛤仔()等主要鮮活餌料,養(yǎng)殖21 d后開始試驗。取正常條件養(yǎng)殖下波紋龍蝦的肝胰腺、鰓、肌肉、性腺、眼柄和80 mg/L亞硝酸鹽(NaNO)脅迫7 d的肝胰腺(做3+2項目,取亞硝酸鹽脅迫混合作全長轉(zhuǎn)錄組,主要是為了進(jìn)行二代測序時方便篩選差異基因用于后續(xù)試驗),迅速放入RNAlater中保存,后用干冰保存寄往北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行RNA提取和相關(guān)測序。

    利用Trizol法分別對建庫及定量試驗所用的波紋龍蝦組織進(jìn)行RNA提取,使用1%瓊脂糖凝膠電泳分析RNA純度和完整性,Agilent 2100軟件準(zhǔn)確檢測RNA完整性,用Qubit 2.0軟件精確定量RNA濃度,Nanodrop軟件檢測RNA純度,并選擇符合測序標(biāo)準(zhǔn)的RNA等量混合用于文庫建設(shè)?;旌虾蟮腞NA樣品純度和完整性:6例混樣的Qubit濃度為112 μL,Qubit體積為39 μL,Qubit總量為4.368 μg,樣品純度1.949,1.303,Nano濃度為236.417 ng/μL,RIN值為3.8,NC/QC為2.11。結(jié)果表明,該例樣本基線平整,符合三代建庫標(biāo)準(zhǔn)。波紋龍蝦是水產(chǎn)低等動物,RNA只有單峰值,檢測時會出現(xiàn)其他峰值干擾從而導(dǎo)致RIN值較低的情況,但6例混樣的組織RIN值均符合二代測序要求。

    文庫的構(gòu)建流程如圖1,構(gòu)建好的文庫進(jìn)行質(zhì)量檢測后,在Illumina高通量測序平臺NovaSeq 6000進(jìn)行測序(諾禾致源科技有限公司,天津)。

    圖1 轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建Fig.1 Transcriptome library construction

    測序完成后對原始下機數(shù)據(jù)進(jìn)行去接頭和低質(zhì)量reads,得到高質(zhì)量數(shù)據(jù),采用軟件SMRTlink v8.0對高質(zhì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行序列組裝,得到波紋龍蝦的轉(zhuǎn)錄組基因數(shù)據(jù)(Unigene)庫。序列分析步驟分別是使用下機數(shù)據(jù)中subreads.bam文件通過CCS算法,對單分子多測序序列進(jìn)行自我更正,獲得CCS (circular consensus sequence)序列;通過檢測CCS是否包含poly-A、5′-primer、3′-primer,對CCS進(jìn)行分類并找出FLNC(full-length non chimera:全長非嵌合序列)序列和nFL(Non-Full-Length:非全長非嵌合序列)序列;將同一轉(zhuǎn)錄本的FLNC序列使用hierarchical n*log(n)算法聚類,得到consensus序列;最后對由此產(chǎn)生的全長序列進(jìn)行polish,獲得Polished consensus序列進(jìn)行后續(xù)分析。具體流程見圖2。

    全長轉(zhuǎn)錄組序列的功能注釋及結(jié)構(gòu)分析去冗余后的序列使用 CD-HIT 軟件進(jìn)行基因注釋,使用的數(shù)據(jù)庫包括:NR, KOG/COG,NT,Pfam,KEGG,Swiss-Prot,GO。

    2 結(jié)果與分析

    轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析。波紋龍蝦正常條件下的肝胰腺、鰓絲、眼柄、肌肉和性腺,以及亞硝酸鹽脅迫下的肝胰腺的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)見表1。堿基質(zhì)量及組成分析顯示,GC 含量區(qū)間為35.34%~48.26%,各組織樣品Q20堿基百分比不小于97.56%,Q30 堿基百分比不小于92.92%。這說明測序產(chǎn)出質(zhì)量符合要求,能用于后續(xù)組裝分析。轉(zhuǎn)錄本校正分析得出平均序列長度4 147 bp,N50為4 671 bp,注釋率為93.74%。

    圖2 Iso-Seq分析流程Fig.2 Iso-Seq analysis flow chart

    表1 數(shù)據(jù)產(chǎn)出質(zhì)量情況

    CDS預(yù)測。CDS(coding sequence)是編碼一段蛋白產(chǎn)物的序列。在全長轉(zhuǎn)錄組的測序結(jié)果中,預(yù)測蛋白質(zhì)編碼區(qū)有助于基因的初步分析,同時也是進(jìn)行后續(xù)蛋白結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)。利用ANGEL軟件進(jìn)行CDS預(yù)測分析,結(jié)果顯示共有1 043個基因片段可視為蛋白編碼區(qū),其序列長度為0~7 500 bp,主要集中于300~2 500 bp(圖3)。

    圖3 CDS長度分布Fig.3 The statistics of sequence length of CDS

    lncRNA分析。LncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt,不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子。由于建庫原理的限制,只能獲得含有polyA尾的lncRNA。使用CNCI、PLEK、CPC2軟件以及Pfam數(shù)據(jù)庫對PacBio測序數(shù)據(jù)進(jìn)行編碼潛能預(yù)測,最終分析得到3 105個LncRNA序列,其中共有數(shù)目為272個(圖4)。

    圖4 編碼潛能預(yù)測維恩圖Fig.4 Encoding potential prediction Venn diagram

    轉(zhuǎn)錄本分析。測序結(jié)果與數(shù)據(jù)組裝使用PacBio 測序平臺對波紋龍蝦鰓、肝胰腺、肌肉、性腺和眼柄等組織混樣進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測序,對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾,共獲得17 044 319個子序列(大小59.47 Gb),平均子序列長度為3 490 bp,N50為4 037 bp。通過每個ZMW孔中子序列的CCS聚類之后得到的序列數(shù)為517 682個,序列平均長度為4 181 bp,N50為4 965 bp。同時含有3′引物和5′引物,以及3′引物前含有polyA尾的全長序列(Full-Length,F(xiàn)L)459 737個,全長非嵌合序列(Full-Length non-chimericRead,F(xiàn)LNC)458 653個,序列平均長度為4 094 bp,N50為4 919 bp ,F(xiàn)LNC/CCS為88.60%。全長轉(zhuǎn)錄組得到改良后一致序列21 524個,10 425個Unigenes(圖5),序列平均長度為4 008 bp,N50為4 474 bp。

    圖5 波紋龍蝦轉(zhuǎn)錄本的長度分布Fig.5 Length distribution of Panulirus homarus Unigene

    Unigene的功能注釋NR數(shù)據(jù)庫注釋到Unigene的數(shù)量最多,為9 580個,NT數(shù)據(jù)庫注釋到的最少,僅3 498個(圖6)。

    圖6 七大數(shù)據(jù)庫注釋統(tǒng)計結(jié)果Fig.6 Annotation statistical results of seven databases

    NR分析。NR數(shù)據(jù)庫注釋將波紋龍蝦轉(zhuǎn)錄組所獲得的單基因簇序列在NR數(shù)據(jù)庫中比對,共比對到358個物種,其中鉤蝦()的同源序列最多,為3 865 個,占注釋序列總數(shù)的 40.34%,推測波紋龍蝦與鉤蝦同源性較高;其次為濕木白蟻()563個,美洲鱟()291個,大型蚤()282個,凡納濱對蝦 ()171個,斑節(jié)對蝦()162個,鴨嘴舌形貝()142個,淡水枝角水蚤()134個,中華絨螯蟹()128個,葉蟬()103個,日本囊對蝦()96個,白氏文昌魚()92個,囊舌蟲()91個,赤擬谷盜()83個,鞘翅鳥()82個,溫室希蛛()74個,裸長角蟲兆()72個,淡水螯蝦()70個,紅螯螯蝦()68個,克氏原螯蝦()66個,其他物種2 945個。

    GO 功能注釋。GO 功能注釋結(jié)果見圖7~9,共有7 585條Unigenes被注釋分類,從細(xì)胞組分可細(xì)分為16 類,占比最多的是細(xì)胞(cell)和細(xì)胞組成(cell part)(44.85%),其次為細(xì)胞器(organelle)(17.57%)(圖7)。從分子功能細(xì)分為10類,其中捆綁(binding)包含Unigenes最多(64.31%),催化活性(catalytic activity)次之(41.08%)(圖8)。生物學(xué)過程可細(xì)分為24 類,細(xì)胞過程(cellular process)包含Unigenes最多(42.50%),代謝過程(Metabolic process)類次之(40.07%)(圖9)。

    圖7 細(xì)胞組分Fig.7 Cellular component

    圖8 分子功能Fig.8 Molecular function

    圖9 生物學(xué)過程Fig.9 Biological process

    KOG 功能分類。KOG功能注釋結(jié)果共有7 436條 Unigenes 被注釋分類,分布于26 類(圖10)。其中只是一般功能預(yù)測類共有1 421條注釋信息,占比最大 (19.11%),其次為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制,有1 238條注釋信息(16.65%),未知蛋白僅有7條(7.13%)。

    KEGG功能注釋分析。KEGG功能注釋結(jié)果顯示,共有9 254條 Unigenes 被注釋分類,分布于 347 個已知途徑中,其中前 12 個代謝途徑,注釋基因數(shù)占總量的 25.26%。前 5 個途徑分別是心肌細(xì)胞的腎上腺素能信號(ko04261)289 條、病毒性心肌炎(ko05416)254 條、心臟肌肉收縮(ko04260)236 條、癌癥中的蛋白多糖(ko05205)200 條和局部黏連(ko04510)191 條(表2)。

    表2 前12個代謝途徑基因數(shù)量Table 2 Number of genes in the first 12 metabolic pathways

    轉(zhuǎn)錄因子分析。轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor,TF)作為一類特殊的DNA結(jié)合蛋白,可與基因5′末端上游的特定序列結(jié)合,使目的基因可以特定時空表達(dá),通過轉(zhuǎn)錄因子與其他相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用來激活或抑制轉(zhuǎn)錄效果,發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。動物轉(zhuǎn)錄因子鑒定使用動物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫—animal TFDB 2.0預(yù)測到轉(zhuǎn)錄因子家族共有543個,屬于29個家庭(圖11),其中轉(zhuǎn)錄因子家族較多的有:zf-C2H2家族有190個、ZBTB家族有110個,TEA家族最少,只有1個,這些轉(zhuǎn)錄因子家族成員的獲取可為后期波紋龍蝦生長發(fā)育、代謝調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答等相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

    3 討論

    轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)是一種成本低,能快速獲取大量轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)并對研究生物體生物學(xué)特性、基因功能、相關(guān)代謝途徑和信號通路等具有重要作用的測序技術(shù)。轉(zhuǎn)錄組測序分析技術(shù)廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖相關(guān)研究中,并已成為研究環(huán)境脅迫對甲殼動物免疫、生長、繁殖以及蛻殼等過程的影響的重要手段之一。

    圖10 KOG數(shù)據(jù)庫注釋統(tǒng)計Fig.10 KOG database annotation statistics

    圖11 轉(zhuǎn)錄因子分析Fig.11 Transcription factor analysis

    該研究對波紋龍蝦全長轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序及分析,共獲得21 524個轉(zhuǎn)錄本,10 425個Unigenes,轉(zhuǎn)錄本校正分析得出平均序列長度為4 147 bp,N50為4 671 bp,注釋率為93.74%,測序結(jié)果可以看出,組裝得到序列完整性較好。利用NR、NT、KOG、KEGG等七大公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋分類,有9 580 個獲得NR數(shù)據(jù)庫注釋,對比到358個物種,與鉤蝦對比的同源信息最多,占40.34%,推測可能是由于鉤蝦與波紋龍蝦的進(jìn)化史和繁殖習(xí)性較為相似。將獲得的波紋龍蝦單基因簇與GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配,有7 585個得到GO注釋,被劃分到BP、CC及MF3大類,涵蓋上述功能類別的50個亞類。通過KOG數(shù)據(jù)庫對比波紋龍蝦單基因簇,共有7 436個獲得注釋信息,共分為26個功能組分。與KEGG數(shù)據(jù)庫對比,最終波紋龍蝦單基因簇注釋到6大類43小類,其中基因數(shù)量較多的代謝通路有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制通路887個。李喜蓮等進(jìn)行紅螯螯蝦肝臟、卵巢和精巢二代測序獲得了6 736條Unigene,注釋到GO為16 989個,注釋到COG為4 697個,注釋到KEGG為9 842個。陳雪峰等對羅氏沼蝦卵巢4個不同發(fā)育期進(jìn)行2代測序產(chǎn)生了95 379個Unigenes,注釋到GO為6 422個,注釋到KEGG為8 423個。沈曄等進(jìn)行脊尾白蝦對低鹽脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,結(jié)果獲得了72 734 條Unigenes,注釋到NR為21 931個。由此看出,單分子實時測序技術(shù)獲得的序列質(zhì)量、基因數(shù)量和注釋基因信息優(yōu)于第二代測序。

    李斌等用波紋龍蝦肝胰腺和卵巢組織的mRNA表達(dá)譜進(jìn)行了2代轉(zhuǎn)錄組測序,測序結(jié)果與該研究3代測序結(jié)果相差較大,2代測序總Unigene 74 124個,而該研究為10 425個,造成3代測序的Unigene比2代少的原因是3代測序進(jìn)行了無參轉(zhuǎn)錄組對照測序,只能比對到其他數(shù)據(jù)庫,這樣測序出來的結(jié)果就遠(yuǎn)比2代的少。2代測序基因功能注釋率為33.80%,該研究為93.74%;2代測序僅14.00%注釋到GO數(shù)據(jù)庫,22.70%注釋到KEGG代謝途徑,12.00%注釋到COG蛋白數(shù)據(jù)庫。造成這種結(jié)果的原因可能是對波紋龍蝦開展研究少,國內(nèi)外對波紋龍蝦的研究報道也相對較少,在NCBI數(shù)據(jù)庫中找到龍蝦屬的核酸序列不足1 000條;也有可能是個體間的差異較大和測序上樣量的不同,2代測序和3代測序條件和方法有所差異。生物分子數(shù)據(jù)庫的完善對波紋龍蝦的研究、養(yǎng)殖和保護(hù)起著重要作用,因此加大波紋龍蝦的分子生物學(xué)研究力度至關(guān)重要。

    Zhang等通過凡納濱對蝦全長轉(zhuǎn)錄組文庫獲得72 648條高質(zhì)量序列,Wang等通過對中國對蝦進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組文庫測序獲得10 795條高質(zhì)量序列。該研究通過波紋龍蝦全長轉(zhuǎn)錄組文庫最終獲得10 425條高質(zhì)量序列,較斑節(jié)對蝦、凡納濱對蝦和中國對蝦少,這可能是物種之間的差異。這些數(shù)據(jù)為進(jìn)一步了解波紋龍蝦的生物學(xué)特性、基因功能、相關(guān)代謝途徑和信號通路等提供理論基礎(chǔ),為后續(xù)研究提供一定參考。

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