柴胡疏肝散“異病同治”治療抑郁癥、失眠障礙及偏頭痛作用機制的網(wǎng)絡藥理學研究

劉 毅，李 菲，賈躍進，郝世飛

抑郁癥(depression disorder，DD)、失眠障礙(insomnia disorder，ID)和偏頭痛(migraine)都是神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病，可對人們身心健康造成很大的危害[1]，研究顯示，這些疾病常伴發(fā)為合并病[2]，并可相互誘發(fā)、促進，其發(fā)病機制存在關聯(lián)，臨床用藥也有交集[1，3-6]。盡管目前現(xiàn)代醫(yī)學對于這些疾病有多種可供選擇的藥物，但仍缺乏理想藥物[7-9]。中醫(yī)藥具有整體性以及多靶點、多途徑發(fā)揮作用的特點，臨床應用安全有效，因此，挖掘中醫(yī)藥可為抑郁癥、失眠障礙、偏頭痛的藥物治療提供思路與參考。

柴胡疏肝散出自《醫(yī)學統(tǒng)旨》，由柴胡、川芎、白芍、枳殼、陳皮、甘草、香附七味中藥組成，是疏肝理氣的代表方劑，臨床常用于治療包括神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病在內(nèi)的多種疾病[10]。其中神經(jīng)系統(tǒng)疾病主要以抑郁癥、失眠障礙、偏頭痛為主，臨床研究亦證實其安全有效[11-13]。此外中藥復方“異病同治”是通過多成分、多靶點、多通路而發(fā)揮作用，具有復雜網(wǎng)絡的特質(zhì)[14]，因此，運用網(wǎng)絡藥理學方法可一定程度揭示其作用機制。

1 資料與方法

1.1 藥物有效成分、靶點搜集與方劑-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡構(gòu)建 在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)中檢索柴胡疏肝散各藥物有效成分及相關靶點，并限定口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、血腦屏障(blood brain barrier，BBB)≥-0.3、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18進行篩選，將所得靶點在UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)中匹配基因名。然后再以方劑、藥物、有效成分及相關靶點為節(jié)點，其相互關系為邊通過CytoscapeV3.6.1構(gòu)建網(wǎng)絡。

1.2 疾病靶點與藥物-疾病交集靶點搜集 在GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/#)數(shù)據(jù)庫中分別檢索“depression disorder”“insomnia disorder”和“migraine”以搜集疾病靶點。再取藥物有效成分靶點與各疾病靶點的交集，從而獲得柴胡疏肝散有效成分中直接作用于3種疾病的靶點，并利用微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)繪制韋恩圖。

1.3 疾病-方劑-有效成分-交集靶點網(wǎng)絡和蛋白-蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡構(gòu)建 以疾病、方劑、有效成分以及所得3類交集靶點為節(jié)點，其相互關系為邊，使用Cytoscape構(gòu)建疾病-方劑-有效成分-交集靶點網(wǎng)絡。再將3類交集靶點分別導入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，限定物種為智人，并利用Cytoscape軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡，利用內(nèi)置網(wǎng)絡分析功能限定節(jié)點度值篩選PPI網(wǎng)絡核心靶點。

1.4 基因本體(Gene ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析 在Metascape(https://metascape.org/)數(shù)據(jù)庫平臺中導入3類交集靶點并分別進行GO生物過程、分子功能及細胞成分富集分析和KEGG通路富集分析，然后利用在線作圖平臺ImageGP(http://www.ehbio.com/ImageGP/)繪制其富集氣泡圖。

1.5 核心成分和核心靶點分子對接 取疾病-方劑-有效成分-交集靶點網(wǎng)絡中節(jié)點度大于2倍中位數(shù)的核心有效成分和PPI網(wǎng)絡中節(jié)點度大于1.5倍中位數(shù)的核心靶點，利用PDB(http://www.rcsb.org/)及Zinc(http://zinc.docking.org/)數(shù)據(jù)庫分別獲得核心靶點和核心成分的3D結(jié)構(gòu)，預處理后應用AutoDock vina分子對接，并在Pymol中可視化結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 柴胡疏肝散有效成分、相關靶點搜集與方劑-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡構(gòu)建結(jié)果 通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫及限定藥物OB、BBB、DL篩選有效成分(見表1)，經(jīng)去重排除后，共搜集到柴胡疏肝散 95種有效成分，138個關聯(lián)靶點。其方劑-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡構(gòu)建如圖1所示，該網(wǎng)絡有241個節(jié)點、1 249條邊，通過分析該網(wǎng)絡，篩選節(jié)點度較大的有效成分和靶點，可見柴胡疏肝散中主要的有效成分為7-甲氧基-2-甲基異黃酮、芒柄花黃素、羅通定、β-谷甾醇、豆甾醇、川陳皮素等；主要靶點為PTGS2、ESR1、NOS2、AR、PPARG等。

表1 柴胡疏肝散主要有效成分基本信息

圖1 方劑-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(CHSGS為柴胡疏肝散；CH為柴胡；CX為川芎；BS為白芍；ZQ為枳殼；CP為陳皮；GC為甘草；XF為香附)

2.2 疾病靶點與藥物-疾病交集靶點搜集結(jié)果 在GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索各疾病并將所得疾病靶點篩選、合并、去重、規(guī)范，得到抑郁癥、失眠障礙和偏頭痛靶點分別為4 777個、994個、1 748個。將柴胡疏肝散的138個靶點分別與其取交集(見圖2)，得到柴胡疏肝散-抑郁癥交集靶點113個，柴胡疏肝散-失眠障礙交集靶點43個，柴胡疏肝散-偏頭痛交集靶點63個。

圖2 藥物-疾病交集靶點

2.3 疾病-方劑-成分-靶點網(wǎng)絡和PPI網(wǎng)絡構(gòu)建結(jié)果 疾病-方劑-有效成分-交集靶點網(wǎng)絡構(gòu)建詳見圖3。圖中包含213個節(jié)點、1 273條邊。利用Cytoscape分析網(wǎng)絡計算節(jié)點度，分別篩選出與各個疾病相關的節(jié)點度較大(DC>2倍中位數(shù))的核心成分(見表2)。然后將3類交集靶點分別導入STRING數(shù)據(jù)庫，選定物種為智人，得出以靶點為節(jié)點，蛋白互作關系為邊的PPI網(wǎng)絡(見圖4)，其中柴胡疏肝散-抑郁癥的PPI網(wǎng)絡節(jié)點數(shù)為113個，邊數(shù)為875條，平均節(jié)點度為15.5，平均局部聚類系數(shù)為0.543；柴胡疏肝散-失眠障礙的PPI網(wǎng)絡節(jié)點數(shù)為43個，邊數(shù)為196條，平均節(jié)點度為9.12，平均局部聚類系數(shù)為0.697；柴胡疏肝散-偏頭痛的PPI網(wǎng)絡節(jié)點數(shù)為63個，邊數(shù)為341條，平均節(jié)點度為10.8，平均局部聚類系數(shù)為0.641，再通過Cytoscape分析3個PPI網(wǎng)絡，分別篩選節(jié)點度大于1.5倍中位數(shù)的靶點為核心靶點，具體核心靶點詳見表2。

圖3 疾病-方劑-成分-靶點網(wǎng)絡(CHSGS為柴胡疏肝散)

圖4 柴胡疏肝散治療抑郁癥、失眠障礙、偏頭痛的PPI核心靶點網(wǎng)絡圖(A為柴胡疏肝散治療抑郁癥的PPI網(wǎng)絡；B為柴胡疏肝散治療失眠障礙的PPI網(wǎng)絡；C為柴胡疏肝散治療偏頭痛的PPI網(wǎng)絡)

2.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果 將2.2中的3類交集靶點分別導入Metascape中進行GO和KEGG通路富集分析，其中柴胡疏肝散-抑郁癥的GO富集分析共獲得1 503條結(jié)果，其中生物過程1 255條，分子功能149條，細胞成分99條，另外KEGG通路富集分析得到148條結(jié)果。由結(jié)果可得，生物過程包括突觸信號、對有毒物質(zhì)的反應、細胞對激素刺激的反應、對銨離子的反應等；分子功能涉及神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、G蛋白偶聯(lián)的胺受體活性、G蛋白偶聯(lián)的乙酰膽堿受體活性等；細胞成分則包括突觸后膜、多巴胺能突觸、受體復合體等；涉及主要通路包括：神經(jīng)活性配體-受體相互作用、膽堿能突觸、多巴胺能突觸、血清素能突觸等。柴胡疏肝散-失眠障礙的GO富集分析共獲得649條結(jié)果，其中生物過程518條，分子功能78條，細胞成分53條，而KEGG通路富集分析得到39條結(jié)果。從結(jié)果來看，生物過程包括化學突觸傳遞、單胺運輸、細胞對激素刺激的反應、腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號通路、對類固醇激素的反應等；分子功能涉及腎上腺素受體活性、激素結(jié)合、類固醇結(jié)合等；細胞成分則包括突觸膜的組成部分、多巴胺能突觸、受體復合體等；涉及主要通路則包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用、多巴胺能突觸、膽堿能突觸、雌激素信號通路等。柴胡疏肝散-偏頭痛的GO富集分析共獲得914條結(jié)果，其中生物過程741條，分子功能條108，細胞成分65條，此外KEGG通路富集分析得到82條結(jié)果。根據(jù)結(jié)果可得，生物過程包括：行為、突觸信號、單胺運輸、腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號通路、細胞對激素刺激的反應等；分子功能涉及腎上腺素受體活性、多巴胺結(jié)合、銨離子結(jié)合等；細胞成分則包括：突觸后膜、膜筏等；涉及主要通路包括：神經(jīng)活性配體-受體相互作用、可卡因成癮、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)信號通路等。然后限定P<0.01，最小計數(shù)為3，富集因子>1.5篩選結(jié)果，繪制富集氣泡圖，詳見圖5～圖8。再分別以疾病、交集靶點、通路為節(jié)點，其相互關系為邊構(gòu)建網(wǎng)絡，以直觀表明三者關聯(lián)(見圖9)，據(jù)該網(wǎng)絡可知神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路極大可能是柴胡疏肝散治療3種疾病過程中都最為關鍵的通路，因此，可認為柴胡疏肝散最可能藉由此通路對這些疾病產(chǎn)生作用，其通路的具體機制詳見圖10。

圖5 柴胡疏肝散-抑郁癥的GO富集分析氣泡圖

圖6 柴胡疏肝散-失眠障礙的GO富集分析氣泡圖

圖7 柴胡疏肝散-偏頭痛的GO富集分析氣泡圖

圖8 KEGG富集分析氣泡圖

圖9 疾病-靶點-通路關系圖

圖10 神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路機制

2.5 核心成分與核心靶點分子對接結(jié)果 核心成分與核心靶點分子對接結(jié)果均<-20.92 kJ/mol，可見其核心成分與核心靶點的組合在預測中都可形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)(見表2)。然后取每種疾病中核心成分與核心靶點對接分數(shù)最小(分數(shù)越小表示結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定)的組合運用Pymol對其構(gòu)象可視化，其中綠色部分為靶點，黃色部分為成分分子，粉色標記殘基，并顯示其名稱，黃色虛線為氫鍵，并標距離。詳見圖11。

表2 核心活性成分與核心靶點分子對接結(jié)果 單位：kJ/mol

圖11 抑郁癥、失眠障礙、偏頭痛中對接最好的核心成分與核心靶點的分子對接構(gòu)象

3 討 論

3.1 中醫(yī)理論 從“肝”論治 抑郁癥、失眠障礙、偏頭痛分別屬于中醫(yī)學的“郁證”“不寐”“頭痛”范疇?！兜は姆ā酚涊d：“氣血沖和，萬病不生，一有怫郁，諸病生焉。故人身諸病，多生于郁”[15]。說明疾病發(fā)生的物質(zhì)基礎是氣血的運行不暢，而“氣為血之帥”“氣行則血行”，可進一步得出氣的運行是疾病發(fā)生的最關鍵環(huán)節(jié)。另有“凡郁皆肝病也”之說，可見“肝”作為氣機運行的樞紐，其功能異常則會導致“氣郁”，從而發(fā)為各種疾病。加之現(xiàn)代人的生活壓力較大，生活節(jié)奏較快，情志往往不遂。情志不舒，肝氣郁滯，臟腑陰陽氣血失調(diào)發(fā)為郁證；情志不暢，氣機郁滯，營衛(wèi)陰陽運行失常發(fā)為不寐；情志不調(diào)，氣血郁遏，不通則痛則發(fā)為頭痛。因此，這3種疾病總體而言都與“肝郁氣滯”密切相關，柴胡疏肝散疏肝解郁、活血止痛，可對抑郁癥、失眠障礙、偏頭痛對證治療。

3.2 構(gòu)建網(wǎng)絡篩選核心靶點與成分 綜合分析本研究構(gòu)建的方劑-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡與疾病-方劑-有效成分-交集靶點網(wǎng)絡得出的11種核心有效成分，其中成分A是具有多種功能的植物固醇，可激活細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)-環(huán)磷酸腺苷(cAMP)反應元件結(jié)合蛋白(CREB)等途徑而促進神經(jīng)和突觸形成[16]，并可通過減少氧化應激和炎癥來保護大腦[17]，對于精神病癥狀，動物實驗證實植物固醇可升高γ-氨基丁酸(GABA)、谷胱甘肽水平，降低多巴胺(DA)、丙二醛、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平和乙酰膽堿酯酶(AChE)的活性[18]；成分羅通定是一種小檗堿，可作為腎上腺素能藥物、抗精神病藥物和多巴胺受體拮抗劑[19]；成分E是一種類黃酮物質(zhì)，具有神經(jīng)營養(yǎng)、保護作用，并且在動物模型中可發(fā)揮抗抑郁作用，此作用涉及血清素能、去甲腎上腺素能或多巴胺能系統(tǒng)的參與[20]；成分D是一種主要的植物甾醇，研究認為其有抗焦慮及鎮(zhèn)靜作用[21]，同時可抑制炎癥反應而發(fā)揮神經(jīng)保護作用[22]；光甘草酮、4′-甲氧基光甘草定、甘草果苷、光甘草輪、美迪紫檀素、芒柄花黃素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮等成分都屬于甘草中的黃酮類[23]，此類物質(zhì)被報道有抗抑郁、神經(jīng)保護等作用[24]。通過分析PPI網(wǎng)絡得到柴胡疏肝散作用于3種疾病的24個核心靶點，其中MAPK1、MAPK8、MAPK14編碼MAP激酶，MAPK1是一種已知的與抑郁、焦慮相關的信號分子[25]，MAPK8在成人新生顆粒細胞中的排他性抑制可緩解焦慮、抑郁[26]，MAPK14則已被證實可被柴胡疏肝散通過對其調(diào)節(jié)作用而發(fā)揮抗抑郁作用[27]；有動物實驗證實小膠質(zhì)細胞STAT3通過神經(jīng)元巨噬細胞集落刺激因子介導的突觸活動調(diào)節(jié)與抑郁相關的行為，表明抑制小膠質(zhì)細胞STAT3可能是抑郁癥的一種新的治療策略[28]；SIRT1被認為是抑郁癥的潛在基因靶標[29]；MMP已被證明在大腦的許多生理和病理過程中起著至關重要的作用，尤其是包括抑郁癥在內(nèi)的多種精神病[30]；ESR1、AR分別編碼雌激素、雄激素受體，雌二醇水平的變化與認知、情緒調(diào)節(jié)和抑郁癥易感性的變化有關，而雄激素水平低的男性使用雄激素替代療法可改善抑郁癥[31]，前列腺癌男性的雄激素剝奪療法可導致抑郁癥[32]；MAOA、MAOB、ADRA2C、ADRA2A、DRD2、HTR3A、SLC6A4、CHRNA4、ACHE、OPRM1所編碼的蛋白包括腎上腺素、多巴胺、5-羥色胺、乙酰膽堿酯、mu阿片類受體、單胺氧化酶、5-羥色胺轉(zhuǎn)運蛋白、乙酰膽堿酯酶，參與調(diào)控涉及腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺、5-羥色胺、乙酰膽堿酯等的神經(jīng)遞質(zhì)，而這些神經(jīng)遞質(zhì)參與睡眠-覺醒的調(diào)控、抑郁癥癥狀的調(diào)節(jié)以及偏頭痛的發(fā)生[33-34]；PTGS2編碼的環(huán)加氧酶可通過多種途徑發(fā)揮神經(jīng)保護作用[35]；CREB1編碼的蛋白參與包括晝夜節(jié)律同步的多種細胞過程[36]，并與快速眼動(REM)睡眠在抑郁癥中的作用有關[37]。

3.3 富集分析預測機制 由GO富集分析可以看出柴胡疏肝散治療抑郁癥、失眠障礙及偏頭痛的主要生物過程、分子功能和細胞成分都與以上所述神經(jīng)遞質(zhì)以及一些激素密切相關；而對于三者的通路則可以看出可能性最大的依然是神經(jīng)活性配體-受體相互作用、膽堿能突觸、多巴胺能突觸、血清素能突觸等諸如此類通路。從分子對接結(jié)果可得，所有核心成分均可能與核心靶點形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，將其進一步進行數(shù)據(jù)分析，可得柴胡疏肝散治療抑郁癥對接較好的核心成分有豆甾醇、光甘草酮、4′-甲氧基光甘草定等，對接較好的核心靶點有PTGS2、MMP9、DRD2、SIRT1等；柴胡疏肝散治療失眠障礙對接較好的核心成分有β-谷甾醇、豆甾醇、芒柄花黃素等，對接較好的核心靶點有MAOB、MAOA、DRD2等；柴胡疏肝散治療偏頭痛對接較好的核心成分有β-谷甾醇、豆甾醇、芒柄花黃素等，對接較好的核心靶點有SLC6A4、DRA2A、DRD2等?？蓪⑦@些成分和靶點視為柴胡疏肝散治療這些腦病關鍵成分和關鍵靶點。

綜上所述，根據(jù)中醫(yī)理論以及網(wǎng)絡藥理學和分子對接的分析可以最終得出柴胡疏肝散治療抑郁癥、失眠障礙、偏頭痛的可能關鍵成分為β-谷甾醇、豆甾醇、芒柄花黃素、光甘草酮、4′-甲氧基光甘草定，可能關鍵靶點為PTGS2、MMP9、SIRT1、MAOB、MAOA、DRD2、SLC6A4、DRA2A，即最可能通過胺類神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮作用，其作用的主要通路則最可能是神經(jīng)活性配體-受體相互作用、膽堿能突觸、多巴胺能突觸、血清素能突觸等。此結(jié)論可為進一步研究和臨床應用提供一定思路和參考。