艾灸對菌群失調(diào)幼鼠結腸黏膜屏障的影響

姚雪含，劉喜平，朱中博

甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000

人體胃腸道通過多個生態(tài)系統(tǒng)的作用形成一個相對穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，其中，穩(wěn)定的腸道菌群及結腸黏膜對維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)有重要作用。一旦菌群受到破壞，有害菌過度增殖，進而影響結腸黏膜的保護作用，可引發(fā)功能性胃腸疾病或炎癥性相關疾病。因此，平衡腸道菌群及預防結腸黏膜損傷，對構建幼兒菌群平衡及防治腸上皮屏障損傷相關胃腸道疾病具有重要意義。

艾灸是一種中醫(yī)傳統(tǒng)外治法，具有溫經(jīng)散寒、扶正祛邪、平衡陰陽作用。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，艾灸可發(fā)揮溫熱作用，同時，艾煙及艾灰對機體神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等多系統(tǒng)發(fā)揮調(diào)節(jié)、治療作用。通過刺激特定穴位，艾灸可發(fā)揮特定的靶向作用，還能通過下調(diào)促炎因子表達，對結腸黏膜起到抗炎修復作用。臨床研究表明，艾灸能調(diào)節(jié)患者腸道菌群結構，修復損傷的腸道屏障。實驗研究發(fā)現(xiàn)，艾灸預處理“天樞”對大鼠腸黏膜屏障具有保護作用。關元溫腎以補虛、健脾而化濕，總領溫陽化濕之意，標本兼治；神闕為周身神氣通行之門戶，具有振奮周身陽氣、助陽化濕作用，同時促進經(jīng)氣運行，通利氣機；中脘為脾胃氣機升降之樞紐，可健運脾胃，使水谷運化有權，水津分布有法，從根源上杜絕水濕蓄積；天樞為機體升清降濁之樞紐，可助大腸泌別清濁、淡滲利濕，使水濕之邪有路可出，同時天樞為陽明經(jīng)之募穴，陽明經(jīng)為多氣多血之經(jīng)，可行氣活血、健脾利濕。四穴共用，可益火生氣、化濕和中，使氣機流轉(zhuǎn)順達。因此，本實驗通過觀察艾灸“神闕”“中脘”“關元”“天樞”對菌群失調(diào)幼鼠結腸黏膜屏障的影響，從腸道菌群角度探討艾灸保護結腸黏膜的機制。

1 實驗材料

1.1 動物

3～4 周齡 SPF 級雄性 Balb/c 幼鼠 50 只，體質(zhì)量10～15 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號SCXK（京）2016-0006，飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級動物房，溫度22～25 ℃，相對濕度45%～60%。本研究經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學倫理委員會批準（2020-264）。

1.2 試劑

細艾條（直徑7 mm，時時康艾灸堂），甲硝唑、硫酸新霉素、可溶性兩性霉素B、脂多糖（北京索萊寶科技有限公司，批號分別為827L021、702I0512、511B059、408Z033），鹽酸萬古霉素（上海源葉生物科技有限公司，批號H13M11Y113102），氨芐西林膠囊（珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司中山分公司，批號96003103），雙歧桿菌四聯(lián)活菌片（杭州遠大生物制藥有限公司，批號202005244），多聚甲醛溶液、PBS、中性樹膠、伊紅、蘇木素（北京索萊寶科技有限公司，批號分別為 20191202、20200709、G8590、G1100、G1080），Occludin 抗體、ZO-1 抗體（英國 Abcam 公司，貨號分別為ab216327、ab96587）。

1.3 儀器

PCR儀（美國Bio-Rad公司，型號T100），臺式電熱恒溫鼓風干燥箱（余姚市星辰儀表廠，型號101-00），切片機（德國LEICA，型號2016），水浴鍋（江蘇榮華公司，型號SHA-C），顯微鏡（日本OLYMPUS，型號IX51），轉(zhuǎn)膜儀（北京君意東方電泳設備有限公司，型號JY-ZY5），電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司，型號JY-SCZ2＋），高速冷凍離心機（美國BECKMAN，型號Microfuge 22R），超低溫冰箱（中科美菱低溫科技公司，型號DW-HL528），搖床（海門市麒麟醫(yī)用儀器廠，型號TS-92），酶標儀（美國Thermo公司，型號Multiskan MK3），數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司，型號ChemiDoc MP），恒溫水浴鍋（常州市江南儀器廠，型號HH-1）。

2 實驗方法

2.1 溶液配制

參考文獻[8]方法，將氨芐西林、鹽酸萬古霉素、甲硝唑、硫酸新霉素、兩性霉素B用生理鹽水溶解，得到濃度分別為10、5、10、10、0.1 mg/mL的混合抗生素溶液。雙歧桿菌四聯(lián)活菌片用生理鹽水溶解，配制成濃度為68 mg/mL。

2.2 分組、造模及干預

50只幼鼠常規(guī)適應性飼養(yǎng)1周后，隨機抽取10只作為空白組，其余幼鼠每12 h予混合抗生素溶液灌胃（氨芐西林100 mg/kg、鹽酸萬古霉素50 mg/kg、甲硝唑100 mg/kg、硫酸新霉素100 mg/kg、兩性霉素B 1 mg/kg）復制抗生素暴露模型，灌胃體積10 mL/kg，連續(xù)灌胃14 d后，將幼鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組、陽性藥組、艾灸組和聯(lián)合組，每組10只。艾灸組固定于鼠板，將艾條固定在艾灸架上，垂直“神闕”“中脘”“關元”“天樞”上方點燃施灸，每穴4壯，15 min/次，施灸過程中使用表面測溫儀測定體表溫度，適時去除艾灰，調(diào)整施灸高度，確保體表溫度在40 ℃左右；陽性藥組予雙歧桿菌四聯(lián)活菌片溶液0.68 g/kg灌胃，灌胃體積10 mL/kg，同時固定相同時間；聯(lián)合組艾灸同時予0.68 g/kg雙歧桿菌四聯(lián)活菌片溶液灌胃。1次/d，連續(xù)14 d?？瞻捉M只固定不干預，模型組予等量生理鹽水灌胃，同時固定相同時間。

2.3 腸道菌群結構及多樣性檢測

末次干預12 h后收集幼鼠糞便（約200 mg），放于1.5 mL EP管中，置于-80 ℃冰箱保存，用于測序分析。采用Illumina NovaSeq測序平臺，提取全基因組DNA，以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域，使用帶Barcode的特異引物和高效高保真酶進行PCR，PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用TruSeqDNA PCR-Free Sample Preparation Kit進行文庫構建，經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，NovaSeq6000進行上機測序。利用Uparse 算法（http://www.drive5.com/uparse/）對所有樣品的全部有效數(shù)據(jù)進行聚類，默認以97%的一致性將序列聚類成為OTUs，篩選出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列，作物種注釋分析（設定閾值為0.8～1），并根據(jù)OTU分類對腸道菌群的α、β多樣性及物種差異進行分析。本實驗由蘇州帕諾米克生物醫(yī)藥科技有限公司提供技術支持。

2.4 結腸組織病理形態(tài)觀察

收集糞便6 h后，各組幼鼠均按10 mg/kg腹腔注射脂多糖（3 mg/mL）誘導腸道炎性反應。12 h后脫頸處死幼鼠，收集結腸組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，進行常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片（厚度5 μm），二甲苯脫蠟5 min×2次，蘇木素染色3 min，水洗1 min，伊紅染色2 min，水洗30 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察結腸組織病理變化。

2.5 結腸組織Occludin、ZO-1蛋白表達檢測

切取近端結腸組織約200 mg，剪碎后加入1 mL裂解液，冰上研磨30 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清液，BCA法測定蛋白濃度；加入5×loading buffer，水浴加熱變性后，每孔15 μL上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；滴加Occludin、ZO-1一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST洗膜5次，每次6 min；滴加二抗（1∶4 000），室溫孵育90 min，TBST洗膜5次，每次6 min；TBS浸泡2 min，ECL發(fā)光液顯影，數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)成像，采用Image J 8.0軟件測量條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達量。

3 統(tǒng)計學方法

4 結果

4.1 艾灸對模型幼鼠腸道菌群結構及多樣性的影響

4.1.1 物種分布情況

在門分類水平上，空白組幼鼠腸道擬桿菌門與厚壁菌門豐度之和超過總微生物群落的90%；變形菌門豐度較低，為4%；疣菌門豐度不足1%。模型組幼鼠腸道微生物群落豐度發(fā)生變化，與空白組比較，模型組幼鼠腸道擬桿菌門、厚壁菌門豐度顯著減少（＜0.01），變形菌門豐度顯著增加（＜0.01），疣菌門差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）；與模型組比較，陽性藥組、艾灸組和聯(lián)合組幼鼠腸道擬桿菌門豐度顯著增加（＜0.01），變形菌門豐度顯著減少（＜0.01），艾灸組幼鼠腸道厚壁菌門、疣菌門豐度顯著增加（＜0.01），陽性藥組及聯(lián)合組腸道厚壁菌門、疣菌門豐度差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）。見表1、圖1。

表1 各組幼鼠腸道菌群門水平豐度比較（，%）

圖1 門分類水平下各組幼鼠腸道菌群相對豐度比較

4.1.2 α多樣性分析

α多樣性可以反映樣品內(nèi)微生物群落的豐富度和多樣性，常用物種累積箱形圖和一系列分析指數(shù)表示。各組幼鼠的物種累積箱形圖顯示，物種數(shù)量隨著樣本量的增加趨于平緩，表明本實驗樣本量充足，足夠反映樣品的菌群數(shù)量。見圖2。

圖2 各組幼鼠腸道菌群物種累積箱形圖

物種多樣性指數(shù)包括Shannon、 Simpson，Shannon越高、Simpson越低，表示菌群多樣性越高，物種分布越均勻。物種豐富度指數(shù)包括Chao1、ACE，Chao1、ACE越高，表示物種豐富度越高。與空白組比較，模型組幼鼠腸道菌群Shannon、Chao1、ACE均顯著降低（＜0.01），Simpson顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組、艾灸組和聯(lián)合組幼鼠腸道菌群Shannon 顯著升高（＜0.01），Simpson 顯著降低（＜0.01），陽性藥組幼鼠腸道菌群Chao1、ACE均顯著降低（＜0.05）。見表2。

表2 各組幼鼠腸道菌群α多樣性比較（）

4.1.3 β多樣性分析

β多樣性分析是對不同樣品的微生物群落構成進行分析，其中主坐標分析（PCoA）是通過一系列特征值和特征向量排序，從多維數(shù)據(jù)中提取出最主要的元素和結構。PCoA結果顯示，各組幼鼠腸道菌群密度不同、區(qū)域分散，模型組與空白組距離較遠，3個干預組距離更接近空白組。方差分析＞1、＜0.05，提示組間差異有統(tǒng)計學意義。見圖3。

圖3 各組幼鼠腸道菌群PCoA

4.2 艾灸對模型幼鼠結腸黏膜病理形態(tài)的影響

空白組幼鼠結腸黏膜結構清晰，腺體完整，上皮細胞排列整齊。與空白組比較，模型組幼鼠結腸黏膜損傷嚴重，腺體消失，基層可見大量堆積的炎性細胞；與模型組比較，各干預組幼鼠結腸黏膜損傷減輕，腺體變長，可見少量炎性細胞浸潤；與艾灸組、陽性藥組比較，聯(lián)合組幼鼠結腸黏膜損傷較輕，炎性細胞浸潤較少。見圖4。

圖4 各組幼鼠結腸黏膜形態(tài)（HE染色，×200）

4.3 艾灸對模型幼鼠結腸組織Occludin、ZO-1 蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組幼鼠結腸組織Occludin、ZO-1蛋白表達顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組、艾灸組和聯(lián)合組結腸組織Occludin、ZO-1蛋白表達顯著升高（＜0.05，＜0.01）；與艾灸組及陽性藥組比較，聯(lián)合組幼鼠結腸組織Occludin、ZO-1蛋白表達顯著升高（＜0.01）。見圖5。

圖5 各組幼鼠結腸組織Occludin、ZO-1蛋白表達比較（，每組3只）

5 討論

近年來，抗生素普遍用于嬰幼兒的臨床治療，但抗生素尤其廣譜抗生素會損害腸道菌群結構及完整性，引起腸道菌群失調(diào)，導致腸內(nèi)病原菌大量釋放，損傷腸內(nèi)壁，引起炎癥，破壞結腸黏膜屏障，影響菌群定植并加重菌群紊亂。已有文獻報道，艾灸能調(diào)節(jié)腸道菌群結構，抑制炎癥因子釋放，上調(diào)Occludin、ZO-1蛋白表達。為深入探討艾灸對抗生素誘導的腸道菌群失調(diào)幼鼠結腸黏膜屏障的調(diào)節(jié)作用，本實驗開展了相關研究。

正常腸道微生物群主要由厚壁菌門和擬桿菌門組成，屬優(yōu)勢菌門，對維持腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關重要。變形桿菌是變形菌門的代表菌，是腸道的低豐度共生菌，屬條件致病菌。疣菌門在腸道中豐度不高，只包含Akkermansia muciniphila（AKK菌）1個成員，其與宿主代謝和免疫治療的全身效應具有很強相關性，能誘導小鼠免疫球蛋白G1抗體和抗原特異性T細胞反應，促進黏膜愈合，屬于功能性益生菌。腸道微生物群落結構分析表明，空白組幼鼠腸道優(yōu)勢菌群為擬桿菌門和厚壁菌門，變形菌門、疣菌門豐度較低，與文獻[15]一致。模型組幼鼠腸道變形菌門豐度增加，擬桿菌門和厚壁菌門豐度減少，疣菌門豐度無明顯變化。經(jīng)不同方法干預后，變形菌門豐度均顯著減少，擬桿菌門和厚壁菌門豐度增加，雖然與空白組有一定差異，但菌群結構趨于正常。在腸道菌群α多樣性方面，模型組幼鼠腸道Chao1、ACE、Shannon降低，Simpson升高，說明腸道菌群組成和結構發(fā)生改變，腸道菌群平衡被打破。陽性藥組、艾灸組和聯(lián)合組幼鼠腸道Shannon升高、Simpson降低，提示腸道菌群多樣性升高，平衡逐漸恢復。

脂多糖是先天免疫系統(tǒng)有效的激動劑，能誘導強烈的促炎反應，刺激宿主細胞分泌促炎因子。經(jīng)脂多糖誘導后，模型組幼鼠結腸黏膜損傷程度較嚴重，說明菌群紊亂影響結腸黏膜完整性，使其抵御炎性損傷的能力下降；與模型組比較，各干預組幼鼠結腸黏膜損傷有不同程度減輕，提示相對穩(wěn)定的腸道菌群能在一定程度上抵御炎性損傷，保護結腸黏膜。與艾灸組、陽性藥組比較，聯(lián)合組幼鼠結腸黏膜損傷最輕，結構較為完整，無明顯炎性細胞浸潤，提示艾灸與陽性藥聯(lián)合使用能發(fā)揮協(xié)同保護作用。研究表明，艾灸可增加潰瘍性結腸炎大鼠結腸黏膜緊密連接蛋白Occludin和ZO-1 表達，恢復結腸黏膜屏障功能，保護腸黏膜。另有報道，菌群豐度增加亦能提高相關蛋白表達。本實驗中模型組幼鼠結腸組織Occludin和ZO-1蛋白表達降低，不同方法干預后，Occludin和ZO-1蛋白表達均升高，提示其保護結腸黏膜的機制與緊密連接蛋白具有相關性。

綜上所述，艾灸“神闕”“中脘”“關元”“天樞”對抗生素誘導的菌群失調(diào)幼鼠結腸黏膜屏障有良好的保護作用，其機制可能與增加腸道菌群多樣性、恢復紊亂的腸道菌群水平及保護結腸黏膜屏障有關。本實驗可為臨床預防幼兒菌群紊亂及腸道炎癥疾病提供思路，為臨床合理應用抗生素及防治結腸黏膜屏障損傷相關胃腸道疾病提供實驗依據(jù)。