HS-SPME-GC-MS/MS 聯(lián)用分析蓮蓉餡料的特征揮發(fā)性香氣成分

梁梓健，方嘉沁，吳錦源，杜方敏，符樹(shù)勇，高向陽(yáng)*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642）

（2.廣州酒家集團(tuán)利口福食品有限公司廣州市廣式焙烤食品加工工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心，廣東廣州 511442）

蓮蓉是傳統(tǒng)廣式點(diǎn)心餡料，多用于制作具有蓮蓉風(fēng)味特征的食品，尤其是廣式蓮蓉餡月餅，備受人們喜愛(ài)。蓮蓉餡料主要由干蓮子、蔗糖和食用油為原料，經(jīng)浸泡、蒸煮、磨漿、炒制、冷卻等多項(xiàng)工序制作而成[1]。在蓮蓉餡料的炒制過(guò)程中，高溫會(huì)促使蓮蓉餡料發(fā)生美拉德反應(yīng)、油脂逐級(jí)降解、風(fēng)味化合物前體降解等化學(xué)反應(yīng)，從而生成多種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，賦予蓮蓉餡料獨(dú)特的風(fēng)味特征[2]。蓮蓉餡料的特征香味來(lái)源于其揮發(fā)性風(fēng)味化合物，是評(píng)價(jià)蓮蓉餡料產(chǎn)品品質(zhì)的重要依據(jù)[3]。但目前對(duì)于蓮蓉餡料的揮發(fā)性風(fēng)味化合物及其呈香特征還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

固相微萃?。⊿PME）具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，常與氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)合應(yīng)用于傳統(tǒng)食品風(fēng)味化合物的研究中，王藤等[4]利用SPMEGC-MS 技術(shù)探究了不同腌制時(shí)間對(duì)傳統(tǒng)工藝制作的火腿中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)不同腌制時(shí)間的火腿揮發(fā)性物質(zhì)呈現(xiàn)出顯著性差異。Yao 等[5]采用SPME-GC-MS 技術(shù)分析了不同年份四川冬菜的揮發(fā)性物質(zhì)差異。Attchelouwa 等[6]結(jié)合SPME-GC-MS 技術(shù)和感官評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)研究了傳統(tǒng)高粱啤酒中與感官指標(biāo)相關(guān)的揮發(fā)性化合物。

本研究采用了5 種不同加工工藝的蓮蓉餡料，利用頂空固相微萃取氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HS-SPMEGC-MS/MS）結(jié)合相對(duì)氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）分析蓮蓉餡料的揮發(fā)性成分及其風(fēng)味貢獻(xiàn)程度；并利用多元化學(xué)計(jì)量方法對(duì)不同種類(lèi)蓮蓉餡料的揮發(fā)性化合物進(jìn)行差異性分析，尋找特征性呈香物質(zhì)，有助于了解蓮蓉餡料在生產(chǎn)過(guò)程中香氣形成的機(jī)制，旨在為蓮蓉餡料的風(fēng)味品質(zhì)控制與改善提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

5 種蓮蓉餡料：廣州酒家集團(tuán)利口福食品有限公司提供，編號(hào)分別為C1、C2、C3、C4、C5，其中C1 為純白蓮蓉，C2 為純紅蓮蓉，C3 為大師手作純白蓮蓉，C4 為綠色食品級(jí)純白蓮蓉，C5 為低糖純白蓮蓉；正己烷：色譜純，德國(guó)Meker 公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

7890B-7000D GC-MS/MS，Agilent 公司；MM400球磨儀，Retsch 公司；MS105DU 電子天平，METTLER TOLEDO 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 頂空固相微萃取

將樣品于液氮速凍后研磨，再稱取1 g 于頂空瓶中，使用萃取頭于70 ℃下對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行萃取收集20 min。

1.2.2 GC-MS/MS 條件

萃取結(jié)束后，萃取頭插入色譜儀進(jìn)樣口，解析時(shí)間為5 min，進(jìn)樣口溫度為250 ℃。

氣相條件：氣相色譜柱為DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣，柱流速為1 mL/min，柱箱升溫程序?yàn)?0 ℃保持5 min，然后以6 ℃/min 的速度上升至280 ℃，并持續(xù)5 min。

質(zhì)譜條件：傳輸線溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，四級(jí)桿溫度為150 ℃，電離電壓為70 eV，溶劑延遲5 min。

1.2.3 揮發(fā)性化合物定量定性

在MassHunter 軟件（Agilent）中獲得特征峰荷質(zhì)比、保留時(shí)間和峰面積等信息，對(duì)單個(gè)峰進(jìn)行過(guò)濾，只保留單組空值不多于50%或所有組中空值不多于50%的峰面積數(shù)據(jù)?；贛WGC 數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)檢測(cè)到的揮發(fā)性化合物進(jìn)行定性分析，以峰面積歸一法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

用R 軟件（版本）進(jìn)行PCA 分析；采用SIMCA-P14.1 進(jìn)行PLS-DA 建模；利用IBM SPSS 25、Excel軟件和Origin 2019b 64Bit進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 5 種蓮蓉餡料的揮發(fā)性物質(zhì)分析

基于HS-SPME-GC-MS/MS 的檢測(cè)結(jié)果（5 種蓮蓉餡料總離子流圖見(jiàn)圖1～圖5），利用MWGC 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)5種蓮蓉餡料的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析，結(jié)果如表1 所示，共檢測(cè)到了29 種揮發(fā)性物質(zhì)，包括2 種醇類(lèi)、7 種醛類(lèi)、6 種酯類(lèi)、4 種吡嗪類(lèi)、3 種烷烴類(lèi)、2 種呋喃類(lèi)、2 種酮類(lèi)、1 種萜類(lèi)、1 種噻吩類(lèi)、1 種其他類(lèi)?？傠x子流圖，并對(duì)各類(lèi)別揮發(fā)性成分進(jìn)行顯著性差異分析（p＜0.05），以不同類(lèi)別的揮發(fā)性成分為橫坐標(biāo)，相對(duì)百分比含量為縱坐標(biāo)繪制柱形圖，如圖6 所示。

表1 5 種蓮蓉餡料的揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)百分含量Table 1 Relative percentage of volatile components in 5 kinds of lotus seed paste fillings

續(xù)表1

結(jié)果顯示，5 種蓮蓉餡料的揮發(fā)性成分組成類(lèi)似，其中醛類(lèi)（18.38%～36.45%）、酯類(lèi)（9.97%～23.88%）和吡嗪類(lèi)（19.07%～29.38%）的化合物含量較多，是主要的揮發(fā)性物質(zhì)。醛類(lèi)化合物多來(lái)源于脂質(zhì)的自動(dòng)氧化、β-氧化和氨基酸的降解[7]。由于蓮蓉餡料的制備加入了大量的花生油，在加工過(guò)程中油脂發(fā)生氧化反應(yīng)降解生成醛類(lèi)物質(zhì)。蓮蓉餡料中檢測(cè)到的醛類(lèi)化合物有己醛、糠醛、(Z)-2-庚烯醛、苯甲醛、正壬醛、E,E-2,4-癸二烯醛和3-甲基苯甲醛，其中糠醛只有在C2 中檢測(cè)到。酯類(lèi)物質(zhì)是由醇類(lèi)化合物和游離脂肪酸反應(yīng)而成，大多酯類(lèi)化合物的呈味閾值較高，由長(zhǎng)鏈脂肪酸生成的酯類(lèi)化合物主要呈現(xiàn)為油脂的香味，而短鏈脂肪酸生成的酯類(lèi)化合物則呈現(xiàn)花、果香味的氣味特征[8]。被檢測(cè)到的酯類(lèi)物質(zhì)有苯甲酸甲酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、環(huán)丁烷羧酸3-甲基丁酯和乙酸(二乙氧基)甲酯。吡嗪類(lèi)和呋喃類(lèi)化合物都是雜環(huán)類(lèi)化合物，其有著較低的呈味閾值，是食品中常見(jiàn)的風(fēng)味化合物，主要來(lái)源于食品加工過(guò)程中糖和氨基酸的美拉德反應(yīng)，以及硫胺素和氨基酸的自身的降解，多數(shù)具有典型的烘烤香味[9,10]。被檢測(cè)到的吡嗪類(lèi)化合物有2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪、2,3,5,-三甲基吡嗪和3-乙基2,5-二甲基吡嗪。由此可知，蓮蓉餡料的呈香物質(zhì)主要來(lái)源于生產(chǎn)工藝中的脂肪氧化、美拉德反應(yīng)和風(fēng)味前體物質(zhì)降解等化學(xué)反應(yīng)，構(gòu)成了蓮蓉餡料的特征風(fēng)味。

2.2 揮發(fā)性成分主成分分析

PCA 能對(duì)多維度的復(fù)雜數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，以少數(shù)變量的數(shù)據(jù)表達(dá)出原始數(shù)據(jù)的大部分信息[11]。對(duì)5種蓮蓉餡料揮發(fā)性成分的峰強(qiáng)進(jìn)行PCA 分析，其二維空間分布圖如圖7。

PCA 分析中提取了2 個(gè)主成分，其方差貢獻(xiàn)率分別為44.83%和21.12%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)65.95%，說(shuō)明原始數(shù)據(jù)的大部分信息能夠被這兩個(gè)主成分解釋?zhuān)煞从吵霾煌徣仞W料揮發(fā)性成分的組間與組內(nèi)關(guān)系。上述樣品的組內(nèi)距離接近，說(shuō)明同類(lèi)樣品的不同批次間的揮發(fā)性物質(zhì)組成類(lèi)似，產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定性高，試驗(yàn)重復(fù)性較好。總體上，5 種蓮蓉餡料在PCA 二維圖中能明顯區(qū)分，C1、C2、C4 和C5 在第一主成分中的距離較分散，表明這4 種蓮蓉餡料的差異主要體現(xiàn)在PC1 中，C3 與其他樣品差異主要體現(xiàn)在PC2 中。C2 和C3 有局部的重疊，說(shuō)明兩種蓮蓉餡料的揮發(fā)性成分存在一定的相似性。

2.3 5 種蓮蓉餡料揮發(fā)性成分差異分析

偏最小二乘判別分析（PLS-DA）能夠?qū) 矩陣信息分解成與Y 相關(guān)和不相關(guān)的兩類(lèi)信息，通過(guò)去除不相關(guān)的差異來(lái)篩選差異變量，找到不同蓮蓉餡料的揮發(fā)性差異代謝物[12]。利用SIMCA 軟件對(duì)不同蓮蓉餡料揮發(fā)性成分建立PLS-DA 模型進(jìn)行分析。模型中R2 表示模型的擬合程度，Q2 表示模型對(duì)新數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè)能力。一般來(lái)說(shuō)，R2 和Q2 越接近1 說(shuō)明模型越好。本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的PLS-DA 模型里，Q2 為0.97，R2X為0.97，R2Y 為0.98，模型穩(wěn)定且預(yù)測(cè)能力高。用置換檢驗(yàn)法評(píng)估模型的有效性，如圖3 所示。所建模型的Q2 始終大于隨機(jī)模型的Q2，且截距＜0，說(shuō)明模型沒(méi)有過(guò)擬合的情況，可以作為評(píng)價(jià)不同蓮蓉餡料揮發(fā)性物質(zhì)差異的模型。

如圖9 所示，PLS-DA 模型中的變量投影重要性值（VIP）可以表示為各揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)于5 種蓮蓉餡料的差異貢獻(xiàn)度，物質(zhì)VIP 值越大，對(duì)蓮蓉餡料的差異貢獻(xiàn)程度越大。選取VIP 值＞1 的揮發(fā)性物質(zhì)作為主要差異物質(zhì)（圖9 中紅色部分），分別為糠醛，E,E-2,4-癸二烯醛、(±)-3-蒈烯-2,5-二酮、乙酸(二乙氧基)甲酯、2-氯-2-硝基-丙烷、苯甲醛、正壬醛、2,6-二甲基吡嗪、3-甲基苯甲醛和十四烷，共10 種揮發(fā)性物質(zhì)。

對(duì)上述VIP＞1 的10 種物質(zhì)進(jìn)行單因素方差分析，保留具有顯著性差異（p＜0.01）的揮發(fā)性物質(zhì)，進(jìn)一步在不同種蓮蓉餡料樣品中篩選出8 種重要差異物質(zhì)，分別為：糠醛、E,E-2,4-癸二烯醛、(±)-3-蒈烯-2,5-二酮、苯甲醛、正壬醛、2,6-二甲基吡嗪、3-甲基苯甲醛和十四烷。如圖10 所示，利用聚類(lèi)熱圖對(duì)上述重要差異物質(zhì)進(jìn)行可視化分析，得出C1 蓮蓉餡料的標(biāo)志揮發(fā)性物質(zhì)為(±)-3-蒈烯-2,5-二酮，C2 為糠醛，C3 為E,E-2,4-癸二烯醛和苯甲醛、C4 為正壬醛、C5 為十四烷。

2.4 5 種蓮蓉餡料主要揮發(fā)性化合物香氣特征分析

揮發(fā)性化合物對(duì)風(fēng)味的影響由物質(zhì)含量與呈味閾值共同決定，相對(duì)氣味活度值（ROAV）能相對(duì)反映出風(fēng)味成分在產(chǎn)品中的風(fēng)味貢獻(xiàn)程度，一般認(rèn)為ROAV＞1 的風(fēng)味成分為關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)，而ROAV＞0.1的風(fēng)味成分為輔助修飾風(fēng)味物質(zhì)[11]。查閱文獻(xiàn)獲得蓮蓉餡料中各風(fēng)味化合物的呈味閾值，并計(jì)算出ROAV值[11]。定義E,E-2,4-癸二烯醛的相對(duì)氣味活度值為100，其余風(fēng)味物質(zhì)的ROVA 值如表2 所示。

表2 不同蓮蓉餡料主要揮發(fā)性風(fēng)味成分的相對(duì)風(fēng)味活度值Table 2 Relative odor activity value of main volatile flavor components in different lotus seed paste fillings

蓮蓉餡料中醛類(lèi)化合物的累積香氣值為100.24～100.96，酯類(lèi)為7.11～54.07、噻吩類(lèi)為0.22～4.59，其中關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)有E,E-2,4-癸二烯醛、辛酸乙酯和2-乙酰基噻吩，奠定了蓮蓉的主要風(fēng)味基調(diào)。而苯乙醇、己醛、正壬醛、乙酸苯乙酯則起到了輔助修飾蓮蓉餡料風(fēng)味的作用。據(jù)報(bào)道，E,E-2,4-癸二烯醛具有雞肉香味和油脂香味，是亞油酸降解的主要產(chǎn)物[26]。其在熱反應(yīng)體系中能降解生成醛類(lèi)化合物，如蓮蓉餡料中的己醛和苯甲醛，這些醛類(lèi)物質(zhì)可以繼續(xù)與蓮蓉餡料中美拉德中間產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，生成愉悅的呈香物質(zhì)；辛酸乙酯在C1 中的ROAV 值為53.71，明顯高于其他4 種蓮蓉餡料。其具有類(lèi)似菠蘿、蘋(píng)果和雪梨等氣味的呈味特征，常被報(bào)道存在于多種水果和酒類(lèi)中，是菠蘿、啤酒的主要風(fēng)味物質(zhì)之一[27]。也有報(bào)道稱辛酸乙酯能提升玫瑰精油的整體香氣[28]；2-乙?；绶允且环N具有核桃、硫磺氣味特征的含硫化合物，由核糖和半胱氨酸發(fā)生美拉德反應(yīng)產(chǎn)生。有報(bào)道它也是肉類(lèi)食品中風(fēng)味貢獻(xiàn)物質(zhì)之一[29]。

糠醛只有在C2 中被檢測(cè)出，是一種由美拉德反應(yīng)生成的風(fēng)味物質(zhì)，具有烤面包、焦香和辛香的氣味特征[30]?？赡苁怯捎贑2 蓮蓉餡料在制備過(guò)程中添加了焦糖，從而引入了戊糖發(fā)生美拉德反應(yīng)生成糠醛。據(jù)報(bào)道，蓮蓉餡料中的正辛醇、苯乙醇、己醛、糠醛、苯甲醛、正壬醛、E,E-2,4-癸二烯醛、2-乙基-5-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、3-乙基2,5-二甲基吡嗪和2-庚酮在花生油中被檢測(cè)出，這些化合物共同賦予了蓮蓉餡料類(lèi)似于花生油的香氣特征[31,32]。而正辛醇、苯乙醇、己醛、苯甲醛和十四烷則在蓮子芯中檢測(cè)到[33]。

由于5 種蓮蓉餡料中的揮發(fā)性物質(zhì)有著不一樣的呈味貢獻(xiàn)，導(dǎo)致每一種蓮蓉都有著獨(dú)特的香氣特征?；谏徣仞W料的呈香物質(zhì)（ROVA＞0.01）和重要差異物質(zhì)，兩者的共有部分可被認(rèn)為是影響蓮蓉餡料呈香特性的關(guān)鍵物質(zhì)（圖11），分別是E,E-2,4-癸二烯醛、正壬醛和苯甲醛?？梢?jiàn)，影響蓮蓉餡料風(fēng)味的主要風(fēng)味物質(zhì)是醛類(lèi)化合物。

3 結(jié)論

研究采用HS-SPME-GC-MS/MS技術(shù)比較分析了5種常見(jiàn)蓮蓉餡料產(chǎn)品的揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)其揮發(fā)性物質(zhì)的種類(lèi)相似，主要差異物質(zhì)是糠醛，E,E-2,4-癸二烯醛、(±)-3-蒈烯-2,5-二酮、苯甲醛、正壬醛、2,6-二甲基吡嗪、3-甲基苯甲醛和十四烷。由蓮蓉餡料揮發(fā)性成分的ROVA值可知，其關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)有E,E-2,4-癸二烯醛、辛酸乙酯和2-乙?；绶?，而苯乙醇、己醛、正壬醛、乙酸苯乙酯則起到了輔助修飾蓮蓉餡料呈味的作用。通過(guò)繪制主要差異物質(zhì)與呈味物質(zhì)的韋恩圖，發(fā)現(xiàn)E,E-2,4-癸二烯醛、正壬醛和苯甲醛的相對(duì)含量差異是影響蓮蓉餡料呈香差異的主要原因。本研究從揮發(fā)性物質(zhì)的角度，分析了不同蓮蓉餡料香氣差異的來(lái)源，為蓮蓉餡料的風(fēng)味特征研究和品質(zhì)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)建立提供參考數(shù)據(jù)。