草菇對牛肉蛋白結(jié)構(gòu)的修飾效應(yīng)

沈雙偉，青正龍，林偉玲，張賢斌，劉學(xué)銘，林耀盛，唐道邦，王旭蘋，程鏡蓉*，朱明軍

（1.喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆喀什 844000）

（2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510610）

（3.葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆喀什 844000）

（4.中山市黃圃鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，廣東中山528429）

（5.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510006）

肉糜是肉制品加工中最為常見的原料之一，主要由蛋白質(zhì)、脂肪顆粒、碳水化合物、水和鹽組成[1]。肉糜加工方便，是生產(chǎn)香腸、肉餅、肉脯、肉丸等肉制品的重要原料。肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）作為肌肉中含量最高的蛋白質(zhì)，約占肉蛋白總含量的55%～60%，是肉制品加工過程中較為重要的一類結(jié)構(gòu)蛋白。其結(jié)構(gòu)和功能特性會直接影響到肉制品的感官性質(zhì)。此外，MP 具有優(yōu)良的凝膠特性，在維持肉制品較好的質(zhì)構(gòu)特性和感官品質(zhì)中發(fā)揮重要作用[2]。然而，肉制品在加工貯藏的過程中會不可避免的發(fā)生蛋白質(zhì)氧化。其中，MP的氧化程度直接影響著肉制品的質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味及加工特性[3]。研究表明，MP 的過度氧化會造成肉及肉制品品質(zhì)的下降，如：保水性降低、蒸煮損失增大、凝膠性能下降、蛋白質(zhì)的消化率降低等[4-6]；然而，適度氧化卻有助于促進(jìn)蛋白質(zhì)相互交聯(lián)，提高風(fēng)味物質(zhì)吸附或釋放能力，改善產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味。Shen等[7]提出適度的氧化可以誘導(dǎo)MP 部分解折疊，進(jìn)一步提高M(jìn)P 的鹽溶性和凝膠硬度，促進(jìn)MP 凝膠與某些醛和酮類等風(fēng)味物質(zhì)的結(jié)合。伏慧慧等[8]發(fā)現(xiàn)某些肉制品中的蛋白適度氧化對其質(zhì)構(gòu)、滋味、風(fēng)味及色澤會產(chǎn)生積極的促進(jìn)作用。

食用菌，因其味道鮮美且富含纖維，對肉制品風(fēng)味及質(zhì)構(gòu)等品質(zhì)的影響備受關(guān)注。草菇作為一種重要的熱帶亞熱帶菇類，是世界上第三大栽培食用菌。其營養(yǎng)豐富，味道鮮美，作為風(fēng)味補(bǔ)充劑近年來在肉制品（如草菇臘腸、草菇肉醬等）中被廣泛應(yīng)用。近期有研究表明[9]，食用菌對肉制品風(fēng)味的影響并不是二者風(fēng)味的簡單疊加，其與肉制品組分（如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)）的相互作用很有可能是促成風(fēng)味物質(zhì)合成的重要途徑。當(dāng)前，人們主要關(guān)注食用菌對肉制品風(fēng)味的影響，但對相關(guān)機(jī)理的探究較少。本課題組在前期探索中發(fā)現(xiàn)[10]，草菇對肉糜組分的相互作用可能是影響肉糜質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味的重要因素。鑒于此，本研究以牛肉糜蛋白為對象，進(jìn)一步探索草菇對牛肉糜蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能的影響，以期為食用菌改善肉糜品質(zhì)的機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

草菇為光柄菇科真菌草菇（Volvariella volvacea(Bull.:Fr.) Sing.）的子實(shí)體，牛肉（水牛，Bubalus bubalis）為牛外脊肌肉，草菇和牛肉均購自廣州市澳之星超市；超純水，美國Milli-Q 純水儀；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5X），上海碧云天生物公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PB-10 數(shù)字pH 計，德國Sartorius 集團(tuán)；UltraScan VIS 色度儀，美國Hunter Lab 公司；SKD-100 自動凱氏定氮儀，上海沛歐分析儀器有限公司；Jasco J-1500-150CD 光譜儀，日本東京 Jasco 公司；AR1500EX TA 流變儀，美國NewCastle 公司；T25D均質(zhì)機(jī)，德國IKA 集團(tuán)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

1.3.1.1 草菇粉末的制備

草菇使用蒸餾水沖洗兩次，去除菌體上肉眼可見的異物，使用熱風(fēng)干燥箱45 ℃干燥至恒重。干燥的食用菌使用BJ-300 高速破碎器磨成粉末，為防止破碎器過熱對食用菌造成影響，每破碎10 s 后暫停機(jī)器，待機(jī)器溫度降至室溫后再次破碎。破碎后的草菇過20目的聚乙烯篩，隨后使用密封袋密封，保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 草菇牛肉糜的制備

牛外脊肉使用配備有6 mm 直徑孔板的絞肉機(jī)絞碎成肉糜。樣品分為2 個組：不添加食用菌干粉的肉糜（Control）；添加5%（m/m）草菇干粉的肉糜（5%Vv）。樣品組分如下：牛肉糜1000 g，牛板油100 g，水50 g，鹽20 g，復(fù)合磷酸鹽4 g，食用菌干粉50 g。將牛肉糜和其它配料放入攪拌機(jī)中攪拌（30 min）后，于4 ℃靜置腌制，在0、12、24、36 和48 h 五個時間點(diǎn)分別取樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 草菇對牛肉糜理化性質(zhì)的影響

pH 值：參照國標(biāo)GB 5009.237-2016[11]對肉糜的pH 值進(jìn)行測定。取1 g 樣品與9 mL 0.1 mol/L 的KCl溶液混合，10000 r/min 均質(zhì)1 min 后使用pH 計進(jìn)行測定，每個樣品測試三次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

蒸煮損失：使用模具將樣品（m1）制成厚1 cm，直徑為5 cm 的肉餅，75 ℃水浴25 min，用流水將樣品冷卻至室溫后在4 ℃放置過夜。去除模具，使用吸水紙去除樣品表面水分，然后記錄樣品質(zhì)量（m2）。每個樣品測試三次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。計算公式如下：

色度：使用模具將樣品制成厚度為1 cm，直徑為5 cm 肉餅，80 ℃水浴20 min 后，自然冷卻至室溫。使用Ultrascan-VIS 色度計對樣品色度進(jìn)行定量，以確定樣品的亮度（L*）、紅色（a*）和黃色（b*）值，標(biāo)準(zhǔn)白板讀數(shù)為（L*=99.44，a*=-0.09，b*=0.35）。從每個實(shí)驗(yàn)組中抽取三個樣品進(jìn)行評估。結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

揮發(fā)性鹽基氮（Volatile basic nitrogen，TVB-N）：按照國標(biāo)GB 5009.228-2016[12]中自動凱氏定氮儀法測定。每個樣品測試三次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

1.3.3 肉糜總蛋白水溶性測定

根據(jù)Vissessanguan 等[13]的方法略作修改，測定樣品總蛋白水溶性。溶劑有：S1：0.6 mol/L KCl；S2：20 mmol/L Tris，pH=8；S3：20 mmol/L Tris，pH=8，含有1%（m/V）SDS；S4：20 mmol/L Tris，pH=8，含有1%（m/V）SDS 和8 mol/L 尿素；S5：20 mmol/L Tris，pH=8，含有1%（m/V）SDS，8 mol/L 尿素和2%（V/V）β-巰基乙醇；S6：0.5 mol/L NaOH。取2 g樣品與18 mL 上述溶液混合，室溫下10000 r/min 均質(zhì)1 min 后4 ℃靜置2 h。均質(zhì)后的樣品勻漿在10000 r/min 下離心15 min，上清液使用中速濾紙過濾，保留濾液。取4 mL 濾液，加入1 mL 預(yù)冷的50% TCA，4 ℃靜置2 h 后4000 r/min 離心15 min，保留沉淀。沉淀使用S6 溶解結(jié)果，以各部分蛋白含量占S6 的百分比表示。

如無特別說明，本實(shí)驗(yàn)中的蛋白含量均采用雙縮脲法[14]測定。

1.3.4 肌原纖維蛋白的提取

牛肉肌原纖維蛋白（MP）的提取依據(jù)Park 等[15]的方法略作修改。牛外脊肉剔除可見的脂肪和結(jié)締組織后，使用攪碎機(jī)將其破碎成肉糜。稱取25 g 肉糜加入100 mL 的僵直液（0.1 mol/L NaCl，23.1 mmol/L Na3PO4，4.3 mmol/L MgCl2，1.1 mmol/L EDTA-2Na；pH=7），10000 r/min 均質(zhì)1 min 后4000 r/min 離心5 min，保留沉淀。再次加入100 mL 僵直液，重復(fù)上述步驟三次，最后保留沉淀。沉淀中加入100 mL 0.1 mol/L 的NaCl 溶液，使用上述條件均質(zhì)并離心，重復(fù)操作3～5 次，每次保留上清液。所得上清液經(jīng)兩層紗布過濾，收集所有濾液，調(diào)整濾液pH 至6.25 左右，靜置10 min（以出現(xiàn)絮狀沉淀為準(zhǔn)），4000 r/min 離心5 min，收集膏狀殘留物，所得膏狀沉淀視為純化后的MP，加入0.6 mol/L PBS（含0.6 mol/L NaCl，pH=7）溶液5～10 mL 溶解沉淀。所得MP 置于100 mL 離心杯中均質(zhì)，混勻后保存于碎冰中備用，并于48 h 內(nèi)使用。

1.3.5 MP 羰基含量的測定

羰基含量的測定基于2,4-二硝基苯肼（DNPH）法[16]并略作修改。2 g 樣品加入18 mL 生理鹽水后10000 r/min 均質(zhì)兩次（30 s/次）。取2 份樣品均質(zhì)溶液（0.1 mL），一份加入0.5 mL 2 mol/L 的HCl（組A），另一份加入0.5 mL 2 mol/L 的HCl（含有0.02 mol/L的DNPH）（組B），然后37 ℃水浴15 min，加入0.5 mL 20%的三氯乙酸溶液，旋渦振蕩混勻，然后10000 r/min離心5 min，棄掉上清，沉淀使用1 mL 乙醇和乙酸乙酯混合物（V/V=1:1）清洗3 次后再次10000 r/min 離心5 min，最后所得沉淀用1 mL 6 mol/L 的鹽酸胍溶液溶解（37 ℃，水浴15 min），使用去離子水稀釋5倍，在370 nm 測OD 值。計算公式如下：

式中：

A370=A組A-A組B；

Cpro——蛋白濃度；

摩爾消光系數(shù)——21000 L/(mol·cm)。

1.3.6 MP 巰基含量測定

樣品巰基含量的測定依照Ellman 的方法[17]并略作修改。0.5 mL 樣品均質(zhì)液加入2.5 mL Tris-Gly-尿素（pH=8.0），充分振蕩混勻，實(shí)驗(yàn)組加入20 μL Ellman試劑，對照組中加20 μL Tris-Gly 溶液，37 ℃水浴15 min，10000 r/min 離心5 min，使用分光光度計測定上清液在412 nm 處吸光值。摩爾消光系數(shù)13.6×103L/(mol·cm)，計算公式如下：

式中：

73.53=106/13.6×103；

A412=A實(shí)驗(yàn)組-A對照組；

Cpro——蛋白濃度。

1.3.7 MP 二級結(jié)構(gòu)測定

采用圓二色譜評價食用菌對牛肉糜MP 二級結(jié)構(gòu)的影響。用蒸餾水將MP 稀釋至0.1 mg/mL，取200 μL稀釋后的蛋白溶液加入石英比色皿（1 mm）中。使用J-1500-150 CD 色譜儀在24 ℃（±1 ℃）下掃描。掃描波長：190～260 nm，掃描速度為5 nm/min。每個樣品掃描三次，結(jié)果為三次掃描的平均值并扣除相應(yīng)溶劑背景。在獲得CD 譜后，利用二級結(jié)構(gòu)分析軟件CNDD（CD 譜反褶積 2.1；http://bioinformatik.biochemtech.uni-halle.de/cdnn/）對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所用的參考蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白SP175（平均氨基殘基為110 g/mol）[18]，波長計算范圍為200～250 nm。每個樣品測定三次重復(fù)，計算結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

1.3.8 十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析

食用菌對牛肉糜MP 的影響采用SDS-PAGE 進(jìn)行分析[19]。濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為12%。將MP 稀釋為濃度5 mg/mL 的蛋白溶液，取0.4 mL 上述濃度蛋白溶液加入0.1 mL 上樣緩沖液，漩渦混勻后，沸水浴5 min，取出于冰水浴中降溫至室溫后進(jìn)行上樣，上樣量為10 μL。采用恒壓模式，第一階段電壓為40 V，第二階段電壓為80 V，待藍(lán)色指示帶位移動至凝膠底部，停止電泳。凝膠使用考馬斯亮藍(lán)G250染色，隨后用脫色液褪色并拍照。

1.3.9 MP 流變特征

根據(jù)Wu 等[20]描述的方法略加修改，對添加草菇后牛肉糜的MP 流變特性進(jìn)行測試。將MP 稀釋為15 mg/mL，取2 mL 稀釋后的MP 溶液裝載于流變儀平臺上進(jìn)行測試。模式：振蕩加熱模式；加熱速率：2 ℃/min；溫度范圍：25 ℃～75 ℃。利用儲能模量（G'）和Tanδ（G''（損耗模量）/G'）表征MP 溶液在凝膠轉(zhuǎn)變過程中的粘彈性變化。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 組平行，數(shù)據(jù)結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件程序做出分析。使用Anova 和Duncan 的多重范圍檢驗(yàn)來進(jìn)行顯著性差異分析，其中p＜0.05 才認(rèn)定有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 草菇對牛肉糜理化性質(zhì)的影響

腌制前后樣品的TVB-N 值、蒸煮損失、pH 值和色度詳見表1。TVB-N 通常指在食品生產(chǎn)和貯藏過程中，由于酶或微生物的作用，蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的堿性含氮物質(zhì)[21]。其中添加草菇后肉糜的TVB-N 值為13.15～16.74 mg/100 g（0～48 h），明顯高于對照組的4.24～7.55 mg/100 g 樣品（0～48 h）。在內(nèi)源性酶或微生物的作用下，肉制品的TVB-N 值隨著時間的延長而增加。草菇處理后，牛肉糜的TVB-N 值迅速增加，甚至超過了草菇本身的TVB-N 值（3.47 mg/100 g 樣品）和對照組的TVB-N 值之和。這可能是因?yàn)椴莨街胸S富的蛋白酶[22]導(dǎo)致了牛肉糜中的蛋白質(zhì)降解，從而產(chǎn)生了額外的堿性含氮物質(zhì)所致。

表1 草菇對牛肉糜理化性質(zhì)的影響Table 1 The effect of Volvariella volvacea on the physichemcial of beef paste

添加草菇后牛肉糜的蒸煮損失率（0 和48 h 分別為4.86%和3.44%）顯著低于對照組（0 和48 h 分別為21.5%和15.42%）。這可能是因?yàn)槭秤镁胸S富的膳食纖維有助于肉糜水分的保持[23]。與此同時，草菇的處理使牛肉糜的pH 值增加，造成肉糜蛋白間的負(fù)電荷增加，蛋白質(zhì)之間的排斥力增加從而提高肉糜的保水能力[24]。

隨著腌制時間的延長，實(shí)驗(yàn)組和對照組的pH 值均有所升高。實(shí)驗(yàn)組的pH 值（0 和48 h 分別為5.85和6.15）顯著高于對照組（0和48 h分別為5.7和5.94），這與之前的研究相一致。Choe 等[25]在乳化香腸中加入金針菇（Flammulina velutipes）后產(chǎn)品的pH 值由6.08提高至6.33，差異顯著。Bao 等人[26]也發(fā)現(xiàn)在牛肉和魚肉中添加食用菌提取液，產(chǎn)品的pH 值得到提高。一方面，該現(xiàn)象可能源于草菇中含有較豐富的堿性物質(zhì)，如精氨酸。另一方面，草菇內(nèi)源酶會促使牛肉草糜蛋白降解，產(chǎn)生的堿性含氮物質(zhì)導(dǎo)致pH 值升高。

草菇處理同樣會導(dǎo)致牛肉糜色度發(fā)生變化。與對照組相比，添加5% Vv 組的肉糜紅度（a*值）下降，黃度（b*值）增加。這可能是草菇粉自身色澤所致，而草菇處理48 h 后肉糜的亮度（L*值）和a*值下降，b*值上升，且較對照組（48 h）有顯著差異（p＜0.05）。這說明草菇中的多酚氧化酶促進(jìn)了牛肉糜的氧化，影響了牛肉糜的顏色[27]。此外，Millard 反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致肉糜的非酶褐變[28]，也可能是造成b*值升高和L*值、a*值的降低的重要成因。

2.2 草菇對牛肉糜總蛋白水溶性的影響

肉糜樣品隨草菇處理時間的延長在不同溶液中的溶解度如圖2 所示。S1 是0.5 mol/L 的KCl 溶液，蛋白在鹽溶液中的溶解度常常隨蛋白結(jié)構(gòu)的改變而變化。添加草菇后，牛肉糜蛋白溶解度隨腌制時間的延長而降低，超過36 h 后出現(xiàn)增長。這表明草菇的加入改變了肉糜蛋白的結(jié)構(gòu)和溶解度。S2 是20 mmol/L 的Tris 溶液，S3 在S2 的基礎(chǔ)上添加了1%的SDS，SDS作為一種陰離子表面活性劑，能夠破壞蛋白間的氫鍵并削弱疏水作用力[29]。所有樣品在S3 溶液中的溶解度明顯高于S2，這是因?yàn)槿饷拥鞍字械臍滏I被破壞，疏水作用力被削弱，因此牛肉糜蛋白的溶解度增加。其中，添加草菇后牛肉糜蛋白在S3 中的溶解度顯著低于對照組。這可能是因?yàn)椴莨皆鰪?qiáng)了牛肉糜蛋白質(zhì)之間的氫鍵和疏水作用力，使其溶解度相對較低。S4在S3 溶液的基礎(chǔ)上增加了8 mol/L 的尿素，高濃度的尿素可以進(jìn)一步破壞蛋白間的氫鍵和疏水性，使蛋白質(zhì)的溶解度提高[13]。從圖2 中可以看出，對照組在S3和S4 中的溶解度差異相對較小，這表明對照組中的氫鍵或疏水作用力大部分已經(jīng)被SDS 破壞，因此尿素對對照組中牛肉糜的蛋白溶解度影響相對較小。然而，實(shí)驗(yàn)組在S4 中的溶解度顯著高于S3，并且實(shí)驗(yàn)組在S4 中的溶解度與對照組在S4 中溶解度差異不大，這是因?yàn)楦邼舛鹊哪蛩厥沟鞍组g氫鍵或疏水作用力被徹底破壞，使實(shí)驗(yàn)組和對照組的溶解度位于同一水平。上述研究結(jié)果進(jìn)一步表明草菇與蛋白的相互作用會強(qiáng)化蛋白質(zhì)分子間的氫鍵和疏水作用力。

在S4 的基礎(chǔ)上，S5 中加入了具有強(qiáng)還原性的β-巰基乙醇，這使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水作用力被破壞，同時分子內(nèi)及分子間的二硫鍵也被削弱[13]。與S4 相比，樣品在S5 中的溶解度顯著增加，這是蛋白質(zhì)中二硫鍵的斷裂、蛋白結(jié)構(gòu)展開導(dǎo)致的[30]。值得注意的是，添加草菇后，牛肉糜蛋白在S5 中的溶解度在36 h前顯著低于對照組，這可能是因?yàn)椴莨降奶砑邮沟鞍追肿觾?nèi)形成更多的二硫鍵，造成蛋白的聚集和溶解度的下降。

2.3 草菇對MP 氨基酸側(cè)鏈的影響

蛋白質(zhì)中羰基的含量常被用于表示蛋白質(zhì)氧化程度[30]，羰基形成的方式有：肽鍵的斷裂、外源性羰基的引入、氨基酸側(cè)鏈的氧化等[31]。如圖3a 所示，在腌制初期（0～12 h）對照組的羰基含量與實(shí)驗(yàn)組之間沒有顯著變化。12 h 后實(shí)驗(yàn)組MP 的羰基含量開始快速上升，并顯著高于對照組，表明草菇促進(jìn)了肉糜蛋白的氧化。一方面，這可能是因?yàn)椴莨街胸S富的蛋白酶使MP 更多活性基團(tuán)暴露，造成羰基化程度提高。另一方面，草菇成熟過程中體內(nèi)會自發(fā)表達(dá)產(chǎn)生丙二醛（MDA）等氧化物[22]，機(jī)械損傷會促使草菇NADPH氧化酶表達(dá)[32]，造成MP 的氨基酸側(cè)鏈被修飾，從而導(dǎo)致羰基含量的增加。

MP 多肽鏈中巰基具有還原性，很容易被活性氧（ROS）等氧化物攻擊而轉(zhuǎn)變?yōu)槎蜴I等。因此，蛋白質(zhì)中巰基含量的變化被廣泛用于衡量蛋白質(zhì)的氧化程度[30]。如圖3b 所示，樣品中的巰基含量隨腌制時間延長而下降，這說明蛋白質(zhì)氧化的發(fā)生[33]。添加草菇后牛肉糜MP 的巰基含量在整個腌制周期都顯著低于對照組。這表明草菇使肉糜MP 的氧化程度升高。Alnoumani 等[34]在研究雙胞菇對牛肉糜的影響中發(fā)現(xiàn)，4%雙胞菇粉未使牛肉糜中巰基顯著下降，這主要是因?yàn)槭秤镁稍镞^程中使促氧化物濃度升高，促進(jìn)了肉糜的氧化。

2.4 草菇對肉糜MP 二級結(jié)構(gòu)的影響

使用CD 色譜對MP 的二級結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行分析。如圖4 所示，樣品的MP 在208 nm 和222 nm 處有兩個負(fù)峰，這與蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)肽鍵的N-π*轉(zhuǎn)移有關(guān)[35]。對照組和實(shí)驗(yàn)組隨著腌制時間的延長，都表現(xiàn)出了α-螺旋含量下降，而β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲均出現(xiàn)不同程度的增加。與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組的α-螺旋含量下降更為明顯。值得注意的是，實(shí)驗(yàn)組在0 h時α-螺旋甚至低于草菇處理48 h 后MP 的α-螺旋，而β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲均高于對照組，這表明草菇促進(jìn)了肉糜蛋白的氧化。因此，實(shí)驗(yàn)組α-螺旋含量的降低可能是由于草菇中存在的氧化物攻擊MP 多肽鏈的氨基酸殘基并破壞其氫鍵造成α-螺旋解旋所致[36]，使得α-螺旋向β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變[37]。

2.5 草菇對MP 凝膠電泳（SDS-PAGE）的影響

不同腌制時間下樣品蛋白的變化采用SDS-PAGE進(jìn)行分析。MP 作為一種復(fù)合蛋白，主要由肌球蛋白重鏈（MHC）和肌動蛋白（Actin）等組成[38]。如圖5所示，空白組各泳道條帶間隨著腌制時間的延長未見明顯變化，而草菇處理后隨著腌制時間的延長，蛋白樣品在8～10 泳道（24～48 h）點(diǎn)樣孔中有大分子聚合物出現(xiàn)。這可能隨著腌制時間的延長，氧化程度逐漸加深，誘發(fā)蛋白分子聚集導(dǎo)致的。相較于空白組，實(shí)驗(yàn)組175～270 ku 間的MHC 和95～130 ku 間的α-Actin隨著腌制時間的延長更加暗淡模糊，可能是由于草菇中豐富的蛋白酶誘發(fā)蛋白質(zhì)水解導(dǎo)致的。這也可以從實(shí)驗(yàn)組16 ku 附近出現(xiàn)的條帶得以證實(shí)。綜上，草菇會誘發(fā)牛肉糜MP 的酶解與氧化聚集。

2.6 草菇對MP 流變性能的影響

儲能模量（G'）是指材料在發(fā)生形變時，由于彈性形變而引起儲存能量的大小變化，反映材料彈性大小[20]。G'的值在40 ℃左右時開始增加，并隨著溫度的升高而穩(wěn)定上升（圖6）。這主要是由于MP（尤其是肌球蛋白）結(jié)構(gòu)的變化和蛋白間相互作用造成的[39]。當(dāng)溫度上升至75 ℃時，G'值從大到小依次為5%Vv 組（48 h）、對照組（48 h）、對照組（0 h）和5% Vv組（0 h）。腌制初期，添加草菇后肉糜MP 的G'值低于對照組，這可能是草菇中豐富的蛋白酶使肉糜MP部分酶解，對熱凝膠結(jié)構(gòu)造成了破壞。然而，隨著腌制時間延長，處理48 h 后實(shí)驗(yàn)組的G'值高于對照組，這是因?yàn)槿饷拥鞍椎难趸潭仍黾?，形成了蛋白交?lián)增多所致。Kang 等[40]的研究表明，適當(dāng)?shù)难趸沟鞍组g二硫鍵增多，β-折疊上升，導(dǎo)致蛋白相互交聯(lián)，從而提高了蛋白凝膠的穩(wěn)定性。張海璐等[41]通過氧化體系對羊肉凝膠進(jìn)行處理后，同樣發(fā)現(xiàn)肉凝膠彈性有所提升。

Tanδ（G''/G'）是耗能模量（G''）與儲能模量（G'）的比值，代表著蛋白質(zhì)凝膠形成過程中“粘度”與“彈性”的相對分布，即Tanδ值越大，材料的粘度越大或彈性越小[42]。樣品的Tanδ值從升溫伊始便開始降低，這表明隨著溫度的升高，樣品MP 溶液黏度開始增加。根據(jù)Samejima 等[43]的論述，當(dāng)溫度大于30 ℃時肌球蛋白的結(jié)構(gòu)“體積”增加，從而產(chǎn)生了更粘稠的溶膠，因此Tanδ值呈現(xiàn)降低的趨勢。隨著溫度繼續(xù)升高，MP 形成凝膠所需的溫度（即Tanδ=1 時的溫度）從低到高的順序依次為5% Vv 組（0 h）、5% Vv 組（48 h）、對照組（0 h）和對照組（48 h）。該現(xiàn)象表明草菇處理的肉糜MP 形成凝膠所需溫度相較空白組更低，說明草菇處理后的MP 更易形成凝膠。這可能是因?yàn)椴莨降募尤?，草菇處理后MP 分子內(nèi)的二硫鍵，從而使MP 溶液形成凝膠所需能量更低[44]。

3 結(jié)論

本研究探討了草菇對牛肉糜蛋白結(jié)構(gòu)及功能特性的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)草菇可有效降低肉糜的蒸煮損失率，其中富含的蛋白酶和精氨酸等物質(zhì)會促使牛肉糜的pH 值、色度、TBV-N 值等理化性質(zhì)發(fā)生改變。草菇與肉糜蛋白的相互作用會促進(jìn)蛋白質(zhì)的氧化和降解，造成蛋白質(zhì)巰基向二硫鍵的轉(zhuǎn)化及α-螺旋結(jié)構(gòu)的解旋，提高蛋白質(zhì)的凝膠性能。此研究從蛋白質(zhì)氧化水解層面為解析草菇對牛肉質(zhì)構(gòu)及風(fēng)味的影響提供了一定的理論基礎(chǔ)，由于脂質(zhì)氧化同樣是肉制品風(fēng)味形成的重要因素，草菇內(nèi)源物對肉糜脂質(zhì)氧化的調(diào)節(jié)作用及風(fēng)味物質(zhì)的形成規(guī)律還有待進(jìn)一步研究。