甘蔗原汁后混濁及其蛋白質(zhì)組成特征

王琦，蒙麗丹，田潤，王淑培，謝彩鋒,3，杭方學(xué),3，李凱,3*

（1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧 530004）

（2.南寧師范大學(xué)環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院，廣西南寧 530001）

（3.糖業(yè)及綜合利用教育部工程研究中心，廣西制糖協(xié)會，廣西南寧 530004）

甘蔗是許多國家重要的農(nóng)業(yè)作物之一，目前主要用于蔗糖、燃料酒精生產(chǎn)[1,2]。事實上，甘蔗除了含有蔗糖與還原糖，還含有豐富的多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、必需微量元素、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)以及有機酸、多酚等活性物質(zhì)，且口感清甜爽口，深受消費者喜愛，應(yīng)用于飲料行業(yè)具有巨大的市場潛力。目前市場上甘蔗基飲料種類繁多，主要為甘蔗原汁、甘蔗原汁復(fù)配飲料及甘蔗濃縮汁加工的飲料等[3]。

然而，甘蔗基飲料在貯藏和商品流通過程易產(chǎn)生后混濁現(xiàn)象，影響了其飲料開發(fā)的感官價值。目前普遍認為飲料產(chǎn)生后混濁主要原因是蛋白質(zhì)和多酚發(fā)生相互作用，形成肉眼可見的聚集物[4-7]，雖然不影響飲料的食用安全，但會影響消費者的接受度，進而不利于其市場的開拓。因此研究甘蔗原汁后混濁主要成分及后混濁作用機制對有效控制其后混濁問題是至關(guān)重要的[8-10]。近些年，大量研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)是導(dǎo)致飲料發(fā)生后混濁的重要原因，當?shù)鞍踪|(zhì)濃度達到3～4 mg/L時，飲料就容易產(chǎn)生混濁或沉淀[11,12]。Zeng 等[13]研究儲藏過程荔枝汁成分變化，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)和酚類含量在上清液中下降最為明顯，在后混濁物則呈上升趨勢；Millet 等[9]發(fā)現(xiàn)蘋果基飲料混濁物的蛋白質(zhì)含量占混濁物的18%～24%。目前關(guān)于飲料后混濁的研究主要集中在葡萄酒、蘋果汁、啤酒、荔枝汁和茶等飲料[14-18]，而這些飲料在成分、含量及性質(zhì)上，與甘蔗原汁存在明顯差異，特別是在蛋白質(zhì)、多酚、多糖等易導(dǎo)致后混濁物質(zhì)的含量、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)上，因此其在貯存或流通過程發(fā)生的后混濁作用與其他飲料體系的可能不完全一樣。目前對于甘蔗原汁后混濁問題的研究，除了本研究團隊前期分析了甘蔗濃縮汁中的后混濁物主要成分外[2]，尚未見有任何報道。因此本試驗在分析甘蔗原汁后混濁主要成分基礎(chǔ)上，重點分析其蛋白質(zhì)的組分及二級結(jié)構(gòu)，以鑒別出易發(fā)生后混濁的蛋白質(zhì)種類及結(jié)構(gòu)特性，為解決甘蔗原汁后混濁問題提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘蔗，廣西扶綏市甘蔗雙高基地提供，經(jīng)小型壓榨機榨汁后用有50 nm 孔徑的陶瓷膜過濾處理，獲得甘蔗清汁，置于-18 ℃冷庫中保存?zhèn)溆谩?/p>

硫酸銨、鹽酸、硫酸、氫氧化鈉、硫酸鉀、硫酸銅、甲醇和冰醋酸，成都市科龍化學(xué)品有限公司；SDS-PAGE 變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒、透析袋（3500 ku）和甘氨酸，索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YY-T1-10L 超純水儀，成都優(yōu)越科技有限公司；TLE-204E 分析天平，梅特勒-托利多中國有限公司；A-5082 Grodig 連續(xù)波長多功能微孔檢測器，奧地利Untersbergstr.1A 公司；Mini-Protein3Cell 蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司；Orbitrap Elite 組合式質(zhì)譜，美國Thermo Fisher Scientific 公司；KjelMaster K-375凱氏定氮儀，德國Bruker 公司；IRTracer-100 傅立葉紅外光譜，日本島津公司；Gel Doc2000 凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司；CenLee18R 臺式高速冷凍離心機，湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；L-8900 氨基酸分析儀，日本日立公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 甘蔗原汁后混濁物的收集

甘蔗汁置于-18 ℃儲藏6 個月，常溫解凍后經(jīng)8000 r/min 離心15 min，分離上清液和沉淀，超純水水洗沉淀，去除可溶性物質(zhì)，冷凍干燥48 h，獲得凍干粉末[9]，-18 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 后混濁物主要成分的測定

1.3.2.1 總糖的測定

稱量20 mg 沉淀物，用2 mol/L 的三氟乙酸水解沉淀中的糖，采用蒽酮硫酸法測總糖[19]。

1.3.2.2 總酚的測定沉淀中總酚的提取參考Mane 等[20]方法并作出一些修改。將2 mL 0.05%（V/V）三氟乙酸酸化的丙酮/水/甲醇混合溶液（51:34:15，V/V/V）加入到10 mg混濁物中，超聲提?。?50 W，90 min）后，離心，取上清液。采用Folin-Ciocalteu 法測定混濁物的總酚含量。

1.3.2.3 蛋白質(zhì)含量的測定

蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測定[21]。

1.3.2.4 灰分的測定

灰分測定采用灼燒法[22]。

1.3.3 甘蔗原汁上清液蛋白質(zhì)的收集

采用鹽析法收集甘蔗汁上清液中的蛋白質(zhì)[23]。具體操作為：在上清液中加入硫酸銨至80%飽和度，磁力攪拌至硫酸銨完全溶解，于4 ℃靜置3 h，離心分離（8000 r/min，4 ℃，15 min），收集沉淀，并將其置于超純水中透析48 h 去除鹽類及小分子雜質(zhì)，期間每12 h 更換一次水。將透析袋中樣品凍干，并置于-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 SDS-PAGE 凝膠電泳分析

SDS-PAGE 參考Lin 等[24]的方法并作出一些修改。將10 mg 上清液蛋白質(zhì)和后混濁蛋白質(zhì)復(fù)溶在8 mol/L 尿素中，在渦旋振蕩器上混勻，取上清20 μL與等量的上樣緩沖液混合均勻，煮沸5 min 后，離心，取上清液上樣。

電泳條件如下：濃縮膠和分離膠的濃度分別為5%和15%，上樣量30 μL，濃縮膠電壓80 V，持續(xù)30 min；分離膠電壓120 V 至當樣品條帶遷移至凝膠底部時電泳結(jié)束。使用0.125%的考馬斯亮藍R250 溶液（甲醇:冰醋酸:水=3:1:6）對膠進行染色，隨后用脫色液將膠的背景脫至無色，并使用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3.5 酶解及質(zhì)譜鑒定

將電泳條帶均勻切成小份,膠內(nèi)酶解參照Shevchenko[25]的方法。將膠條顆粒漂洗、褪色、脫水及還原烷基化處理后，按1:50 比例用胰蛋白酶酶解過夜，最后用LTQ Orbitrap Elite 組合式質(zhì)譜對酶解的肽段進行分析。得到的質(zhì)譜圖用Proteome Discoverer 1.3軟件通過SEQUEST 算法比對Uniprot 數(shù)據(jù)庫進行蛋白質(zhì)搜索。

1.3.6 甘蔗原汁后混濁物蛋白質(zhì)氨基酸組成分析

采用氨基酸分析儀分析蛋白質(zhì)的氨基酸組成[26,27]。具體操作為：取30 mg 蛋白樣品于具塞水解管內(nèi)，添加10 mL 6 mol/L HCl 置于110 ℃烘箱水解22 h，期間間斷性搖勻水解液，使樣品充分水解。水解完畢后冷卻過濾，取1 mL 濾液于60 ℃水浴蒸干，復(fù)蒸一次后，用0.02 mol/L HCl 沖洗蒸干物并定容至10 mL，過膜，氨基酸分析儀分析。

1.3.7 蛋白質(zhì)平均疏水性分析

甘蔗原汁上清液蛋白質(zhì)和后混濁蛋白質(zhì)的平均疏水性經(jīng)驗計算公式如下[28]：

式中：

Xi——氨基酸占樣品中所有氨基酸的摩爾比例；

Hφi——氨基酸的疏水值。

1.3.8 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）的測定

按照參考文獻[29,30]的方法對冷凍干燥后的蛋白質(zhì)進行FT-IR 測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用SPSS 23.0 軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（p＜0.05），利用Origin 2017 軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 后混濁物主要成分的分析

甘蔗原汁后混濁物的主要成分如圖1 所示，包括蛋白質(zhì)、總糖、總酚和灰分等，表明蛋白質(zhì)、總糖、總酚和灰分都參與了甘蔗原汁后混濁過程。后混濁物中，總糖含量最高，達60.94%；其次是灰分和蛋白質(zhì)，分別為19.52%和18.43%；總酚含量最少，僅為0.62%。甘蔗原汁后混濁物中總糖含量最高，這可能是由于甘蔗原汁中可溶性糖含量高，在后混濁過程會有少量被包裹或夾帶在后混濁物中[6]。Belleau 等[31]在研究啤酒混濁物中也發(fā)現(xiàn)高含量的碳水化合物，認為它們通過某種方式凝結(jié)或粘附在蛋白質(zhì)-多酚主鏈上而被包裹在后混濁物中的，并不是導(dǎo)致后混濁形成的主要因子，蛋白質(zhì)才是導(dǎo)致飲料混濁的重要因素[32-34]。在飲料中，蛋白質(zhì)能與多酚、多糖、咖啡堿及Ca2+等多種成分發(fā)生相互作用，逐漸聚集形成混濁[35]。

2.2 后混濁蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量分布

甘蔗原汁后混濁蛋白質(zhì)和上清液蛋白質(zhì)的SDS-PAGE 分析見圖2。甘蔗原汁上清液蛋白質(zhì)主要分子質(zhì)量在20 ku，而相應(yīng)后混濁蛋白質(zhì)分子質(zhì)量廣泛分布在42 ku 左右和20 ku 以下。這可能是由于該分子質(zhì)量范圍的蛋白質(zhì)容易參與后混濁，也可能是由小分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)聚集形成復(fù)雜的蛋白質(zhì)聚集體。許多針對果汁和葡萄酒的研究發(fā)現(xiàn)，后混濁物中蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量集中在一定的范圍內(nèi)，它們具有一定的相似性。大麥麥芽汁中混濁蛋白質(zhì)分子質(zhì)量主要集中在25～45 ku 及18.4 ku 兩部分[36]；葡萄酒后混濁蛋白質(zhì)則主要分布在18～26 ku 及41、53 和69 ku 處[11]。無論上清蛋白質(zhì)還是后混濁蛋白質(zhì)分子質(zhì)量均小于100 ku，這可能與甘蔗汁經(jīng)50 nm 陶瓷膜處理有關(guān)，大分子蛋白質(zhì)被截留。

2.3 質(zhì)譜鑒定

為了鑒定后混濁蛋白質(zhì)的種類，對圖2 的條帶a和b 進行質(zhì)譜鑒定，結(jié)果如表1 所示。條帶a 和b 分別鑒定出44 種和12 種蛋白質(zhì)，表明甘蔗原汁后混濁蛋白質(zhì)種類繁多。這些蛋白質(zhì)的理論等電點大都位于4～6 之間，與甘蔗原汁的初始pH 5.5 左右接近，因此等電點蛋白質(zhì)析出可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)參與后混濁。其中條帶a 豐度較高的幾種蛋白質(zhì)為PREDICTED：

表1 后混濁物蛋白質(zhì)譜鑒定Table 1 Identified haze proteins by LTQ-Orbitrap

續(xù)表1

calmodulin-7 isoform X1、protein Z、PREDICTED：calcium-dependent protein kinase 34 isoform X1，其理論分子量大部分位于15～25 ku 處，與電泳結(jié)果一致，而條帶b 豐度較高的蛋白質(zhì)為protein Z 和hypothetical protein SORBIDRAFT_01g014740，其理論分子量大都位于9～25 ku，明顯小于電泳結(jié)果，這進一步證實了上述條帶b 處的蛋白質(zhì)一部分是由小分子蛋白質(zhì)聚集，最終蛋白質(zhì)呈多聚體形式存在導(dǎo)致其分子質(zhì)量變大。甘蔗原汁后混濁蛋白質(zhì)中鑒定出大量的protein Z。這與Li 等[37]研究啤酒釀造過程后混濁物的主要成分是protein Z 的結(jié)論是一致的。

2.4 氨基酸分析結(jié)果

由表2 可知，上清液蛋白質(zhì)和后混濁蛋白質(zhì)的氨基酸含量分別占樣品干重的19.82%和11.82%，這與凱氏定氮法測定的相應(yīng)蛋白質(zhì)含量為29.49%和18.43%有一定的差距，說明其中存在一定量的無機氮。

表2 上清液蛋白質(zhì)和混濁物蛋白質(zhì)的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of supernatant protein and haze protein

按照氨基酸比例計算，上清液蛋白質(zhì)和后混濁蛋白質(zhì)的氨基酸組成結(jié)果顯示，無論上清液蛋白質(zhì)還是后混濁蛋白質(zhì)，谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和異亮氨酸含量均較高，說明它們是甘蔗原汁蛋白質(zhì)的主要氨基酸。不同飲料體系中，后混濁蛋白質(zhì)的氨基酸組成各有不同，谷氨酸是蘋果汁后混濁蛋白質(zhì)中的第一或第二組成氨基酸[9]，而在啤酒混濁物中則發(fā)現(xiàn)了高含量的脯氨酸[36]。在蛋白質(zhì)水解過程中，谷氨酰胺和天冬酰胺分別轉(zhuǎn)化為谷氨酸和天冬氨酸，因此他們的含量往往被高估[9]。脯氨酸和半胱氨酸均是疏水性較強的氨基酸，其在后混濁蛋白質(zhì)中的含量分別為上清液蛋白1.44 和1.95 倍。研究表明肽鍵與脯氨酸具有空間位阻，這些蛋白質(zhì)不能自由旋轉(zhuǎn)形成有序螺旋，從而使蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)變得松散無序，疏水位點暴露，易與多酚相互作用形成沉淀[38]。而半胱氨酸含有二硫鍵，貯藏會導(dǎo)致蛋白質(zhì)去折疊，使隱藏于分子內(nèi)部的巰基、二硫鍵和疏水基團暴露，蛋白質(zhì)間的相互作用增強[39]。上清液蛋白質(zhì)和后混濁蛋白質(zhì)中疏水性氨基酸的比例分別為55.46%和57.13%。根據(jù)Lozano 等[28]經(jīng)驗公式計算后混濁蛋白質(zhì)的平均疏水值分別為0.87，比上清液蛋白質(zhì)的平均疏水值高3%。這與黃酒后混濁蛋白質(zhì)的疏水值比上清液蛋白質(zhì)高16.46%有所不同[40]，可能是由于原料不同，后混濁蛋白質(zhì)的性質(zhì)有所不同。上述結(jié)果表明甘蔗原汁后混濁蛋白質(zhì)和上清液蛋白質(zhì)氨基酸的種類和含量差異不明顯，蛋白質(zhì)的低疏水值不是導(dǎo)致甘蔗原汁后混濁的主要因素。

2.5 甘蔗原汁后混濁蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析

FT-IR 能夠有效分析食品成分的化學(xué)組成和構(gòu)象結(jié)構(gòu)，是監(jiān)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化的有效工具。常見的二級結(jié)構(gòu)有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲等。

由圖3 可以看出，在波段500～1000 cm-1，上清液蛋白質(zhì)的吸光度明顯大于后混濁蛋白質(zhì)，而在酰胺I帶（1600～1700 cm-1）處，卻表現(xiàn)出相反的結(jié)果，相對于上清液蛋白質(zhì)，后混濁蛋白質(zhì)的吸光度偏向于高波段，說明后混濁蛋白質(zhì)和上清液蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)存在差異。

圖3b 為上清液蛋白質(zhì)和后混濁蛋白質(zhì)在酰胺I帶的二階導(dǎo)數(shù)圖譜，二階導(dǎo)數(shù)圖譜顯示上清液蛋白質(zhì)具有5 個明顯的峰，而后混濁蛋白質(zhì)則具有7 個峰。對酰胺I 帶原始譜圖（圖3a）分峰擬合，各峰所對應(yīng)的結(jié)構(gòu)如表3 所示。

表3 傅立葉紅外光譜擬合圖譜分析Table 3 Fitting analysis of FT-IR spectra

由表4 可知，后混濁蛋白質(zhì)和上清液蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)組成存在顯著的差異，其中后混濁蛋白質(zhì)中無規(guī)卷曲的含量為21.66%，而上清液蛋白質(zhì)則不含無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，后混濁蛋白質(zhì)的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量分別比上清液蛋白質(zhì)低33.43%和22.42%，β-折疊含量差異不大。研究表明蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和疏水性存在相關(guān)性，其疏水性與α-螺旋的含量成負相關(guān)，與β-折疊和無規(guī)卷曲含量呈正相關(guān)[41]。甘蔗汁后混濁蛋白質(zhì)具有高含量的無規(guī)卷曲和低含量的α-螺旋結(jié)構(gòu)，其疏水性更強，蛋白質(zhì)之間以及蛋白質(zhì)與酚類等其他組分相互作用，溶解度降低，從而促進甘蔗汁后混濁。此外，陶瓷膜過濾甘蔗汁時，為了加快過濾速度，往往加熱至90 ℃以增加通量，高溫條件可能破壞了甘蔗汁蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，疏水性殘基暴露，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水性增強，加速混濁和沉淀形成。

表4 甘蔗原汁后混濁蛋白質(zhì)和上清液蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量Table 4 Secondary structure of protein composition in the haze protein and the supernatant protein

3 結(jié)論

以甘蔗原汁上清液蛋白質(zhì)為對照，對比分析甘蔗原汁后混濁物及其后混濁蛋白質(zhì)的特性，結(jié)果表明：

（1）甘蔗原汁形成沉淀的過程是復(fù)雜的，其后混濁物中主要由蛋白質(zhì)、總糖、總酚和灰分組成。

（2）甘蔗原汁后混濁蛋白質(zhì)分子量主要分布在42 ku 左右和20 ku 以下，分別鑒定出12 種和44 種蛋白質(zhì)，其中豐度較高的幾種蛋白質(zhì)為protein Z，PREDICTED：calmodulin-7 isoform X1，PREDICTED：calcium-dependent protein kinase 34 isoformX1 和hypothetical protein SORBIDRAFT_01g014740。

（3）后混濁蛋白質(zhì)氨基酸的平均疏水值略高于上清液蛋白質(zhì)，表明氨基酸組成的差異不是導(dǎo)致甘蔗汁后混濁的主要原因。兩者的二級結(jié)構(gòu)差異明顯，后混濁蛋白質(zhì)中具有高含量的無規(guī)卷曲和低含量的α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。

綜上，分子質(zhì)量大小低于42 ku、疏水值高、α-螺旋含量低和無規(guī)卷曲含量高的蛋白質(zhì)更容易參與甘蔗原汁后混濁。