內(nèi)蒙古酸馬奶中植物乳植桿菌NM18 胞外多糖的結(jié)構(gòu)特征

劉明超，王榮平，何宇星，楊曉鳳，于靖和，烏云達來

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

酸馬奶是一種產(chǎn)于中亞和東歐地區(qū)的發(fā)酵馬奶飲料，在蒙古語中酸馬奶被稱為“策格”[1,2]，又叫馬奶酒，它是以鮮馬乳為原料，利用天然發(fā)酵劑和傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵而成[3]。其風(fēng)味獨特，醇香濃郁，營養(yǎng)價值很高，具有驅(qū)寒、活血、舒筋、消食、健胃等功能[1]。酸馬奶中的有益微生物主要由乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）和酵母菌（Yeast）組成[4,5]，在酸馬奶中發(fā)現(xiàn)了各種乳酸菌菌株，包括干酪乳桿菌、植物乳植桿菌、發(fā)酵乳桿菌、瑞士乳桿菌等[6,7]。乳酸菌作為一大類益生菌，具有免疫調(diào)節(jié)、抑制胃腸道病原菌等多種生物活性，其所產(chǎn)的胞外多糖因來源安全、類型多樣、性能優(yōu)異等特點受到人們的廣泛關(guān)注[8,9]。酸馬奶的諸多醫(yī)用價值主要取決于其中所含有的益生菌及其代謝產(chǎn)物（如抗生素、細菌素、胞外多糖等）以及馬奶降解產(chǎn)物（如多肽、有機酸等）等。

胞外多糖（Exopolysaccharides，EPSs）是由一些微生物（細菌、真菌、放線菌、藍藻等）在代謝過程中分泌的一類具有不同糖殘基的高分子聚合物，一般由單糖通過糖苷鍵以直鏈或支鏈形式連接而成[10]，其功能多樣，質(zhì)量穩(wěn)定，受自然地理和氣候環(huán)境的影響小，具有較高的性價比和廣闊的應(yīng)用前景[11,12]。由于胞外多糖具有獨特的物理和流變性能，即成膠、增稠、乳化及絮凝劑等，使其在食品、化妝品、膠粘劑、廢水處理、油回收以及藥理學(xué)行業(yè)方面得到了廣泛應(yīng)用[13-15]。此外，胞外多糖對于改善機體腸道微生態(tài)、抗腫瘤[16]、免疫調(diào)節(jié)[4]、降低血液膽固醇[17,18]等都有所裨益?；谌樗峋舛嗵堑囊幌盗猩砩攸c，本研究將對從內(nèi)蒙古酸馬奶中分離純化的一株產(chǎn)胞外多糖植物乳植桿菌NM18 進行相關(guān)胞外多糖結(jié)構(gòu)的研究，完善關(guān)于產(chǎn)胞外多糖酸馬奶源乳酸菌的特異性篩選和鑒定，對于后續(xù)實現(xiàn)植物乳植桿菌胞外多糖的工業(yè)化應(yīng)用及其在機體內(nèi)的益生作用提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和主要試劑

1.1.1 菌株來源

菌株分離自內(nèi)蒙古酸馬奶樣品中一株產(chǎn)胞外多糖的植物乳植桿菌Lpb.plantarumNM18[19]。

1.1.2 主要試劑

Cellulose DE-52，Whatman 公司；Sepharose CL-6B，Pharmad 公司；截流膜，Solarbio 公司；葡聚糖系列標(biāo)準品，美國Sigma 公司；TSK-GEL GM PWXL 柱，Tosoh Corp 公司；Agilent 7890B GC system-5977A MSD，Palo Alto 公司；HP-5 毛細管柱，CA 公司；Bruker AVANCE AV-500 型，F(xiàn)?llanden 公司。

1.2 菌株活化

將甘油保藏的菌株NM18 接種于脫脂乳培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫活化。

1.3 胞外多糖的分離純化

分離胞外多糖按照Zhu 等[20]的方法，稍作修改。待脫脂乳培養(yǎng)基凝固后（12 h）用接種環(huán)接于MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫傳2 代培養(yǎng)，每代12～24 h，離心除去菌體和凝結(jié)蛋白等雜質(zhì)。取上清液，加入80%（m/V）三氯乙酸（TCA）使其最終濃度為4%（m/V），4 ℃靜置放置12 h，離心（10000×g，20 min，4 ℃）去除蛋白沉淀，50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮上清液，用80%（V/V）乙醇在4 ℃下沉淀多糖24 h。離心（12000×g，30 min，4 ℃）收集多糖沉淀；用去離子水中透析48 h 并凍干得到粗多糖（CEPS）。

對CEPS 采用DEAE-Cellulose 52（2.6×30 cm）離子交換色譜分級純化。稱取CEPS 于去離子水中充分溶解后使用0.45 μm 濾膜過濾，然后上樣于DEAE-Cellulose 52 離子交換層析柱中，依次用不同濃度NaCl 溶液（0、0.1、0.3、0.5 和0.7 mol/L）梯度洗脫，流速為1 mL/min，收集（10 min/管）后用苯酚-硫酸法檢測各管的多糖含量[21]。收集、濃縮、透析和凍干后用Sepharose CL-6B 凝膠柱（1.6×40 cm）進一步純化，用去離子水以0.5 mL/min的流速洗脫。收集（10 min/管），透析后凍干。

1.4 純度和分子量的測定

采用 Agilent 1260 型高效液相色譜儀配備TSK-GEL GM PWXL柱和差示檢測器（RID），通過高效排阻色譜（HPSEC）測定胞外多糖的純度和平均分子量（Mw）。將各純化組分（1.0 mg/mL，10 μL）用0.1 mol/L 的乙酸銨溶液在25 ℃下洗脫（流速為0.5 mL/min）。通過使用葡聚糖標(biāo)準（Mw=12000 u、55000 u、150000 u、270000 u 和670000 u）繪制的校準曲線計算這六種胞外多糖的Mw。

1.5 基本成分及單糖組分分析

總糖含量采用苯酚-硫酸法[14]測定；測定蛋白質(zhì)含量按Bradford 等[22]的方法；測定糖醛酸含量[23]和硫酸鹽基含量[24]按Nelly 等[23]的方法，稍作修改；采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）法測定其單糖組成。將樣品用4 mol/L 的三氟乙酸（TFA）在120 ℃下水解2 h，使得到的單糖轉(zhuǎn)化為糖腈乙酸酯衍生物。然后使用Agilent 7890B GC system-5977A MSD 配備HP-5 毛細管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm），溫度梯度以3 ℃/min從120 ℃到210 ℃，使用火焰離子化檢測器（FID）進行檢測。

1.6 紫外及紅外光譜分析

使用SHIMADZU UV-2450型紫外-可見分光光度計在190～500 nm 波長范圍內(nèi)記錄EPSs 的紫外光譜。將純化后的EPSs 與KBr 粉混合，研磨壓制成粉末，使用IRAffinity-1 型傅立葉變換紅外光譜儀（FT-IR）在4000～400 cm-1內(nèi)的范圍進行掃描。

1.7 甲基化分析

將胞外多糖甲基化的方法參考文獻稍作修改[25]。組分分離和單糖轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的甲基化糖醇醋酸酯的過程參考文獻稍作修改[26]。甲基化糖醇醋酸酯的糖鍵的氣相色譜-質(zhì)譜分析采用HP-5 毛細管柱，以溫度梯度為3 ℃/min，將溫度升至210 ℃，接口溫度為250 ℃，載氣為氦（He），流率為1.0 mL/min，樣品體積為10.0 μL，圖譜使用NIST 11 譜庫行檢索。

1.8 核磁共振分析

將冷凍干燥的Lpb.plantarumNM18 所產(chǎn)各EPS純化組分充分溶解于D2O 中，用Bruker AVANCE AV-500型核磁共振儀進行分析，以四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標(biāo)，25 ℃測定，在313 K 下記錄1H NMR 和13C NMR 譜，化學(xué)位移（δ）用10-6表示。

1.9 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 胞外多糖的分離純化

Lpb.plantarumNM18 的MRS 發(fā)酵液培養(yǎng)經(jīng)離心除菌體蛋白、乙醇沉淀多糖、去離子水復(fù)溶透析、真空冷凍干燥等過程得到295.0 mg 的CEPS。然后用不同濃度的NaCl 洗脫后共得到5 種組分（圖1），分別標(biāo)為EPS-1～5。組分EPS-1 用去離子水洗脫，為中性多糖；其余組分用不同濃度的NaCl 洗脫，為酸性多糖或者帶有酸性基團的糖復(fù)合物。對5 種組分使用Sepharose CL-6B 柱進行進一步純化（圖2、圖3），洗脫后最終得到6 種組分（EPS-1A、EPS-1B、EPS-2、EPS-3、EPS-4、EPS-5），濃縮、透析和凍干備用。

2.2 各EPS 純化組分的純度鑒定和分子量測定

Lpb.plantarumNM18 所產(chǎn)各EPS 純化組分相對分子質(zhì)量的高效液相色譜圖（圖4）中可知，6 種組分經(jīng)過HPSEC 均得到一個單一的洗脫峰，峰形尖銳對稱，所以各EPS 組分純化為單一多糖。以葡聚糖為標(biāo)準，按分子量由小到大依次進樣求得回歸方程，得到平均相對分子質(zhì)量分別為 2.11×105、2.04×105、2.02×105、2.17×105、2.09×105、1.93×105u。

2.3 組分成分分析

胞外多糖組分成分分析（表1）可知，CEPS 和組分EPS-1A、EPS-1B、EPS-2、EPS-3、EPS-4 和EPS-5的總糖含量分別為75.25%、96.88%、95.98%、94.67%、80.06%、84.32%和70.38%。利用“考馬斯亮藍法”測定CEPS 的蛋白質(zhì)含量為1.13%，組分EPS-4 的蛋白質(zhì)含量高達7.22%，其他組分中未檢出蛋白質(zhì)。以“氯化鋇-明膠比濁法”測定硫酸根含量分別為1.40%、0.22%、0.31%、0.26%、0.42%、6.30%和0.27%。用“硫酸-咔唑法”測定的糖醛酸含量分別為3.24%、0.23%、0.34%、0.25%、0.43%、0.54%和0.85%。

表1 CEPS 和各EPS 純化組分的成分分析Table 1 Component analysis of CEPS and the purified EPS

2.4 紫外及紅外光譜分析

菌株NM18 所產(chǎn)胞外多糖的紫外及紅外光譜分析（圖5）中得知，組分EPS-4 在260～280 nm 有一個較強的吸收峰，說明組分EPS-4 的蛋白質(zhì)含量高于其他組分（EPS-1A、EPS-1B、EPS-2、EPS-3 和EPS-5 在該區(qū)域沒有吸收峰，說明它們不含蛋白質(zhì)）。組分EPS-1A、EPS-1B、EPS-2、EPS-3、EPS-4 和EPS-5的FT-IR 光譜（圖6）顯示，所有光譜均有明顯的多糖吸收峰，表明均存在吡喃糖環(huán)。組分EPS-1A、EPS-1B 和EPS-2 具有非常相似的FT-IR 光譜，具有α-D-Galp和α-D-Glcp基團；而組分EPS-4 具有N-H彎曲振動和S=O 伸縮振動，都具有較高的蛋白質(zhì)和硫酸鹽基含量。

2.5 單糖成分分析

氣相色譜-質(zhì)譜分析（圖7）顯示，組分EPS-1A由三種單糖組成，分別是D-Man（RT 26.906）、D-Glc（RT 27.247）和D-Gal（RT 27.938），比值為8.64:2.63:1。組分EPS-1B 也由D-Man（RT 26.966）、D-Glc（RT 27.372）和D-Gal（RT 28.012）組成，但比例為3.22:2.68:1。組分EPS-2 由D-Man（RT 27.088）、D-Glc（RT 27.281）和D-Gal（RT 27.969）組成，比值為8.23:1.03:1。因此，組分EPS-1A、EPS-1B 和EPS-2與L.plantarumKF5[27]、L.plantarumMTCC 9510[28]和L.plantarum7081[21]的單糖組成相似。組分EPS-3由L-Rha（RT 18.683）、L-Fuc（RT 19.59）、D-Man（RT 26.816）、D-Glc（RT 27.253）、D-Gal（RT 27.927）和N-Acetyl-D-glucosamine（RT 31.237）組成，比值為0.16:0.18:0.74:5.47:1.04:1。組分EPS-4 由D-Man（RT 26.815）、D-Glc（RT 27.19）、D-Gal（RT 27.912）和N-Acetyl-D-glucosamine（RT 31.219）組成，比值為1.49:0.36:1:2.49。組分EPS-5 由L-Fuc（RT 19.595）、D-Man（RT 26.813）、D-Allose（RT 27.19）、D-Gal（RT 27.969）和N-Acetyl-D-glucosamine（RT 31.316）組成，比例為0.91:1:0.11:6.73:4.82。根據(jù)以往研究，S.thermophilusMR-1C[29]含有巖藻糖，L.helveticusTY 1-2[30]、L.lactissubsp.CremorisLC330[31]、L.acidophilusLMG9433[32]、L.rhamnosusGG 和L.suebicusCUPV225/226 含有N-乙酰葡萄糖胺。

2.6 甲基化分析

甲基化和氣相質(zhì)譜分析（表2）顯示，組分EPS-1A和EPS-1B 均由→3)-D-Glcp-(1→、→6-D-Galp-(1→、→4-D-Glcp-(1→和→6-D-Manp-(1→組成，末端殘基為D-Glcp-(1→。組 分 EPS-2 由→6-D-Galp-(1→和→6-D-Manp-(1→組成，末端殘基也為D-Glcp-(1→。結(jié)合一維核磁共振的結(jié)果，組分EPS-1A、EPS-1B 和EPS-2 的糖環(huán)為吡喃糖，包含α和β糖苷鍵。結(jié)果表明，與組分EPS-1A 和EPS-1B 相比，組分EPS-2 的糖苷鍵類型更少。

表2 EPS-1A、EPS-1B 和EPS-2 的甲基化分析Table 2 Methylation analysis of EPS-1A,EPS-1B and EPS-2

2.7 核磁共振光譜（NMR）分析

從組分EPS-1A、EPS-1B 和EPS-2 的1H 的NMR圖（圖8）可知，4.7×10-6附近的譜峰對應(yīng)水峰，3.2×10-6～4.0×10-6之間的峰值對應(yīng)C2-C6質(zhì)子信號疊加，不易解析。在4.8×10-6～5.5×10-6的組分EPS-1A 光譜中，有5 個與異頭質(zhì)子對應(yīng)的化學(xué)位移，信號分別為 5.17×10-6、5.01×10-6、4.99×10-6、4.97×10-6和4.92×10-6，分別對應(yīng)于組分EPS-1A 的五個糖殘基（分別標(biāo)記為A～E）。從異頭信號的化學(xué)位移和耦合常數(shù)來看，A、B、C 和D 處于α構(gòu)型，而E 處于β構(gòu)型。

在4.8×10-6～5.5×10-6的組分EPS-1B 光譜中，也有5 個異頭質(zhì)子對應(yīng)的化學(xué)位移，信號分別為5.26×10-6、5.16×10-6、4.98×10-6、4.90×10-6、4.83×10-6，分別對應(yīng)于組分EPS-1B 的5 個糖殘基（分別標(biāo)記為A～E）。再從化學(xué)位移和耦合常數(shù)來看，A、B 和C 是α構(gòu)型，D 和E 是β構(gòu)型。

在4.8×10-6～5.5×10-6的組分EPS-2 光譜中，在5.18×10-6、5.00×10-6和4.93×10-6的非均相質(zhì)子中有三個化學(xué)位移，表明組分EPS-2 糖鏈中含有三個糖殘基（分別標(biāo)記為A、B 和C）。我們得出結(jié)論A 和B 是α構(gòu)型，C 是β構(gòu)型。

組分EPS-1A、EPS-1B 和EPS-2 的13C 核磁共振譜圖（圖9）可知，組分EPS-1A 中有5 種不同的碳信號分別對應(yīng)甘露糖、葡萄糖和半乳糖殘基的α或β構(gòu)型，而C-1 殘基對應(yīng)的峰值分別為105.29×10-6、102.16×10-6、102.12×10-6、102.10×10-6和100.50×10-6。

同樣，組分EPS-1B 中有5 種不同的碳信號分別對應(yīng)甘露糖、葡萄糖和半乳糖殘基的α或β構(gòu)型，C-1殘基對應(yīng)的峰分別為105.24×10-6、105.05×10-6、104.27×10-6、102.08×10-6和100.46×10-6。最后，組分EPS-2 中有三個對應(yīng)α或β構(gòu)型的峰，C-1 糖殘基對應(yīng)的峰分別為105.05×10-6、102.11×10-6和100.49×10-6。

3 結(jié)論

本研究從Lpb.PlantarumNM18 發(fā)酵液中分離出6 種胞外多糖組分，其中含兩個中性組分（EPS-1A 和EPS-1B）。經(jīng)GC-MS 分析得知，組分EPS-1A、EPS-1B和EPS-2 由甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成；組分EPS-3由甘露糖、葡萄糖、半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺組成，還含有微量的鼠李糖和巖藻糖；組分EPS-4 由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺和巖藻糖組成；組分EPS-5 由阿洛糖、半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺組成。本研究報道Lpb.plantarum胞外多糖含有巖藻糖和N-乙酰葡萄糖胺，組分EPS-5 中含有罕見的阿洛糖，在乳酸菌胞外多糖中尚未見研究。對組分EPS-1A、EPS-1B 和EPS-2 進行甲基化分析，結(jié)合FT-IR 光譜和NMR 光譜分析得知，盡管相對摩爾比不同，組分EPS-1A 和EPS-1B 具有相同的→3)-D-Glcp-(1→，→6-D-Galp-(1→，→4-D-Glcp-(1→，→6-D-Manp-(1→和D-Glcp-(1→的結(jié)構(gòu)。同時，組分EPS-2 主要由→6-D-Galp-（1→，→6-D-Manp-（1→和D-Glcp-（1→組成。組分EPS-1A、EPS-1B 和EPS-2 的糖環(huán)為吡喃糖，糖苷鍵構(gòu)型為α和β型的混合物。不同乳酸菌產(chǎn)生不同的胞外多糖，Lpb.plantarumNM18 所產(chǎn)胞外多糖的單糖組成和摩爾比明顯豐富，因此值得期待做進一步分析。