凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵乳的工藝優(yōu)化

肖蘭芳，趙珊，劉冬梅，吳暉

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

長(zhǎng)期以來(lái)，發(fā)酵乳、奶酪常被用作益生菌乳制品載體[1]。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳與人的長(zhǎng)壽和健康密切相關(guān)[2]，研究人員致力于通過(guò)添加益生菌、益生元和各種植物提取物等增值成分，賦予發(fā)酵乳額外的益生性質(zhì)，使得益生性發(fā)酵乳在過(guò)去20 多年里贏得了巨大的市場(chǎng)[3,4]。目前，在發(fā)酵乳及其飲品中已商業(yè)化應(yīng)用的益生菌主要為L(zhǎng)actobacillusspp.[5,6]、Bifidobacteriumspp.，代表性的菌種有Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus casei、Animal Lactobacillussubspecies、Bifidobacterium lactis、Bifidobacterium longum等。為促進(jìn)益生菌的生長(zhǎng)和活力，常在益生菌發(fā)酵乳及其乳飲料中添加棉子糖[7]、低聚果糖[8]和菊粉[9]等益生元。益生元的刺激作用取決于益生菌的種類(lèi)和食物基質(zhì)的性質(zhì)。例如，乳飲料中B.animalisBb-12 和Lb.acidophilusLa-5 的生長(zhǎng)不受菊粉或玉米纖維的影響，但聚葡萄糖顯著刺激了這些益生菌在冷藏條件下的生長(zhǎng)[10]。

凝結(jié)芽孢桿菌，作為新一代益生菌制劑，已有大量文獻(xiàn)證實(shí)其在食品中應(yīng)用的安全性[11,12]。其可分泌多種代謝產(chǎn)物，如脂肪酶[13]、木質(zhì)素[14]，也可與其它菌群相互協(xié)調(diào)從而調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡[15]、促進(jìn)機(jī)體消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[16]、增強(qiáng)機(jī)體免疫力[17]，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的生理功能。美國(guó)FDA 早在1992 年批準(zhǔn)凝結(jié)芽孢桿菌為安全可食用的益生菌，目前其已廣泛應(yīng)用到巧克力、面包、飲料[18]等食品中。國(guó)內(nèi)自2016 年確定其可應(yīng)用于食品后逐漸打開(kāi)市場(chǎng)，已開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品有口服液、膠囊、乳酸及藥品[16]，還有相關(guān)研究人員將其應(yīng)用到益生菌糖果[19]、發(fā)酵飲料[20]及發(fā)酵乳[21,22]等食品中。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[23]表明凝結(jié)芽孢桿菌13002+低聚果糖（BCS+FOS）可恢復(fù)環(huán)磷酰胺（CTX）所引起的血清免疫球蛋白水平的降低，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平，具有較好的益生特性。本文通過(guò)單因素、響應(yīng)面試驗(yàn)探索添加低聚果糖的凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵乳的發(fā)酵工藝，希望為新型發(fā)酵乳研發(fā)提供理論基礎(chǔ)和拓展思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）13002[23-25]，由本課題組從中國(guó)傳統(tǒng)自制發(fā)酵泡菜中分離篩選得到，并于2013 年保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，編號(hào)CGMCC NO.7431；保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）CGMCC 1.290，嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）CGMCC 1.2741，購(gòu)于廣東省微生物菌種保藏中心。

全脂奶粉，雀巢（中國(guó)）有限公司；白砂糖，太古糖業(yè)有限公司；oligo -低聚果糖，量子高科（中國(guó)）生物工程有限公司；Volatile Free Acid Mix，SUPELCO；25%戊二醛，上海信裕生物工程有限公司；甲醛、無(wú)水乙醇、乙酸異戊酯、乳酸、濃硫酸（均為分析純），廣州市叢源試劑有限公司；海藻糖，廣州藍(lán)澤生物科技有限公司。

SPX-350B 型生化培養(yǎng)箱，上海坤天實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；TG 16G 型高速冷凍離心機(jī)，河北北弘實(shí)業(yè)有限公司；RHB80 型手持折光儀，石家莊泰斯特儀器設(shè)備有限公司；680 型多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Rad伯樂(lè)；FiveEasy Plus 型pH 計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LGJ-10A 型冷凍干燥機(jī)，上海豫明儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵劑制備

將凝結(jié)芽孢桿菌13002 干粉溶于無(wú)菌生理鹽水，按3%（V/V）接種于其液體培養(yǎng)基中，經(jīng)2～3 次活化培養(yǎng)后用無(wú)菌生理鹽水洗滌離心（8000 r/min，4 ℃，10 min）三次，取菌泥。按菌泥：保護(hù)劑（10%的脫脂奶粉及10%的海藻糖溶于0.9%的無(wú)菌生理鹽水）=1:3（m/m）混勻，冷凍干燥，收集凍干粉，凝結(jié)芽孢桿菌凍干粉活菌數(shù)為61.50×109CFU/g，-20 ℃下保存，備用。同上方法得保加利亞乳桿菌凍干粉活菌數(shù)為1.00×109CFU/g，嗜熱鏈球菌凍干粉活菌數(shù)為1.00×109CFU/g，-20 ℃下保存，備用。

發(fā)酵乳的制備過(guò)程：將12 g 全脂奶粉和8 g 白砂糖混勻，加入100 mL 無(wú)菌生理鹽水，85 ℃水浴滅菌30 min，冷卻后接種發(fā)酵劑，43 ℃發(fā)酵4 h，4 ℃后熟12 h。

1.2.2 發(fā)酵乳的工藝優(yōu)化

1.2.2.1 菌種復(fù)配比優(yōu)化

將凝結(jié)芽孢桿菌（BCS）與傳統(tǒng)發(fā)酵劑（保加利亞乳桿菌+嗜熱鏈球菌，SL）按1:0、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5、0:1 的比例，總接種量1%（m/V），43 ℃發(fā)酵4 h，4 ℃后熟12 h，探究菌種復(fù)配比對(duì)發(fā)酵乳品質(zhì)的影響，并進(jìn)行相關(guān)基本理化性質(zhì)及感官的測(cè)定。

1.2.2.2 接種量?jī)?yōu)化

添加4%（m/V）低聚果糖，將凝結(jié)芽孢桿菌（BCS）與傳統(tǒng)發(fā)酵劑（SL）按3:1 的比例，按不同的總接種量0.2%、0.5%、0.8%、1.0%、2.0%（m/V），43 ℃發(fā)酵4 h，4 ℃后熟12 h，對(duì)發(fā)酵乳進(jìn)行相關(guān)基本理化性質(zhì)及感官的測(cè)定，探究得出最優(yōu)菌種接種量。

1.2.2.3 低聚果糖添加量?jī)?yōu)化

添加低聚果糖0、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%（m/V），將凝結(jié)芽孢桿菌（BCS）與傳統(tǒng)發(fā)酵劑（SL）按3:1 的比例，總接種量1.0%（m/V），43 ℃發(fā)酵4 h，4 ℃后熟12 h，探究低聚果糖添加量對(duì)發(fā)酵乳品質(zhì)的影響，并進(jìn)行相關(guān)基本理化性質(zhì)及感官的測(cè)定。

1.2.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化工藝

由1.2.2.1～1.2.2.3 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)Box-Behnken軟件進(jìn)行3 因素3 水平的隨機(jī)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，如表1 所示。

表1 發(fā)酵工藝的因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factor level design of fermentation process

1.2.3 發(fā)酵乳基本理化指標(biāo)測(cè)定

1.2.3.1 pH 的測(cè)定

取適量的發(fā)酵乳樣品于錐形瓶中，pH 計(jì)校準(zhǔn)后，測(cè)定發(fā)酵乳樣品的pH，待示數(shù)穩(wěn)定后讀數(shù)并記錄。

1.2.3.2 滴定酸度的測(cè)定

酸度按照GB 5009.239-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品酸度的測(cè)定》方法測(cè)定。

1.2.3.3 可溶性固形物的測(cè)定

用純水校正阿貝折光儀，把待測(cè)發(fā)酵乳樣品1～2滴滴在折光計(jì)的磨砂（樣品）面上，從折光計(jì)上直接讀出可溶性固形物含量值。

1.2.3.4 持水力測(cè)定

取適量發(fā)酵乳樣品，記為m1，3500 r/min 離心10 min，將分離乳清傾倒掉，稱(chēng)量剩余物質(zhì)的質(zhì)量，記為m2。計(jì)算公式如下：

1.2.4 發(fā)酵乳的感官特性

感官評(píng)定小組成員的組成：選定華南理工大學(xué)在讀本科生、研究生、教師等20 人。發(fā)酵乳樣品的感官評(píng)價(jià)從色澤、滋味、氣味、質(zhì)構(gòu)4 個(gè)方面進(jìn)行，評(píng)價(jià)前對(duì)參與人員進(jìn)行了相關(guān)評(píng)定內(nèi)容的介紹及注意事項(xiàng)，評(píng)定過(guò)程中不告知樣品類(lèi)別、不互相探討，感官評(píng)價(jià)指標(biāo)如表2 所示。

表2 發(fā)酵乳感官評(píng)價(jià)指標(biāo)表Table 2 The sensory evaluation indexes of yogurt

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次；采用Design-Expert 8.0.6 Trial 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析；采用SPSS 軟件進(jìn)行顯著性分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，p＜0.05 認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種復(fù)配比對(duì)發(fā)酵乳品質(zhì)的影響

不同菌種復(fù)配比的發(fā)酵乳的基本理化性質(zhì)及感官評(píng)分如表3、圖1 所示。由表3 可知，僅接種凝結(jié)芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，酸度僅為60.42 °T，與傳統(tǒng)發(fā)酵劑1:1 進(jìn)行復(fù)配發(fā)酵時(shí)，酸度顯著提高，即適量的傳統(tǒng)發(fā)酵劑可啟動(dòng)凝結(jié)芽孢桿菌的發(fā)酵，提高發(fā)酵乳的酸度值，可能與干酪乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌偶聯(lián)發(fā)酵從而提高凝結(jié)芽孢桿菌活菌數(shù)[26]原理一致；與發(fā)酵乳pH 值的對(duì)比中發(fā)現(xiàn)，復(fù)配比為1:3 時(shí)pH 值最低，而酸度值較低，說(shuō)明pH 值與口感的酸度值并不對(duì)應(yīng)，結(jié)合感官評(píng)價(jià)，配比為1:3 時(shí)酸度適中，并不是最酸的發(fā)酵乳。

如圖1 所示為菌種不同復(fù)配比下發(fā)酵乳的感官評(píng)價(jià)結(jié)果，主要從色澤、質(zhì)構(gòu)、滋味、氣味四方面進(jìn)行評(píng)價(jià)。由表3、圖1 可知，凝結(jié)芽孢桿菌占比太高，發(fā)酵乳酸度及風(fēng)味不足，凝結(jié)芽孢桿菌占比太低，持水力較低、凝乳狀態(tài)差，當(dāng)復(fù)配比為5:1 與3:1 時(shí)，其酸度適中，凝乳狀態(tài)良好，結(jié)合感官評(píng)分，復(fù)配比為3:1 時(shí)，發(fā)酵乳滋味、色澤及凝乳狀態(tài)均處于較優(yōu)水平。因此，選擇菌種復(fù)配比的范圍為2:1～4:1。

表3 不同菌種復(fù)配比對(duì)發(fā)酵乳基本理化性質(zhì)及感官的影響Table 3 Effects of different mixture ratio of bacteria on basic physicochemical properties and sensory perception of fermented milk

2.2 接種量對(duì)發(fā)酵乳品質(zhì)的影響

如表4、圖2 所示，為不同接種量對(duì)發(fā)酵乳基本理化性質(zhì)及感官品質(zhì)的影響，可知，發(fā)酵乳的pH 隨接種量的增加逐漸降低，酸度隨接種量的增加而逐漸升高，且各組之間存在顯著性差異，酸度值由66.94 °T升高至89.24 °T，其口感及風(fēng)味產(chǎn)生顯著變化，與錢(qián)志偉等[27]試驗(yàn)中隨發(fā)酵劑添加量增加山藥香蕉風(fēng)味酸奶發(fā)酵加速，產(chǎn)酸量增加的結(jié)果一致。相比較而言，各組可溶性固形物及持水力則變化較為平穩(wěn)，可溶性固形物保持在16%左右，持水力保持在50%左右。當(dāng)接種量為1%、2%時(shí)，發(fā)酵乳的氣味、滋味較為突出，且酸度適中，凝乳效果良好，綜合感官評(píng)分高于80分，綜合生產(chǎn)成本考慮，發(fā)酵乳最宜接種量為1%。因此，選擇菌種接種量的范圍為0.5%～1.5%，高于山藥香蕉風(fēng)味酸奶的發(fā)酵劑接種量0.2%[27]。

表4 不同接種量對(duì)發(fā)酵乳基本理化性質(zhì)及感官的影響Table 4 Effects of different inoculations on basic physicochemical properties and sensory perception of fermented milk properties of fermented milk

2.3 低聚果糖添加量對(duì)發(fā)酵乳品質(zhì)的影響

低聚果糖是由2～10 個(gè)單糖通過(guò)糖苷鍵連接形成直鏈或支鏈的低度聚合糖，因其特有糖苷鍵和糖基，不易被單胃動(dòng)物自身分泌的消化酶水解，且到達(dá)腸道后能被有益微生物利用從而促進(jìn)腸道有益菌群生長(zhǎng)和增殖[28]。研究發(fā)現(xiàn)，低聚果糖對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌具有體外增殖作用[29]。因此，在發(fā)酵乳中添加低聚果糖作為碳源、改善口感。且前期研究表明低聚果糖可刺激凝結(jié)芽孢桿菌13002 的生長(zhǎng)，如表5、圖3 所示，為不同低聚果糖添加量對(duì)發(fā)酵乳基本理化性質(zhì)及感官品質(zhì)的影響。

由表5 可知，添加低聚果糖的發(fā)酵乳的各項(xiàng)品質(zhì)均優(yōu)于未添加低聚果糖的組別，尤其是可溶性固形物的含量，添加低聚果糖后顯著上升，且感官評(píng)分結(jié)果表明，未添加低聚果糖的發(fā)酵乳感官評(píng)分最低，可見(jiàn)發(fā)酵乳中添加一定量的低聚果糖能夠改善其味道與口感。pH 值隨著低聚果糖添加量的增加逐漸降低，而酸度隨低聚果糖添加量的增加先升高后降低，在低聚果糖添加量為1.0%、2.0%時(shí)，其酸度口感適宜，且綜合經(jīng)濟(jì)利益與生產(chǎn)效率方面考慮，發(fā)酵乳中低聚果糖添加量范圍為1.0%～2.0%。添加適量的低聚果糖可改善發(fā)酵乳口感、降低pH 值、增加酸度，與孫敏等[30]的試驗(yàn)結(jié)果相一致，其中添加3%的低聚果糖可有效降低低脂凝固型發(fā)酵乳與全脂發(fā)酵乳的差異。

表5 不同低聚果糖添加量對(duì)發(fā)酵乳基本理化性質(zhì)及感官的影響Table 5 Effects of different oligofructose additions on basic physicochemical properties and sensory properties of fermented milk

2.4 發(fā)酵乳響應(yīng)面優(yōu)化

為使發(fā)酵乳酸度適中、具有良好的持水性、凝乳時(shí)間快、色澤及口感好、香氣濃郁，通過(guò)2.2 單因素試驗(yàn)，確定發(fā)酵菌種復(fù)配比（A）為2:1～4:1，低聚果糖添加量（B）為1%～2%，發(fā)酵劑接種量（C）為0.5%～1.5%。根據(jù)Box-Behnken 設(shè)計(jì)的中心組合原理，選取3 個(gè)因子響應(yīng)的3 個(gè)水平，使用Design-Expert 8.0.6 軟件設(shè)計(jì)3 因素3 水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，以滴定酸度為指標(biāo)，確定凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵乳的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)。表6 為發(fā)酵乳響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果。

表6 發(fā)酵乳響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Fermented milk response surface analysis test design and results

如表7 所示，為響應(yīng)面回歸模型方差分析。由表7 可知，各因素對(duì)發(fā)酵乳的滴定酸度的影響大小依次為：C＞B＞A，即接種量＞低聚果糖＞菌種配比?；貧w模型的p＜0.0001，失擬項(xiàng)的p值為0.30，說(shuō)明該回歸方程極顯著。失擬檢驗(yàn)不顯著，說(shuō)明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾很小，不需要引入更高次數(shù)的項(xiàng)，模型恰當(dāng)。

表7 響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 7 Response surface regression model analysis of variance

通過(guò)軟件分析可知，滴定酸度（Y）對(duì)自變量發(fā)酵劑菌種復(fù)配比（A）、低聚果糖添加量（B）、接種量（C）的多元回歸方程：

該方程表達(dá)了發(fā)酵乳的滴定酸度和3 個(gè)自變量之間的關(guān)系是顯著的，即這種方法是可靠的?；貧w方程交互項(xiàng)系數(shù)中BC 的交互系數(shù)比較大，說(shuō)明低聚果糖添加量和接種量之間的交互效應(yīng)大，而AC、AB 的交互系數(shù)相對(duì)較小，說(shuō)明發(fā)酵劑菌種復(fù)配比和接種量、低聚果糖添加量和菌種復(fù)配比之間的交互效應(yīng)較小。

通過(guò)軟件分析可知，該模型的決定系數(shù)R2及R2Adj均＞0.9，說(shuō)明該方程與實(shí)際情況擬和良好，較好地反映了酸度與菌種配比、低聚果糖添加量、接種量的關(guān)系。說(shuō)明該模型相關(guān)性良好，實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定可信度較高。

為了檢驗(yàn)方程的有效性，對(duì)測(cè)定的發(fā)酵乳中的滴定酸度的數(shù)學(xué)模型繼續(xù)進(jìn)行方差分析，并進(jìn)一步檢測(cè)各因子的偏回歸系數(shù)。結(jié)果表明，一次項(xiàng)中C 的回歸系數(shù)高度顯著，p＜0.0001，說(shuō)明接種量對(duì)發(fā)酵乳的滴定酸度有高度顯著作用。B 的回歸系數(shù)僅次于C，說(shuō)明低聚果糖的添加量對(duì)發(fā)酵乳的滴定酸度的影響僅次于發(fā)酵劑接種量。具體響應(yīng)曲面如圖4 所示。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

使用Design-Expert 8.0.6 軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)后，預(yù)測(cè)發(fā)酵乳的最佳工藝條件為：菌種復(fù)配比（凝結(jié)芽孢桿菌：傳統(tǒng)發(fā)酵劑（A）3.22:1、低聚果糖添加量（B）1.56%、接種量（C）1.315%，理論滴定酸度值為93.25?？紤]實(shí)驗(yàn)實(shí)際情況，對(duì)發(fā)酵工藝參數(shù)調(diào)整為：菌種復(fù)配比（凝結(jié)芽孢桿菌：傳統(tǒng)發(fā)酵劑）（A）3:1、低聚果糖添加量（B）1.50%、接種量（C）1.50%。進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測(cè)值，在最佳發(fā)酵工藝參數(shù)下，多次進(jìn)行平行試驗(yàn)，測(cè)定發(fā)酵乳的平均滴定酸度值為90.59，與模型預(yù)測(cè)酸度值（93.25）擬和率達(dá)97.15%，說(shuō)明該模型可行性較高。

3 結(jié)論

將凝結(jié)芽孢桿菌13002 用于發(fā)酵乳的發(fā)酵，通過(guò)單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)確定了最優(yōu)發(fā)酵工藝為：菌種復(fù)配比（凝結(jié)芽孢桿菌:傳統(tǒng)發(fā)酵劑，即BCS:SL）3:1、低聚果糖添加量1.50%、接種量1.50%、總接種量1.00×109CFU/100 mL、43 ℃發(fā)酵4 h后4 ℃發(fā)酵12 h，并驗(yàn)證預(yù)測(cè)值，在最佳發(fā)酵工藝參數(shù)下，進(jìn)行三次平行試驗(yàn)，與預(yù)測(cè)值擬和率達(dá)97.15%，模型具有較高的可行性，為定制發(fā)酵劑的制備提供了新的可能性。