吡喃花色苷結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)研究進展

曾穎鈺，郭大三，李旭升，蔡冬寶，孫建霞，白衛(wèi)濱,*

（1.暨南大學理工學院，廣東 廣州 510632；2.廣東工業(yè)大學輕工化工學院，廣東 廣州 510090）

花色苷是廣泛分布在多種植物中的一大類天然色素的總稱，屬于黃酮類物質(zhì)，具有C-C-C的碳骨架結(jié)構(gòu)?；ㄉ帐侵参锬艹尸F(xiàn)紅色、紫色、藍色甚至橙色等鮮艷顏色的重要原因之一。隨著人們認識的不斷深入，花色苷不僅可以成為合成著色劑的天然替代品，還因擁有豐富的生物活性，在新型功能食品、新型化妝品與制藥工業(yè)中被廣泛應用。然而花色苷本身很不穩(wěn)定，極易發(fā)生降解，其穩(wěn)定性受到自身結(jié)構(gòu)、pH值、溫度、光照、氧氣、酶、溶劑、金屬離子、蛋白質(zhì)及類黃酮等諸多因素的影響。因此，為了進一步實現(xiàn)花色苷在復雜條件下的穩(wěn)定應用，研究者們提出了兩種主要的改進策略。一方面，研究者嘗試將花色苷包埋在更加穩(wěn)定的體系內(nèi)，通過乳化或凝膠化進行封裝，如以油包水（W/O）的形式形成微膠囊來實現(xiàn)花色苷在體系內(nèi)的穩(wěn)定存在；另一方面，研究者嘗試以母體花色苷的結(jié)構(gòu)作為出發(fā)點，通過結(jié)構(gòu)修飾、生物工程技術(shù)等方法開發(fā)穩(wěn)定性更好、生物活性更優(yōu)的花色苷衍生物。而相比于結(jié)構(gòu)修飾，包埋技術(shù)的實現(xiàn)更加困難，壁材負載能力不足、包裝技術(shù)復雜和包封步驟繁瑣等缺陷都是包埋技術(shù)不可避免的局限性。相比之下，花色苷的結(jié)構(gòu)修飾已取得了很多成功的范例，其中吡喃花色苷是花色苷結(jié)構(gòu)修飾研究中最深入的一類物質(zhì)。

自1997年首次在陳釀紅酒中檢測出吡喃花色苷后，吡喃花色苷得到了越來越多的關注。吡喃花色苷一般是指在花色苷的結(jié)構(gòu)基礎上在C4 位與C5 位間額外形成一個吡喃環(huán)的新型花色苷衍生物。與原型花色苷相比，吡喃花色苷不僅具備更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，在對體系顏色的組成中也有令人意外的貢獻。吡喃花色苷的發(fā)現(xiàn)對于克服花色苷穩(wěn)定性差、生物利用度低等應用中的不足之處有重要意義。本文就目前已報道的吡喃花色苷的結(jié)構(gòu)特征與穩(wěn)定性進行了綜述，旨在為未來吡喃花色苷的綜合應用提供參考。

1 花色苷及其衍生物的研究現(xiàn)狀

1.1 花色苷

1.1.1 花色苷的主要來源

花色苷作為一種水溶性色素主要存在于維管束植物的花、果實、莖、葉等器官的細胞液中。根據(jù)統(tǒng)計，包括27個科、73個屬在內(nèi)的數(shù)萬種植物都含有花色苷，例如藍莓、紅葡萄、草莓、覆盆子、樹莓、血橙、三華李等有色水果以及大部分顏色鮮艷的花卉和有色谷物等。不同植物中的花色苷存在一定的種類和含量差異，從結(jié)構(gòu)上看，花色苷是將花青素母環(huán)和糖苷配基以糖苷鍵交聯(lián)而形成的化合物，具有典型的C-C-C的碳骨架結(jié)構(gòu)?；ㄉ罩g的差異主要來源于A環(huán)和B環(huán)上取代基種類、數(shù)目及其位置的不同與C環(huán)糖苷配基的不同，僅從植物中分離得到的天然花色苷已超過700種，其中主要有6大類最常見的花色苷，基本結(jié)構(gòu)和特征分別如圖1和表1所示。人體每日會攝入大量的花色苷，食物中的花色苷主要來源于水果、蔬菜或果酒。西方國家中花色苷的人均日攝入量最高可達到64.9 mg/d；美國人均花色苷日攝入量約12.5 mg；荷蘭人均花色苷日攝入量則可達近20 mg；就普遍而言，男性的花色苷平均日攝入量較女性高。

圖1 花色苷的基本結(jié)構(gòu)[7-8]Fig. 1 General structure of anthocyanins[7-8]

表1 常見花色苷取代基、成色特征與相對含量[9-10]Table 1 Substituents, chromatic characteristics and relative contents of common anthocyanins[9-10]

在上述6種花色苷中，不含甲基的3種花色苷（Pg、Cy和Dp）的糖苷衍生物是自然界中最多被發(fā)現(xiàn)的花色苷，其中又以矢車菊色素-3-葡萄糖苷（cyanidin-3-glucoside，Cy-3-glu）最為常見。

1.1.2 花色苷的生物活性與其他應用

花色苷作為黃酮類物質(zhì)，具備一系列獨特的對人體健康有益的生理活性，在功能食品及膳食補充劑等營養(yǎng)保健領域有廣泛的前景。根據(jù)目前的研究，花色苷對人體的健康功效主要包括抗氧化、抗炎癥、預防心血管疾病并減少血栓形成、控制肥胖、預防早期2型糖尿病、修復非酒精性脂肪肝損傷，改善重金屬離子帶來的生殖損傷以及紫外線造成的皮膚損傷等。此外，制藥和化妝品行業(yè)也正在將花色苷開發(fā)為功能因子或著色劑等。目前消費者對合成色素潛在不良影響的憂慮逐漸增加，花色苷正是一些合成色素的天然替代品，并在多個國家被批準作為食品著色劑來使用。如歐盟法規(guī)認可包括葡萄皮、黑加侖、漿果等多種提取來源的花色苷。然而，花色苷在體內(nèi)的生物利用度卻相對不足。這可能是由于花色苷脂溶性不足導致其不易通過細胞的磷脂雙分子層，也可能是由于花色苷在抵達靶向位點前在消化道內(nèi)就已被腸道微生物降解，從而無法達到靶向作用位點被機體充分利用。

1.1.3 花色苷的理化特性

花色苷對pH值極其敏感，在不同的pH值下，花色苷的顏色特征會發(fā)生很大差異。如表2所示，當水溶液pH值在2以下時，花色苷主要以烊鹽離子的形式存在并表現(xiàn)紅色，當pH值在弱酸性范圍時，花色苷以無色的甲醇假堿或半縮醛形式存在，水溶液逐漸接近中性時，花色苷去質(zhì)子化為醌式堿，還可能開環(huán)成查耳酮的形式。查耳酮不穩(wěn)定，會進一步裂解成酚醛或酚酸。pH值繼續(xù)升高時，花色苷逐漸變?yōu)樽仙闹行怎綁A及藍色的離子化醌式堿。Sui Xiaonan等發(fā)現(xiàn)隨著pH值的增加，花色苷在水溶液中的降解速率也會變得越來越大，此外，當pH值上升至5～6，6種常見花色苷（Pg、Cy、Dp、Pn、Pt與Mv）的穩(wěn)定性較酸性條件急劇下降，中性條件下展現(xiàn)出最差的穩(wěn)定性。

除此以外，溫度的升高也會加快花色苷的降解，一般來講熱處理下花色苷降解符合一級反應動力學，加熱時間的延長與加熱溫度的提高都會顯著影響花色苷的色澤、含量與抗氧化活性。Sui Xiaonan等還發(fā)現(xiàn)pH值與溫度對花色苷的降解具有協(xié)同效應。此外，花色苷的穩(wěn)定性還會受到氧氣、酶、光照等其他環(huán)境因素的影響。

表2 花色苷在不同pH值下水溶液中的存在形式與平衡[20]Table 2 Existing forms and equilibrium of anthocyanins in aqueous solution under varying pH[20]

盡管花色苷有很大的開發(fā)潛力，但其結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性與很低的脂溶性為其利用帶來了諸多挑戰(zhàn)。在實際的食品加工與貯存中，花色苷從植物中分離后穩(wěn)定性差、顏色不穩(wěn)固、加工分解等問題為其利用帶來了很多阻礙。如何提高花色苷在食品加工過程中的穩(wěn)定性是學界的一大難題。而對花色苷進行結(jié)構(gòu)修飾或形成吡喃花色苷可以在一定程度對其穩(wěn)定性進行改善。

1.2 花色苷結(jié)構(gòu)修飾

1.2.1 花色苷?；?/p>

花色苷易于修飾，環(huán)取代基的種類（如糖苷、?；鶊F等）和數(shù)目差異是影響其結(jié)構(gòu)特征的主要因素。大量研究指出花色苷C3位點的糖苷具有較強的反應活性，小分子有機酸在此處可與花色苷的糖苷分子進一步形成?；Y(jié)構(gòu)，如羥基肉桂酸類化合物、乙酸、草酸、丙二酸和琥珀酸等都能參與花色苷的?；Ｔ诩t酒的發(fā)酵或陳釀過程中，花色苷還會進一步演變，通過環(huán)化反應、加成反應或聚合反應等步驟形成更加復雜、顏色不同的其他花色苷。

理論上花色苷糖苷鍵所連接的糖基在特定條件下都能發(fā)生酰化反應。一般來說，花色苷?；侵富ㄉ仗腔系牧u基被各類有機酸部分或全部酰基化的現(xiàn)象?；ㄉ挣；蠓肿淤|(zhì)量增大，同時羥基連接了極性更低的有機酸使總體結(jié)構(gòu)碳鏈長度增加，導致整體的極性和水溶性隨之下降，脂溶性得到提升。?；旧淼男再|(zhì)也會對花色苷產(chǎn)生額外影響，例如芳香族?；鶊F會對花色苷產(chǎn)生額外空間位阻和π-π共軛帶來的分子內(nèi)輔色效應，從而降低溶液中可能對花色苷造成損失的離子的空間位阻，使花色苷的穩(wěn)定性得到提升。

與未?；幕ㄉ障啾?，大部分?；ㄉ詹粌H穩(wěn)定性更高，生物活性也會更強。Luo Chunli等從紫甘薯中篩選出的4種單體?；ㄉ湛捎行ПＷoHepG2和DU145細胞免受HO誘導的氧化應激，且分離出的?；ㄉ毡茸细适碇衅渌ㄉ栈衔锬芨行У乇Ｗo細胞。同時，?；ㄉ湛赡苡懈叩纳锢枚龋琌liveria等利用了MKN-28胃細胞和Caco-2腸細胞模擬了紫薯中的?；ㄉ赵谖改c道內(nèi)的消化過程，發(fā)現(xiàn)酰化花色苷在胃腸消化中的降解水平更低，且?；ㄉ赵隗w內(nèi)的吸收特性與普通花色苷類似。

1.2.2 花色苷酯基化

花色苷酯基化與?；蓄愃频臋C理，但反應底物主要為丁二酸酐或脂肪酸等疏水性化合物。酯基化與?；啾?，在加強其脂溶性的同時還提升花色苷的pH值穩(wěn)定性。Guimaraes等采取酶促合成法分別將Cy-3-glu與C、C、C、C、C這5種碳鏈長度的脂肪酸在南極假絲酵母脂肪酶B（lipase B，CalB）催化下進行了合成，酯化產(chǎn)物的pH值穩(wěn)定性與脂溶性都得到較大提升。但由于疏水基團數(shù)量的增加，花色苷的酯化產(chǎn)物的羥基往往不能有效地發(fā)揮出原有的自由基清除效果；Cruz等用錦葵色素-3-葡萄糖苷（malvidin-3-glucoside，Mv-3-glu）與硬脂酰氯在無水乙腈中進行反應，成功合成了Mv-3-glu的硬脂酸衍生物，經(jīng)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)新合成的化合物盡管脂溶性增加，但對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除能力和總還原力均不如前體花色苷。

盡管花色苷形成?；蝓セ衔锬茉鰪娖浞€(wěn)定性、脂溶性，但此類方法依然存在較多的局限性?；ㄉ挣；霓D(zhuǎn)化率較低，而且除酶法合成外的人工合成方法普遍選擇性差，難以得到預期的理想產(chǎn)物。因此花色苷酰化目前還不是花色苷改性的最佳策略。

1.2.3 花色苷形成吡喃花色苷衍生物

吡喃類物質(zhì)是指含有一個氧雜原子的六元雜環(huán)化合物，而吡喃花色苷，即在花色苷母環(huán)的基礎上，在花色苷C4和C5位上的羥基之間額外形成一吡喃D環(huán)化合物，其基本結(jié)構(gòu)如圖2所示。

圖2 吡喃花色苷基本結(jié)構(gòu)Fig. 2 General structure of pyranoanthocyanins

吡喃花色苷最先發(fā)現(xiàn)于對紅葡萄酒的研究中。雖然人們很早就發(fā)現(xiàn)了紅酒中的花色苷，但對紅酒陳化過程中顏色變化的原因卻鮮有研究。直到1996年，研究人員首次提出紅酒在從新制到陳釀過程中的色澤變化可能是陳釀過程中合成了新的色素造成的，并成功將紅酒微濾后的膜上物質(zhì)通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分離得到了兩種全新的橙黃色花色苷衍生物。后續(xù)經(jīng)進一步的探索，得出此類物質(zhì)是由Mv-3-glu與乙烯基苯酚化合而成的。除了葡萄酒外，在血橙、黑加侖、洋蔥與黑胡蘿卜汁中也檢測到了吡喃花色苷的存在。吡喃花色苷家族的發(fā)現(xiàn)大大拓展了花色苷的應用潛能，下面將具體敘述吡喃花色苷的基本性質(zhì)。

2 吡喃花色苷的結(jié)構(gòu)、色澤特征與活性

吡喃花色苷在新制紅酒中含量很少，但在陳釀紅酒中卻能大量檢出。事實上，吡喃花色苷是紅酒中游離態(tài)的前體花色苷與紅酒中其他小分子緩慢化合而成的。在紅酒的發(fā)酵過程中，酵母的次級代謝產(chǎn)物如丙酮酸、乙酰乙酸、乙醛等物質(zhì)都能與花色苷環(huán)化生成新環(huán)。除此以外，花色苷也能通過與咖啡酸、芥子酸、阿魏酸等酚酸反應形成對應的吡喃花色苷。同時，隨著陳釀時間的延長，已經(jīng)生成新環(huán)的吡喃花色苷還能繼續(xù)結(jié)合有機小分子生成更復雜的吡喃花色苷（如吡喃花色苷二聚體及乙烯基黃烷醇吡喃花色苷）。根據(jù)花色苷結(jié)合時期的不同，又可以將吡喃花色苷分為第一代吡喃花色苷（發(fā)酵前期以花色苷為前體物質(zhì)生成）與第二代吡喃花色苷（發(fā)酵后期以Vitisin A型吡喃花色苷為前體物質(zhì)生成）。幾種常見的吡喃花色苷名稱、反應底物與顏色如表3所示。

表3 常見吡喃花色苷類型、反應底物與顏色[33]Table 3 Classification, reaction substrates and chromatic properties of common pyranoanthocyanins[33]

在感官特征方面，吡喃花色苷與花色苷有著較大差異。在色澤方面，吡喃花色苷的成色性質(zhì)對陳化葡萄酒的顏色有重要影響，在弱酸性的pH值范圍內(nèi)，由于新生成了吡喃D環(huán)，吡喃花色苷能免受親核攻擊，從而表現(xiàn)出更穩(wěn)定的色澤，也有學者認為吡喃花色苷這種優(yōu)秀的顏色穩(wěn)定性是因為分子內(nèi)輔色效應。除此之外，就口感方面而言，吡喃花色苷的形成也會影響紅酒的口感，這緣于吡喃花色苷在合成過程中會逐漸消耗紅酒中的單寧從而軟化紅酒并減少紅酒的苦味和澀味。

2.1 第一代吡喃花色苷

2.1.1 Vitisin型與甲基型吡喃花色苷

Vitisin型吡喃花色苷是人們最早發(fā)現(xiàn)、研究最為廣泛的一類吡喃花色苷。Bakker等最先發(fā)現(xiàn)Vitisin A在陳釀紅酒與長期貯藏的葡萄皮中均有存在，并驗證了Vitisin A的結(jié)構(gòu)以Mv-3-glu為核心，并附有一個帶酮基和羥基乙烯基的吡喃環(huán)。后續(xù)研究人員也通過模擬葡萄酒陳釀鑒定出其他幾種Vitisin型吡喃花色苷并得到結(jié)論，Vitisin型吡喃花色苷以花色苷作為反應原型，再通過以乙醛為基本單元的醛類化合物發(fā)生環(huán)加成反應后形成。其中Vitisin B結(jié)構(gòu)最為簡單，是花色苷與乙醛的反應產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)上相比原型僅多了一個吡喃D環(huán)。Vitisin A花色苷與丙酮酸的反應產(chǎn)物在Vitisin B的基礎上在C10位增加了一個羧基。甲基吡喃花色苷則是花色苷原型與乙酰乙酸的反應產(chǎn)物。以Vitisin A的形成為例，在一定的酸性條件下，酮基發(fā)生烯醇化，隨后具有電負性的甲基與花色苷的C4位（具正電性）加成縮合，再經(jīng)脫水和氧化形成另外的一個吡喃環(huán)。三者的反應機理如圖3所示。

圖3 Vitisin型吡喃花色苷與甲基吡喃花色苷的形成過程[36]Fig. 3 Formation process of vitisin-type pyranoanthocyanins and methyl-pyranoanthocyanin[36]

值得注意的是，兩種Vitisin型花色苷在與水的反應上存在性質(zhì)差異，Vitisin B不會發(fā)生水和反應，而Vitisin A則會與水分子結(jié)合轉(zhuǎn)為其他形態(tài)。另外，經(jīng)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)極酸條件下無法檢測到Vitisin B的典型離子峰（/517），除了糖苷配基的信號（/355）外還在/259處觀察到一種雙電荷離子，證實了Vitisin B是雙電荷化合物，因此可以發(fā)生3級解離。Oliveria等通過紫外-可見光光譜與核磁共振光譜測定了Vitisin B的離子平衡常數(shù)，得到p＜0.68、p＝4.40、p＝7.45。而Vitisin A在水溶液中的結(jié)構(gòu)與水合反應有關。Asenstorfer等通過測定Vitisin A的p與p發(fā)現(xiàn)，其在葡萄酒中存在形態(tài)多樣，以水合、非水合以及部分電離等形態(tài)混合共存，最主要的形態(tài)為醌式堿，并且在不同的pH值下C2與C5位存在水合競爭。

根據(jù)質(zhì)譜信息，由Mv-3-glu合成的甲基吡喃花色苷的離子峰為/531，碎片離子峰為/369。雖然在結(jié)構(gòu)上甲基吡喃花色苷與Vitisin型吡喃花色苷相比只是在C10位多一個甲基，但在顏色表現(xiàn)上更加不同。甲基吡喃花色苷和Vitisin型吡喃花色苷一樣，最大吸收波長相比原型花色苷均發(fā)生了藍移，Vitisin A和Vitisin B在葡萄酒pH值下最大吸收波長分別為498 nm和490 nm，甲基吡喃花色苷的藍移較之而言更加明顯，最大吸收波長降低至478 nm，并展現(xiàn)出更強的黃色。此外，Oliveria等在研究甲基吡喃花色苷在水溶液中的存在形式時發(fā)現(xiàn)了4種可能形態(tài)，其中完全未質(zhì)子化的甲基吡喃花色苷在堿性條件下會逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樾陆Y(jié)構(gòu)（圖4）。該新化合物形成后不可恢復為原結(jié)構(gòu)，最大吸收波長在355 nm，于堿性環(huán)境中呈現(xiàn)黃色。

圖4 甲基吡喃花色苷在堿性條件下結(jié)構(gòu)變化假設[40]Fig. 4 Hypothetic formation mechanism of syringetin-3-glucoside from methylpyranomalvidin-3-O-glucoside in alkaline conditions[40]

2.1.2 乙烯基黃烷醇型吡喃花色苷

黃烷醇類物質(zhì)同樣是葡萄酒中常見的酚類化合物，在葡萄酒陳化的過程中花色苷也會與某些黃烷醇類物質(zhì)反應生成吡喃花色苷。最早在1997年，F(xiàn)rancia-Aricha等通過模型實驗發(fā)現(xiàn)在乙醛介導下Mv-3-glu會與黃烷-3-醇（(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素、原花青素B）發(fā)生反應生成新的色素，后來研究人員統(tǒng)一將花色苷在乙烯橋聯(lián)下與黃烷醇類物質(zhì)的反應產(chǎn)物定義為乙烯基黃烷醇吡喃花色苷。乙烯基黃烷醇吡喃花色苷的形成過程與葡萄酒中的乙醛密切相關，現(xiàn)有的研究指出可能的合成機制為在花色苷C4位與C5位羥基和8-乙烯基黃烷醇的乙烯基之間發(fā)生了環(huán)化加成反應。但8-乙烯基黃烷醇并不直接存在于葡萄酒內(nèi)，這可能是由葡萄酒內(nèi)游離黃烷醇與乙醛反應生成的加合物經(jīng)脫水反應或葡萄酒內(nèi)乙基黃烷醇經(jīng)裂解反應生成的。乙烯基黃烷醇型吡喃花色苷形成過程如圖5所示。

圖5 乙烯基黃烷醇吡喃花色苷形成過程（以8-乙烯基兒茶素為例）[42]Fig. 5 Formation process of vinylflavanol-pyranoanthocyanins(exemplified by 8-vinylcatechim)[42]

與Vitisin型吡喃花色苷類似，乙烯基黃烷醇吡喃花色苷在光譜性質(zhì)上與原型花色苷相比最大吸收波長也發(fā)生了藍移，會呈現(xiàn)出偏橙紅色的狀態(tài)。同樣，黃烷醇吡喃花色苷較花色苷具有更強的顏色穩(wěn)定性。He Jingren等以兒茶素吡喃花色苷、表兒茶素吡喃花色苷及兒茶素二聚體吡喃花色苷為例探索了黃烷醇吡喃花色苷的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，不同于花色苷在中低pH值條件下的顏色表現(xiàn)規(guī)律，黃烷醇吡喃花色苷在中等酸性至強酸性的條件下都具有很高的顏色強度，并在pH 3.6條件下達到最大值。此外，有學者通過計算機模型和分子力學確定對于黃烷醇吡喃花色苷而言能量最低的構(gòu)象，結(jié)果表明這時結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出封閉的“籠型”，這有利于吡喃花色苷中的吡喃鎓生色團與兒茶素的吡喃環(huán)之間重疊并發(fā)生相互作用。上述研究說明黃烷醇吡喃花色苷良好的顏色穩(wěn)定性基于其結(jié)構(gòu)中具有不同的共面部分，其能產(chǎn)生較強的分子內(nèi)輔色效應，從而具備抑制水合物生成的能力。

2.1.3 酚基吡喃花色苷

在吡喃花色苷的研究中，Cameira-Dos-Santos等在對葡萄酒進行交叉微濾實驗時檢測到一種新型的橙黃色色素，且可見吸收光譜也發(fā)生了藍移。經(jīng)初步推測該橙黃色色素是Mv-3-glu和3-對香豆酰葡萄糖苷分別與葡萄酒中的非黃烷醇成分縮合而產(chǎn)生的，也是最早發(fā)現(xiàn)的花色苷衍生物質(zhì)之一。后續(xù)的研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了4-乙烯基鄰苯二酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚和4-乙烯基丁香酚與Mv-3-glu的結(jié)合產(chǎn)物。同樣的，紅酒中的羥基肉桂酸類物質(zhì)也能與Mv-3-glu反應生成對應的酚基吡喃花色苷。Schwarz等推測了酚酸與花色苷可能的反應機制，在以咖啡酸為底物的模型實驗中發(fā)現(xiàn)，Mv-3-glu可以直接與咖啡酸反應生成新的色素，并將咖啡酸與Mv-3-glu反應生成的吡喃花色苷命名為Pinotin A。經(jīng)驗證，其他羥基肉桂酸類物質(zhì)可以直接與花色苷原料反應生成酚基吡喃花色苷。酚基吡喃花色苷反應機理見圖6。

圖6 酚基吡喃花色苷形成過程（以咖啡酸與Mv-3-glu合成Piontin A為例）[45]Fig. 6 Formation process of hydroxyphenol-pyranoanthocyanins(exemplified by synthesis of piontin A with caffeic acid and Mv-3-glu)[45]

花色苷結(jié)構(gòu)中的C4位與咖啡酸C2位初始化學鍵的形成與苯并吡喃單元的強親電性和咖啡酸-C的親核性密切相關?？紤]到中間體電子不足，由于中間體碳正離子的穩(wěn)定性，可以認為肉桂酸部分芳香環(huán)上的供電基團加速了反應。接著中間體的碳鎓離子可以與羥基結(jié)合而形成新的吡喃環(huán)。最后經(jīng)過氧化脫羧可以形成最終產(chǎn)物Pinotin A。根據(jù)這種形成假設可以推測，只有苯環(huán)上帶有供電基的羥基肉桂酸（如香豆酸、阿魏酸、咖啡酸及芥子酸等）才能與花色苷形成酚基吡喃花色苷。值得注意的是，Pinotin A在葡萄酒內(nèi)的含量變化與其他成分不同，在貯存最開始的1～2 年內(nèi)Pinotin A的含量很少，之后隨著存放時間的延長，大部分第一代吡喃花色苷的含量會逐漸降低，但Pinotin A卻表現(xiàn)出相反的趨勢，存放4～6 年以上后其含量會大幅增加，這在目前還尚無較合理的解釋。

2.2 第二代吡喃花色苷

2.2.1 Portisin型吡喃花色苷

第一代吡喃花色苷是紅酒內(nèi)花色苷母體與紅酒陳化時生成的酵母代謝產(chǎn)物、乙烯基黃烷醇或葡萄皮中本身存在的小分子酚酸化合物等物質(zhì)反應而成的。隨著紅酒內(nèi)吡喃花色苷轉(zhuǎn)化的進行，一些結(jié)構(gòu)簡單的吡喃花色苷會成為具有更加復雜結(jié)構(gòu)的吡喃花色苷的前體物質(zhì)。人們將這類由小分子化合物和第一代吡喃花色苷進一步反應所得的衍生物定義為第二代吡喃花色苷。繼Vitisin A型吡喃花色苷被世人發(fā)現(xiàn)后，Mateus等首次在紅酒中檢測出了兩種藍色色素，其最大吸收波長相比Mv-3-glu發(fā)生了紅移，達到575 nm，同時質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示兩種色素分別在/1 119處和/1 265處產(chǎn)生[M]離子，與此同時，前者產(chǎn)生的3個碎片離子峰分別對應兒茶素單元、糖苷殘基和兩者的結(jié)合物；后者產(chǎn)生的一個碎片離子峰對應香豆酰葡萄糖苷殘基。以上結(jié)果都說明這類新型色素是Vitisin A與乙烯基黃烷醇的合成產(chǎn)物。這種合成的過程可由以下假設推斷：一方面反應物Vitisin A先在紅酒中較多生成，另一方面乙烯基黃烷醇可能源于乙醛誘導下低聚乙基黃烷醇的聚合，或黃烷醇乙醇化合物的脫水，也可能源于乙基黃烷醇花色苷的裂解。新生成的乙烯基會與Vitisin A的C10位發(fā)生反應，最后經(jīng)過氧化去除甲酸可以得到Vitisin A-乙烯-黃烷醇化合物（Portisin A）（圖7）。從Portisin A的結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)，π電子的拓展共軛會賦予Portisin A更高的穩(wěn)定性，這也能在一定程度上解釋其呈現(xiàn)出藍色的原因。

圖7 Portisin A型吡喃花色苷形成過程[47]Fig. 7 Formation process of vinylflavanol-pyranoanthocyanins (portisin A)[47]

除了Portisin A外，研究人員在陳釀的Port酒中還發(fā)現(xiàn)了另一類以Vitisin A為基礎的第二代吡喃花色苷——吡喃花色苷-乙烯基-羥基肉桂酸類物質(zhì)（Portisin B）。Oliveria等在分餾后的Port酒內(nèi)通過HPLC檢測到了幾種以羥基肉桂酸為基礎的與Vitisin A結(jié)合而成的化合物。相比于Vitisin A，其最大吸收波長發(fā)生了紅移，達到了約540 nm?？赡艿男纬蓹C制如圖8所示，即羥基肉桂酸的碳碳雙鍵可以對Vitisin A具有親電性質(zhì)的C10部位發(fā)生親核攻擊，再脫去甲酸，氧化后便得到Portisin B。

圖8 Portisin B型吡喃花色苷形成過程[51]Fig. 8 Formation process of vinylpyranoanthocyanins (portisin B)[51]

雖然兩種Portisin型吡喃花色苷相較于原型花色苷均發(fā)生了紅移，但研究表明Portisin B具有獨特的顏色性質(zhì)，在-10 ℃至室溫的變化下其顏色會發(fā)生藍色至紅色的轉(zhuǎn)變。這可能是電子振動所引發(fā)可逆的物理化學效應造成的。假定正常狀態(tài)下振動頻率不變，雖然隨著溫度的降低，振動能量的平均值也會下降，但相變會產(chǎn)生更復雜的狀態(tài)。低溫下更有序的結(jié)晶排列可能會加強水與可溶性羥基的相互作用，從而導致與Θ和Γ扭轉(zhuǎn)狀態(tài)相關的振動頻率增加。因此溫度下降帶來的振動能量下降可以由振動頻率的增加來克服，從而在基態(tài)能量上表現(xiàn)出增加的趨勢。這種能量變化趨勢是與顏色變化趨勢相符合的。而目前尚無研究證實Portisin A是否具有類似的性質(zhì)。

近年來最新的研究表明，Vitisin A與羥基肉桂酸的氨基衍生物（二甲基-氨基肉桂酸）也能合成結(jié)構(gòu)類似于Portisin B的吡喃花色苷。其最大吸收波長約在638 nm，這種結(jié)構(gòu)因為具有更廣泛的π電子離域所以表現(xiàn)出強烈的藍色。另外，據(jù)Oliveria等報道，羥基肉桂酸與甲基吡喃花色苷也能合成類似Portisin B型的吡喃花色苷，但酚基基團與甲基吡喃花色苷并不通過乙烯基連接，而是通過丁二烯基結(jié)合在一起。因此此類合成物又被稱為丁二烯基橋聯(lián)的吡喃花色苷。其合成機制可能涉及電荷轉(zhuǎn)移復合物的形成，但具體機理尚不明確。

2.2.2 Oxovitisin型吡喃花色苷

Vitisin A型吡喃花色苷除了能與乙烯基黃烷醇及乙烯基羥基肉桂酸反應外，其自身也能發(fā)生氧化反應生成新的酮型吡喃花色苷（Oxovitisin）。He Jingren等在陳釀的Port酒中分離得到一種橙黃色的色素，其最大吸收波長僅為373 nm，另外其質(zhì)譜數(shù)據(jù)表明該色素的糖苷配基質(zhì)量比Vitisin B型吡喃花色苷大15 amu。表明新型色素在結(jié)構(gòu)上與Vitisin B類似，但在原吡喃環(huán)上由一個氧原子取代了原先的氫原子。后續(xù)經(jīng)過模型實驗得到驗證，此類色素是Vitisin A的環(huán)氧化產(chǎn)物，其反應機理如圖9所示。

圖9 酮型吡喃花色苷形成過程[52]Fig. 9 Formation process of pyranone-anthocyanins (oxovitisins)[52]

考慮到Vitisin A的親電特性，溶液中的水分子會對Vitisin A具備親電性質(zhì)的C10位點產(chǎn)生親核進攻，從而使得半縮醛生成。該中間體在溫和條件下脫羧，并將半縮醛的羥基進一步氧化成吡喃-2-酮，最后形成終產(chǎn)物Oxovitisins。另外，位置帶有羥基陰離子取代基的吡喃陽離子不是兩性離子芳族化合物，而是中性不飽和內(nèi)酯或-吡喃酮，這與C10位羰基氧化的機制是一致的。

2.2.3 吡喃花色苷二聚體

近年來，研究人員還在陳釀的Port酒酒渣中檢測到了一種新型的藍綠色花色苷衍生物。根據(jù)取代糖基的不同，該色素的最大吸收波長約在730～680 nm之間。研究人員通過模型實驗證明新型花色苷衍生物是甲基吡喃花色苷與Vitisin A化合而成的，可能的反應機理如圖10所示。

圖10 吡喃花色苷二聚體形成過程[53]Fig. 10 Formation process of pyranoanthocyanin dimers[53]

在葡萄酒的自然pH值下，甲基吡喃花色苷的甲基可能會發(fā)生去質(zhì)子化從而在C10位形成亞甲基，接著亞甲基的雙鍵結(jié)構(gòu)可能會對Vitisin A親電的C10位點發(fā)生親核進攻，從而生成由亞甲基連接的雙吡喃花色苷中間體。經(jīng)過后續(xù)的氧化脫去一分子甲酸就得到了呈現(xiàn)藍綠色的吡喃花色苷二聚體。也有學者認為吡喃花色苷二聚體的合成途徑是兩種前體物質(zhì)通過芳香環(huán)的π電子云相互作用形成了電荷轉(zhuǎn)移復合物，之后再經(jīng)過自由基反應或離子反應進一步縮合，脫去甲酸后形成終產(chǎn)物。由于吡喃花色苷二聚體主要在酒渣中發(fā)現(xiàn)，可知其在葡萄酒中溶解度低于其他類別的花色苷及其衍生物，這可能是分子質(zhì)量的增加引起原分子的極性下降所致。

2.3 吡喃花色苷的生物活性

相比普通花色苷，吡喃花色苷在生物活性上也更具優(yōu)勢。Oliveria等比較了Mv-3-glu與幾種吡喃花色苷衍生物的生物活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Oxovitisin相較與原型花色苷具有更好的抑制乳腺癌細胞MCF-7的能力和細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運效率。但Vitisin A型吡喃花色苷的抗癌活性與細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運效率實際表現(xiàn)卻不如Mv-3-glu。因此，不同類型的吡喃花色苷在生物活性方面也存在差異。Zhu Zhenzhou等發(fā)現(xiàn)甲基吡喃花色苷不僅在毒理學評價上與花色苷類似，能安全使用，同時還具有卓越的應對HO誘導的MRC-5細胞損傷的保護作用，可將HO誘導細胞損傷后的細胞活力由56%增加至75%。羅海霞通過對合成的甲基吡喃花色苷、Vitisin A、Pinotin A、Mv-3-glu-4-乙烯基苯酚、Mv-3-glu-4-乙烯基愈創(chuàng)木酚和Mv-3-glu-4-乙烯基丁香醇共6種吡喃花色苷的抗氧化能力實驗，證實吡喃花色苷相較于Mv-3-glu，具備更為突出的2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸陽離子自由基清除能力。就DPPH自由基清除能力而言，除甲基吡喃花色苷與Mv-3-glu并未具有顯著性差異外，其他5種吡喃花色苷的清除能力都顯著優(yōu)勝于Mv-3-glu。Peng You等對鹿角漆樹的粗提物進行了抗炎活性的研究，結(jié)果表明粗提物中的多酚類物質(zhì)，尤其是吡喃花色苷，可以通過抑制Caco-2細胞中由腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α誘導產(chǎn)生的白細胞介素-8從而降低炎癥活性。此外，本課題組最近研究發(fā)現(xiàn)，Vitisin A對細胞膽固醇具有代謝調(diào)控的作用，能夠顯著抑制膽固醇的合成，清除血液中的低密度脂蛋白膽固醇，從而對維持體內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)具有生物學意義。雖然吡喃花色苷的研究還處在起步階段，且在吸收代謝方面還尚處空白，但已有的研究成果表明吡喃花色苷在花色苷改性上有較大潛力，在食品添加劑乃至醫(yī)藥方面都有潛在的應用前景。

3 展 望

盡管較之于原型花色苷，吡喃花色苷在穩(wěn)定性、生物活性和對釀酒風味的影響等方面都具有一定的優(yōu)勢，但到目前為止，對吡喃花色苷的認識仍舊有待深入。

3.1 吡喃花色苷的制備

吡喃花色苷形成周期比較長，這無論對于開展任何相關方面的研究來說，都是亟需解決的一個難題。以葡萄酒為例，若希望葡萄酒中的吡喃花色苷能形成較為理想又穩(wěn)定的顏色，少則幾個月，多則可達幾年。陳欣然通過對不同年份產(chǎn)的美樂葡萄酒進行花色苷類含量測定，發(fā)現(xiàn)2014年與2017年的酒中總吡喃型花色苷質(zhì)量濃度分別為13.71 mg/L與21.69 mg/L，總花色苷質(zhì)量濃度分別為196.06 mg/L和389.22 mg/L。根據(jù)數(shù)據(jù)對比可直觀反映出吡喃花色苷生成速率很慢，并遠遠低于花色苷原料的衰減速度，生產(chǎn)效率低、周期過長、耗費的時間成本大，這對于生產(chǎn)和研究而言難以被接受。

研究人員也嘗試了不同手段，希望加速吡喃花色苷的生成。Straathof等利用咖啡酸參與酚基吡喃花色苷的合成，同時輔以高溫處理，結(jié)果證實熱處理對于加速吡喃花色苷生成的確有效。其中，經(jīng)75 ℃處理24 h后，吡喃花色苷的轉(zhuǎn)化率可達90%，但與此同時花色苷也在迅速降解。Bozic等發(fā)現(xiàn)葡萄酒發(fā)酵所使用的的酵母菌因帶有羥基肉桂酸脫羧酶，有利于形成高濃度的乙烯酚基吡喃花色苷。本課題組近期也嘗試采用超聲波進行加速研究，并經(jīng)初步實驗驗證超聲波的確有促進吡喃花色苷生成的效果，其處理過程中所產(chǎn)生的空化效應能起到關鍵的促進作用：超聲波作用后，液體介質(zhì)被激活或形成空化泡，瞬間形成高溫高壓環(huán)境，并且伴隨著能量強大的沖擊波產(chǎn)生，水分子由此裂解為自由基，促使溶液體系中分子鍵的裂解和生成，最終加快吡喃花色苷的生成速度。盡管部分輔助手段已經(jīng)初步被證明有利于吡喃花色苷的制備，但均伴隨有原型花色苷降解的問題。因此，如何協(xié)調(diào)吡喃花色苷生成帶來的穩(wěn)定性優(yōu)勢與原型花色苷快速降解帶來的負面影響，或得到一個在促進吡喃花色苷形成同時，能最大程度地維持其他花色苷物質(zhì)含量的方法，仍需研究者做出更多的探索。

3.2 吡喃花色苷的生物活性和吸收代謝

目前研究以吡喃花色苷為代表的相關花色苷衍生物的具體生物活性及其代謝機理的相關文獻還較為匱乏。已有研究證明Oxovitisin A具有抗乳腺癌的能力，其吡喃環(huán)和環(huán)上取代基都有利于其轉(zhuǎn)運吸收，使其在胃壁細胞模型中的吸收效率高于原型花色苷Mv-3-glu和Vitisin A。雖然如此，由于結(jié)構(gòu)上多出吡喃環(huán)的特殊性，吡喃花色苷難免與原型花色苷的生物活性產(chǎn)生一定差異，在機體內(nèi)的吸收難易程度、轉(zhuǎn)運的機制以及和其他活性成分之間的相互作用可能也會不同，所以其他多種吡喃花色苷未知的生物活性功能及其發(fā)揮作用所基于的體內(nèi)轉(zhuǎn)運吸收能力仍有待探索。

3.3 吡喃花色苷的新型應用開發(fā)

吡喃花色苷作為一類天然的植物色素，具有其他人工合成色素所無法比擬的環(huán)保、安全和益于健康的優(yōu)勢，更適合應用于食品、化妝品和保健品等相關領域，但其潛在開發(fā)價值不僅限于此。Oliveira等利用Vitisin A和4-(二甲氨基)肉桂酸人工合成了一種半天然的藍色色素，它屬于Portisin型吡喃花色苷的衍生物，具有良好的開發(fā)前景。市面上的染料敏化太陽能電池多數(shù)通過昂貴且有毒的釕復合物實現(xiàn)能量的高轉(zhuǎn)化效率，Pinto等將仿生合成的吡喃花色苷作為高效替代光敏劑。吡喃花色苷上的吡喃環(huán)C和D之間的共軛鍵強化了電子離域效應，降低了C2位受親核攻擊的幾率，所以任何pH值范圍下，都在可見光區(qū)域有相應吸收，是一種具有廣闊前景的染料敏化劑。

4 結(jié) 語

本文總結(jié)了花色苷的研究現(xiàn)狀以及包括?；男曰ㄉ?、酯基改性花色苷以及吡喃花色苷在內(nèi)的3種主要花色苷衍生物的基本特性。3種衍生物在穩(wěn)定性方面均優(yōu)于原型花色苷，總體來看吡喃花色苷更具開發(fā)潛力。?；男耘c酯基改性更側(cè)重于花色苷脂溶性的提升，但合成效率低；吡喃花色苷在生物利用度與生物活性方面更有優(yōu)勢，同時還保持了花色苷原本的水溶性。

根據(jù)形成時期與反應底物的不同，吡喃花色苷被分為以原型花色苷為反應基礎的第一代吡喃花色苷（圖11中紅色物質(zhì)）以及以第一代吡喃花色苷為反應基礎的第二代吡喃花色苷（圖11中綠色物質(zhì)）。第一代吡喃花色苷主要包括Vitisin型、黃烷醇型和酚基型，第二代吡喃花色苷主要包括Portisin型、Oxovitisin型和吡喃花色苷二聚體型。親核加成后氧化脫羧及環(huán)加成反應是形成各類吡喃花色苷的主要方式，這可能與C10位的親電特性有關。另外，與原型花色苷相比，吡喃花色苷的最大吸收波長將發(fā)生不同程度的藍移或紅移，在顏色表現(xiàn)上也存在很大差異。這些豐富的結(jié)構(gòu)組成為吡喃花色苷的開發(fā)應用帶來了多種可能。

圖11 常見吡喃花色苷的結(jié)構(gòu)與形成過程Fig. 11 Formation processes and structures of normal pyranoanthocyanins

現(xiàn)階段對吡喃花色苷的認識仍不夠全面和深入。還存在如吡喃花色苷的高效制備、體內(nèi)生物活性和吸收代謝機理及其他新型環(huán)保應用開發(fā)等相關問題目前尚未形成完整的科學研究體系。解決相關問題、挖掘更多功能及應用可能性是未來吡喃花色苷研究發(fā)展的方向。