1-辛烯-3-醇對(duì)HT22細(xì)胞的神經(jīng)毒性

任麗圓，胡秋輝，劉建輝，謝旻皓，蘇安祥，徐 輝，楊文建

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023）

天然芳香揮發(fā)性化合物擴(kuò)散至空氣中呈現(xiàn)出獨(dú)特的氣味，常用于防御昆蟲(chóng)和病原的攻擊。近年來(lái)食用菌的消費(fèi)量明顯提升，這與其獨(dú)特的風(fēng)味有很大的聯(lián)系。食用菌的特征風(fēng)味主要由揮發(fā)性呈香物質(zhì)和非揮發(fā)性呈味物質(zhì)組成，八碳類(lèi)化合物為最主要的揮發(fā)性化合物來(lái)源，其中1-辛烯-3-醇（又名蘑菇醇）是食用菌的典型風(fēng)味物質(zhì)，其含量不同時(shí)會(huì)呈現(xiàn)出不同的風(fēng)味，包括蘑菇、泥土、濕木頭的氣味。1-辛烯-3-醇單獨(dú)研究時(shí)多被當(dāng)作蚊蟲(chóng)引誘劑，對(duì)于動(dòng)物大腦神經(jīng)系統(tǒng)有一定的損傷。有研究表明低劑量（體積分?jǐn)?shù)0.1%）的1-辛烯-3-醇能通過(guò)降低多巴胺水平而導(dǎo)致黑腹果蠅的神經(jīng)元變性，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探究發(fā)現(xiàn)蛋白激酶B和應(yīng)激活化蛋白激酶都可以防止與1-辛烯-3-醇暴露相關(guān)的多巴胺活性喪失，且與胱天蛋白酶3（caspase-3）的激活有關(guān)；另外當(dāng)大鼠暴露于0.5 mg/L 1-辛烯-3-醇時(shí)，觀察到一氧化氮和其他炎癥標(biāo)志物水平上調(diào)，表明揮發(fā)性1-辛烯-3-醇具有一定的神經(jīng)毒性。急性暴露實(shí)驗(yàn)表明1-辛烯-3-醇能通過(guò)刺激眼部、上呼吸道并導(dǎo)致頭痛惡心的癥狀。進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明1-辛烯-3-醇能引起胚胎干細(xì)胞及肺癌細(xì)胞株的活力下降。但相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病缺乏深入研究，具體的影響機(jī)制尚不明確。

隨著生活節(jié)奏的加快，越來(lái)越多的人患有神經(jīng)系統(tǒng)疾病，并且患病人群趨于年輕化。目前，關(guān)于神經(jīng)毒性作用機(jī)制尚未明確，其可能與細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、抑制神經(jīng)軸生長(zhǎng)等有關(guān)，其中氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)方面的研究占有重要地位。腦組織對(duì)氧化應(yīng)激極其敏感，由于大腦代謝需要大量的氧氣，這一耗氧代謝會(huì)產(chǎn)生更多的自由基。其中線粒體是產(chǎn)生氧自由基的最主要部位，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原電位和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控細(xì)胞凋亡，甚至導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生。另外大量研究表明，神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)緊密相連，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在特有的免疫監(jiān)管體系，通過(guò)炎癥反應(yīng)的發(fā)生來(lái)應(yīng)對(duì)各種的大腦損傷。炎癥發(fā)生在大腦中會(huì)促進(jìn)急性或慢性大腦疾病的病程發(fā)展，且大腦中的神經(jīng)元會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、細(xì)胞因子和蛋白酶的分泌，對(duì)抗炎癥的負(fù)面影響從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

基于此，本研究利用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）法檢測(cè)不同劑量的1-辛烯-3-醇對(duì)小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的活力影響，確定合適的劑量并進(jìn)行后續(xù)的研究；觀察細(xì)胞形態(tài)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）基因水平的表達(dá)；測(cè)定細(xì)胞凋亡率、凋亡基因表達(dá)水平、活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的變化；測(cè)定線粒體膜電位、細(xì)胞色素c氧化酶（cytochrome c oxidase，COX）質(zhì)量濃度；測(cè)定炎癥因子腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α和白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6的mRNA相對(duì)表達(dá)水平，以探究其影響神經(jīng)功能的途徑，以期為1-辛烯-3-醇的神經(jīng)毒性研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1-辛烯-3-醇（純度98%） 北京索萊寶科技有限公司；小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22細(xì)胞 湖南豐暉生物科技有限公司。

胎牛血清、Dulbecco’s改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%）、青鏈霉素 美國(guó)Gibco公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（1 mol/L、pH 7.2～7.4） 北京索萊寶科技有限公司；CCK-8試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型）、裂解液、SOD活力測(cè)定試劑盒、MDA含量測(cè)定試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、ROS相對(duì)含量測(cè)定試劑盒、線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）檢測(cè)試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒 南京諾唯贊生物科技有限公司；小鼠COX測(cè)定試劑盒 江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-2恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；Allegra冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter有限公司；HERACell 240i二氧化碳培養(yǎng)箱、NanoDrop?超微量分光光度計(jì)、Tadvanced 96G梯度PCR儀、7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀美國(guó)Thermo Fisher公司；ELX800多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；XD 30倒置式生物顯微鏡 北京普瑞塞斯儀器有限公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀美國(guó)Becton Dickinson公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞活力測(cè)定

1-辛烯-3-醇培養(yǎng)液的配制：先將1-辛烯-3-醇樣品加入DMSO中配制為體積分?jǐn)?shù)為10%的母液，之后使用含10%（體積分?jǐn)?shù)，下同）DMEM的培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋。

細(xì)胞傳代：將HT22細(xì)胞接種至含6 mL 10% DMEM培養(yǎng)液（含10%（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清和1%（體積分?jǐn)?shù)）青鏈霉素）的25 cm細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并置于37 ℃、5% CO細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿約80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。吸棄培養(yǎng)液，加入2 mL PBS沖洗2～3 次，然后加入約1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶溶液消化，待細(xì)胞脫落后加入1 mL培養(yǎng)液以終止消化，將培養(yǎng)瓶中溶液轉(zhuǎn)移至離心管后以1 000 r/min離心3 min，棄去上清液。然后加入1 mL培養(yǎng)液將細(xì)胞重懸，轉(zhuǎn)移至盛有5 mL新鮮培養(yǎng)液的25 cm細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，8字法搖晃均勻，置于37 ℃、5% CO細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

采用CCK-8法測(cè)定1-辛烯-3-醇對(duì)HT22細(xì)胞的活力影響。具體操作如下，用10% DMEM培養(yǎng)液將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT22細(xì)胞配制成單個(gè)細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10個(gè)/L，按照每孔100 μL接種于96 孔板進(jìn)行培養(yǎng)，約24 h后吸棄培養(yǎng)液，分別加入100 μL 0（對(duì)照，后同）、0.025%（體積分?jǐn)?shù)，后同）、0.050%、0.075%、0.100%、0.125%、0.150% 1-辛烯-3-醇培養(yǎng)液，于37 ℃培養(yǎng)24 h后按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞活力，以對(duì)照組細(xì)胞活力為100%。

1.3.2 細(xì)胞形態(tài)觀察

將800 μL對(duì)數(shù)期細(xì)胞（濃度為1×10個(gè)/ mL）接種于24 孔板中，孵育24 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入800 μL 1-辛烯-3-醇培養(yǎng)液（作用劑量分別為0、0.025%、0.050%、0.075%、0.100%、0.125%）孵育24 h后于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，放大倍數(shù)為100 倍。

1.3.3 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

將1.5 mL濃度為2×10個(gè)/mL的HT22細(xì)胞接種于6 孔板內(nèi)，37 ℃孵育24 h，之后棄去培養(yǎng)液，按照1.3.2節(jié)分組加入1.5 mL的1-辛烯-3-醇培養(yǎng)液孵育24 h。收集上層培養(yǎng)液至離心管中，用PBS（1 mol/L、pH 7.2～7.4）進(jìn)行清洗并用500 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶溶液消化1～2 min，待細(xì)胞消化后加入離心管內(nèi)的培養(yǎng)液以終止消化，1 000 r/min離心3 min后棄去上清液。加入195 μL Annexin V-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）試劑輕輕重懸細(xì)胞，再加入5 μL Annexin V-FITC與10 μL PI試劑混勻。參考文獻(xiàn)[18]進(jìn)行室溫避光孵育，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，各組每次分析1×10個(gè)細(xì)胞，使用FlowJo軟件測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

1.3.4 活性氧相對(duì)含量的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)分組同1.3.2節(jié)，參考ROS相對(duì)含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞活性氧相對(duì)含量。

1.3.5 超氧化物歧化酶活力檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)分組同1.3.2節(jié)，1.5 mL濃度為2×10個(gè)/mL的細(xì)胞接種于6 孔板，經(jīng)不同劑量1-辛烯-3-醇培養(yǎng)液孵育24 h，之后棄去培養(yǎng)液加入200 μL裂解液，12 000 r/min離心5 min后取上清液作為待測(cè)樣品，并使用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，按照SOD試劑盒說(shuō)明書(shū)通過(guò)黃嘌呤氧化酶偶聯(lián)法測(cè)定HT22細(xì)胞內(nèi)SOD活力，單位為U/mg（以蛋白質(zhì)量計(jì)）。

1.3.6 丙二醛含量測(cè)定

取1.3.5節(jié)收集得到的上清液作為待測(cè)樣品，通過(guò)硫代巴比妥酸法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)MDA含量，單位為μmol/mg（以蛋白質(zhì)量計(jì)）。

1.3.7 線粒體膜電位的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)分組同1.3.2節(jié)，參考文獻(xiàn)[22]利用熒光探針JC-1法檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位。當(dāng)線粒體膜電位正常時(shí)，JC-1熒光探針可進(jìn)入線粒體基質(zhì)中形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光，即Q2區(qū)；當(dāng)線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能進(jìn)入線粒體基質(zhì)中，表現(xiàn)為單體形式，產(chǎn)生綠色熒光，即Q3區(qū)。用紅、綠熒光強(qiáng)度的比值（Q2/Q3）表征線粒體膜電位，JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變即表明線粒體膜電位的下降。

1.3.8 細(xì)胞色素c氧化酶質(zhì)量濃度的測(cè)定

取1.3.3節(jié)收集得到的上清液作為待測(cè)樣品，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定COX質(zhì)量濃度，單位為ng/L。

1.3.9 BDNF、凋亡、炎癥因子相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

采用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，后用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其轉(zhuǎn)錄為cDNA。之后采用聚合酶和SYBR熒光染料，以稀釋后的cDNA為模板擴(kuò)增目標(biāo)基因，引物序列見(jiàn)表1。以為內(nèi)參基因，對(duì)照組作為相對(duì)定量組，所有PCR數(shù)據(jù)均采用2相對(duì)定量法進(jìn)行分析，計(jì)算BDNF、凋亡、炎癥因子相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果表示為相對(duì)于對(duì)照組的基因表達(dá)倍數(shù)。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences used for gene amplification

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)中各指標(biāo)進(jìn)行3 次重復(fù)，測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin 2019軟件作圖，采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量1-辛烯-3-醇對(duì)HT22細(xì)胞活力的影響

用0、0.025%、0.050%、0.075%、0.100%、0.125%、0.150% 1-辛烯-3-醇培養(yǎng)液處理HT22細(xì)胞24 h，測(cè)定細(xì)胞活力并觀察細(xì)胞形態(tài)，由此來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，與對(duì)照組相比，除0.025%劑量下細(xì)胞活力無(wú)明顯變化，隨著1-辛烯-3-醇劑量的增大，各組細(xì)胞活力顯著下降（＜0.05），且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。1-辛烯-3-醇體積分?jǐn)?shù)為0.050%時(shí)，細(xì)胞活力為（86.68±19.40）%；當(dāng)樣品體積分?jǐn)?shù)增至0.075%時(shí)，細(xì)胞活力急劇降至（30.05±9.08）%。由此可見(jiàn)，0.050% 1-辛烯-3-醇處理對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有明顯的損傷作用。

圖1 不同劑量1-辛烯-3-醇處理24 h條件下 HT22細(xì)胞的活力Fig. 1 Effect of different concentrations of 1-octen-3-ol for 24 h on viability of HT22 cells

進(jìn)一步在顯微鏡下觀察HT22細(xì)胞在不同劑量1-辛烯-3-醇作用24 h后的形態(tài)及數(shù)量變化，結(jié)果如圖2所示。對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)為星狀形，細(xì)胞密度大，有明顯的細(xì)胞團(tuán)簇在一起，表現(xiàn)出明顯的活力狀態(tài)。經(jīng)過(guò)1-辛烯-3-醇處理的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，形態(tài)偏向于圓形，箭頭指示的細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的形態(tài)變化，典型的星狀形變成圓形，有大量漂浮狀態(tài)出現(xiàn)，且出現(xiàn)大片的死細(xì)胞。其中0.100%樣品處理組的細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)明顯，細(xì)胞全部呈現(xiàn)出圓形，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，這與上述的CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互印證。

圖2 不同劑量1-辛烯-3-醇處理24 h條件下HT22細(xì)胞的形態(tài)（100×）Fig. 2 Effect of different concentrations of 1-octen-3-ol for 24 h on morphology of HT22 cells (100 ×)

2.2 不同劑量1-辛烯-3-醇對(duì)HT22細(xì)胞BDNF的影響

BDNF在神經(jīng)元的生存、分化、生長(zhǎng)和維持中有重要作用，可以影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。2.1節(jié)結(jié)果表明1-辛烯-3-醇對(duì)HT22細(xì)胞活力有極大的損傷作用，因此進(jìn)一步通過(guò)測(cè)定mRNA相對(duì)表達(dá)水平來(lái)研究其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響。結(jié)果如圖3所示，當(dāng)1-辛烯-3-醇處理劑量高于0.025%時(shí)，隨著1-辛烯-3-醇劑量的增加，mRNA相對(duì)表達(dá)水平呈逐漸下降趨勢(shì)，其中0.075%、0.100%、0.125% 1-辛烯-3-醇處理組與對(duì)照組有顯著性差異（＜0.05），分別為對(duì)照組的0.65、0.31、0.08 倍。上述結(jié)果表明1-辛烯-3-醇對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)有一定的損傷。

圖3 不同劑量1-辛烯-3-醇處理HT22細(xì)胞的BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)水平Fig. 3 Effect of different concentrations of 1-octen-3-ol on relative mRNA expression level of BDNF in HT22 cells

2.3 不同劑量1-辛烯-3-醇對(duì)HT22細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡是指由基因控制的細(xì)胞為穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)而主動(dòng)死亡的過(guò)程。如圖4A、B所示，隨著1-辛烯-3-醇劑量的增加，細(xì)胞凋亡率呈明顯上升趨勢(shì)，各劑量樣品處理組與對(duì)照組均表現(xiàn)出顯著性差異（＜0.05），其中0.075%和0.100%處理組的細(xì)胞凋亡率分別達(dá)到了（45.26±5.79）%、（64.09±8.81）%，由此可以推測(cè)，當(dāng)1-辛烯-3-醇劑量在0.075%～0.100%時(shí)，便導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率達(dá)到50%。這些結(jié)果表明，1-辛烯-3-醇處理可以顯著誘導(dǎo)HT22細(xì)胞凋亡，且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，表明1-辛烯-3-醇觸發(fā)了HT22細(xì)胞凋亡從而導(dǎo)致細(xì)胞活力下降。

基因能夠抑制細(xì)胞的凋亡，而有拮抗基因抑制細(xì)胞凋亡的作用，兩者能夠在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用，因此進(jìn)一步在mRNA水平探索1-辛烯-3-醇的抗細(xì)胞凋亡機(jī)制。如圖4C所示，當(dāng)1-辛烯-3-醇處理劑量高于0.025%時(shí)，/的mRNA相對(duì)表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)，其中0.100% 1-辛烯-3-醇處理組與對(duì)照組有顯著性差異（＜0.05），為對(duì)照組的1.4 倍。這些結(jié)果表明，1-辛烯-3-醇的細(xì)胞凋亡作用與促進(jìn)Bax/Bcl-2通路激活有關(guān)。

圖4 不同劑量1-辛烯-3-醇處理HT22細(xì)胞的凋亡情況Fig. 4 Effect of different concentrations of 1-octen-3-ol on apoptosis rate of HT22 cells

2.4 不同劑量1-辛烯-3-醇對(duì)HT22細(xì)胞內(nèi)ROS相對(duì)含量的影響

有研究顯示ROS與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，而且當(dāng)ROS水平過(guò)高時(shí)會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而造成氧化損傷，因此檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平可以反映生物體氧化損傷的強(qiáng)度。結(jié)果如圖5所示，劑量高于0.025%的1-辛烯-3-醇處理能夠增加ROS的相對(duì)含量，且呈現(xiàn)劑量依賴性，其中0.100%和0.125% 1-辛烯-3-醇處理組與對(duì)照組有顯著性差異（＜0.05），分別為對(duì)照組的1.9、2.5 倍。上述結(jié)果表明1-辛烯-3-醇處理能夠增加ROS相對(duì)含量。

圖5 不同劑量1-辛烯-3-醇處理HT22細(xì)胞的ROS相對(duì)含量Fig. 5 Effect of different concentrations of 1-octen-3-ol on ROS levels in HT22 cells

2.5 不同劑量1-辛烯-3-醇對(duì)HT22細(xì)胞內(nèi)SOD活力、MDA含量的影響

作為抗氧化系統(tǒng)中的重要組成部分，SOD活力通常被用于評(píng)價(jià)抗氧化活性。由圖6A可知，0.075%、0.100%和0.125%處理組SOD活力顯著高于對(duì)照組（＜0.05），分別為對(duì)照組的1.2、1.5、1.7 倍。MDA是脂質(zhì)氧化的終產(chǎn)物之一，其含量主要反映細(xì)胞過(guò)氧化的程度，也間接反映細(xì)胞的損傷程度。如圖6B所示，0.075%、0.100%和0.125%處理組MDA的含量顯著性高于對(duì)照組（＜0.05），分別為對(duì)照組的1.8、1.9、2.2 倍。上述結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)1-辛烯-3-醇處理的HT22細(xì)胞SOD活力和MDA含量均得到提高，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

圖6 不同劑量1-辛烯-3-醇處理HT22細(xì)胞的SOD活力（A）和MDA含量（B）Fig. 6 Effect of different concentrations of 1-octen-3-ol on SOD activity (A)and MDA content (B) in HT22 cells

2.6 不同劑量1-辛烯-3-醇對(duì)HT22細(xì)胞能量代謝的影響

線粒體在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著中央調(diào)控的作用，線粒體膜電位是指線粒體呼吸鏈質(zhì)子跨膜過(guò)程中內(nèi)膜兩側(cè)離子濃度不同所產(chǎn)生的電位差，膜電位的喪失被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的早期標(biāo)志之一。本研究以JC-1染色分析1-辛烯-3-醇對(duì)HT22細(xì)胞的線粒體膜電位的影響，結(jié)果如圖7A、B所示。當(dāng)劑量高于0.025%時(shí)，線粒體膜電位開(kāi)始逐漸下降，且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，其中0.100%和0.125%處理組的線粒體膜電位分別為對(duì)照組的55%和49%，與對(duì)照組有顯著差異（＜0.05）。這些結(jié)果表明1-辛烯-3-醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能是線粒體膜通透性增強(qiáng)導(dǎo)致的。

線粒體呼吸鏈?zhǔn)蔷€粒體能量轉(zhuǎn)化的核心與基礎(chǔ)，由4個(gè)跨膜蛋白復(fù)合體（呼吸鏈膜蛋白復(fù)合體I、II、III、IV）、泛醌以及細(xì)胞色素c組成，本研究選擇COX的質(zhì)量濃度作為特異性指標(biāo)來(lái)反映線粒體呼吸作用的變化。COX質(zhì)量濃度結(jié)果如圖7C所示，與對(duì)照組相比，0.050%、0.075%、0.100%和0.125%處理組COX質(zhì)量濃度顯著上升（＜0.05），且有一定的劑量依賴性，分別為對(duì)照組的2.0、2.2、2.8、3.0 倍。以上結(jié)果表明1-辛烯-3-醇的暴露會(huì)影響COX的分泌進(jìn)而影響線粒體呼吸作用。

圖7 不同劑量1-辛烯-3-醇處理對(duì)HT22細(xì)胞能量代謝的影響Fig. 7 Effect of different concentrations of 1-octen-3-ol on energy metabolism of HT22 cells

2.7 不同劑量1-辛烯-3-醇處理對(duì)炎癥因子TNF-α和IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)與炎癥水平是緊密相連的，因此進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)探究1-辛烯-3-醇作用下HT22細(xì)胞的炎癥水平變化。TNF-α和IL-6是兩種促炎性細(xì)胞因子，當(dāng)神經(jīng)炎癥發(fā)生時(shí)會(huì)導(dǎo)致其表達(dá)量增加。如圖8所示，隨1-辛烯-3-醇劑量的增加，和mRNA相對(duì)表達(dá)水平均呈增加趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，0.100%、0.125%1-辛烯-3-醇處理組mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著增加（＜0.05），分別約為對(duì)照組的25.9、30.1 倍；與對(duì)照組相比，0.075%、0.100%和0.125% 1-辛烯-3-醇處理組mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著上升（＜0.05），分別為對(duì)照組的9.6、10.1、14.5 倍。以上結(jié)果表明，1-辛烯-3-醇通過(guò)提高促炎因子和基因的表達(dá)對(duì)HT22細(xì)胞造成炎癥損傷。

圖8 不同劑量1-辛烯-3-醇處理HT22細(xì)胞的TNF-α（A）和IL-6（B）mRNA相對(duì)表達(dá)水平Fig. 8 Effect of different concentrations of 1-octen-3-ol on relative mRNA expression levels of TNF-α (A) and IL-6 (B)

3 討 論

1-辛烯-3-醇是食用菌的特征揮發(fā)性物質(zhì)，常被用作香料添加劑和蚊蟲(chóng)引誘劑，研究表明其能夠通過(guò)作用于神經(jīng)系統(tǒng)而對(duì)果蠅有損傷作用，而關(guān)于細(xì)胞方面的神經(jīng)毒性影響缺少相關(guān)的研究，其具體的影響機(jī)制尚未明確。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)是神經(jīng)系統(tǒng)的主要部分，是學(xué)習(xí)、記憶、語(yǔ)言和思維活動(dòng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。目前研究表明，持久的氧化應(yīng)激和長(zhǎng)期神經(jīng)炎性是導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的主要機(jī)制。氧化應(yīng)激指在機(jī)體受到不利刺激時(shí)，體內(nèi)會(huì)大量產(chǎn)生活性氧自由基，導(dǎo)致氧化還原系統(tǒng)失衡，造成細(xì)胞及組織損傷，這會(huì)引起細(xì)胞凋亡甚至病理?yè)p傷。線粒體是與氧化代謝關(guān)系最為密切的細(xì)胞器，線粒體的氧化呼吸作用是ROS產(chǎn)生的主要途徑，線粒體氧化呼吸鏈的損傷引起細(xì)胞內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致活性氧物質(zhì)濃度升高，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡，即表明氧化還原失衡時(shí)導(dǎo)致線粒體依賴性細(xì)胞凋亡。

本研究中高于0.025%的1-辛烯-3-醇作用導(dǎo)致HT22細(xì)胞活力顯著降低，表明1-辛烯-3-醇在HT22細(xì)胞中具有一定的毒性。BDNF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的主要成員，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)中具有重要作用，當(dāng)1-辛烯-3-醇劑量高于0.025%時(shí)，HT22細(xì)胞的mRNA相對(duì)表達(dá)水平低于對(duì)照組，表明1-辛烯-3-醇的神經(jīng)損傷作用可能與mRNA表達(dá)的下降有關(guān)。接下來(lái)分析了細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果表明，1-辛烯-3-醇能引起細(xì)胞凋亡率和/基因表達(dá)升高，其中，Bax和Bcl-2是凋亡途徑的典型控制蛋白，Bax水平的上升和Bcl-2水平的下降可以引起凋亡途徑的激活，推測(cè)1-辛烯-3-醇能通過(guò)促進(jìn)/基因表達(dá)引起HT22細(xì)胞的凋亡。進(jìn)一步分析1-辛烯-3-醇處理對(duì)HT22細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響，結(jié)果表明氧化應(yīng)激水平得到了一定程度的升高，表現(xiàn)為ROS相對(duì)含量、SOD活力和MDA含量增加。這是由于ROS過(guò)量產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的升高，而SOD作為抗氧化系統(tǒng)的主要組成，在1-辛烯-3-醇的毒性作用下，HT22細(xì)胞為保護(hù)機(jī)體而刺激SOD活力增加，但細(xì)胞活力的下降導(dǎo)致HT22細(xì)胞的抗氧化能力難以抵抗氧化損傷，從而使得機(jī)體仍維持氧化應(yīng)激的狀態(tài)。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了1-辛烯-3-醇通過(guò)線粒體損傷誘導(dǎo)HT22細(xì)胞凋亡的可能性，1-辛烯-3-醇的作用導(dǎo)致HT22細(xì)胞線粒體膜電位的降低以及COX分泌增加，進(jìn)而誘導(dǎo)的上調(diào)和的下調(diào)，從而引起凋亡途徑的激活。這與張亞瓊的研究結(jié)果一致，其發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺可能是通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA水平，產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，降低線粒體膜電位，上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，進(jìn)而誘發(fā)HT22細(xì)胞的凋亡，誘導(dǎo)HT22細(xì)胞神經(jīng)元損傷。神經(jīng)炎癥被認(rèn)為是引發(fā)多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)鍵，本研究中1-辛烯-3-醇的處理會(huì)導(dǎo)致和mRNA表達(dá)水平的增加，表明1-辛烯-3-醇介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥與細(xì)胞凋亡是共存的。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究HT22細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同劑量1-辛烯-3-醇處理后活力變化及其相關(guān)的機(jī)制。結(jié)果表明，隨著1-辛烯-3-醇劑量的增大，細(xì)胞活力明顯降低，細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的分散形態(tài)且神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)受到抑制。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1-辛烯-3-醇能通過(guò)增加ROS相對(duì)含量、SOD活力及MDA含量誘導(dǎo)細(xì)胞的氧化應(yīng)激；并通過(guò)促進(jìn)/的基因表達(dá)引起細(xì)胞凋亡，這可能是通過(guò)增加COX的分泌進(jìn)一步降低線粒體膜電位所引起的；此外，1-辛烯-3-醇通過(guò)促進(jìn)炎癥因子和的分泌誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。綜上，1-辛烯-3-醇對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞有明顯的毒性損傷作用，細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、能量代謝、炎癥水平這幾個(gè)方面為其主要作用途徑，本實(shí)驗(yàn)可為研究1-辛烯-3-醇的神經(jīng)毒性作用提供理論參考。