應(yīng)用MALDI-TOF MS 分析黃連素作用前后耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌質(zhì)譜峰圖的改變

許敏靜 林少華 干鐵兒

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是社區(qū)獲得感染、醫(yī)院內(nèi)獲得感染的重要病原菌之一，且耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）的感染呈逐年上升[1]，給臨床診治帶來了極大挑戰(zhàn)。研究發(fā)現(xiàn)，黃連素能較好地抑制CRKP 的生長，并且有逆轉(zhuǎn)CRKP 耐藥性的作用[2]?；诖?，本研究擬采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（matrix-assisted laser desorption ionization time -of -flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）對黃連素作用前后CRKP 進(jìn)行分析，評(píng)估黃連素作用后細(xì)菌蛋白質(zhì)峰譜的改變。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診及住院患者的產(chǎn)CRKP 菌20 株（去除來自同一患者的重復(fù)菌株），所有菌株均經(jīng)質(zhì)譜鑒定和耐藥基因確認(rèn)。

1.2 試劑和儀器 哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基（溫州康泰生物技術(shù)有限公司），營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（杭州濱和微生物試劑有限公司,批號(hào)200217），黃連素（浙江省杭州市華東大藥房，批號(hào)16110312），0.45% NaCL樣本稀釋液（法國生物梅里埃公司，批號(hào)C0550），三氟乙酸（批號(hào)202010022）、乙腈（批號(hào)202010081）、甲酸（批號(hào)202010031）（成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司），α-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA，批號(hào)0000370825）（布魯克·道爾頓公司），Densichek Plus比濁儀（法國生物梅里埃公司），96 孔加樣板，基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（德國Bruker 公司）。

1.3 質(zhì)量控制 基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀自動(dòng)分類程序由BTS（布魯克·道爾頓公司）作為校準(zhǔn)品進(jìn)行自動(dòng)驗(yàn)證，質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922（購自國家衛(wèi)生健康委臨檢中心）。

1.4 方 法

1.4.1 營養(yǎng)肉湯 取22g 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基加1000 mL蒸餾水，加熱溶解，121 ℃高壓滅菌，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫ú怀^2 周）。

1.4.2 黃連素原液 將黃連素溶解于無菌生理鹽水中，加熱溶解，用營養(yǎng)肉湯稀釋成終濃度為256 μg/mL的溶液，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫ú怀^1 周）。

1.4.3 菌懸液制備 取哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜的產(chǎn)CRKP 菌新鮮菌落于NaCl 濃度為0.45%樣本稀釋液中，配制成相當(dāng)于0.5 麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海?.5×108cfu/mL 菌懸液），再用0.45%生理鹽水稀釋100 倍至1.5×106cfu/mL 備用。

1.4.4 菌株培養(yǎng) 取1 μL 菌懸液接種于含黃連素的營養(yǎng)肉湯中，并以空白營養(yǎng)肉湯作對照組，于35 ℃振蕩培養(yǎng)5 d，孵育結(jié)束后用接種環(huán)轉(zhuǎn)種至哥倫比亞血平板，35 ℃孵育18～24 h，得到第2 代菌株；同樣方法對2 代菌株進(jìn)行培養(yǎng)得到第3 代菌株。

1.4.5 菌株鑒定 將上述菌株用MALDI-TOF MS進(jìn)行鑒定，具體操作方法參照文獻(xiàn)[3]。將所得的質(zhì)譜峰圖與MALDI Biotype 3.0 軟件（德國Bruker 公司）中的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，并用匹配分值來給結(jié)果定級(jí)。分值為2.300～3.000 可以準(zhǔn)確的鑒定到種水平；分值為2.000～2.299 可以準(zhǔn)確的鑒定到屬。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用ClinProTools 3.0 軟件對各菌株質(zhì)譜峰圖譜進(jìn)行分組分析。具體步驟參照儀器自帶的ClinProTools 3.0 軟件介紹與操作指南?；緟?shù)維持不變，將所有菌株分成三組（原始菌株、2 代菌株和3 代菌株），然后分別將原始菌株和2 代菌株、原始菌株和3 代菌株進(jìn)行分析，分別選擇遺傳算法（GA）、快速分類算法（QC）、監(jiān)督式神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法（SNN）對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并建立相應(yīng)的模型。每一模型中的識(shí)別能力（recognition capability）和交叉驗(yàn)證（cross validation）分別體現(xiàn)了該模型的靈敏性和特異性。

2 結(jié)果

2.1 鑒定結(jié)果 20 株試驗(yàn)菌株經(jīng)MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果全部為肺炎克雷伯菌，其分值均＞2.300，可以準(zhǔn)確鑒定到種水平。

2.2 ClinProTools 軟件分析結(jié)果

2.2.1 算法統(tǒng)計(jì) 進(jìn)行峰統(tǒng)計(jì)之后，ClinProTools 將原始菌株組和3 代菌株組細(xì)菌較清晰地劃分成兩個(gè)區(qū)域，大部分菌株準(zhǔn)確落在相應(yīng)的分組中，只有1 個(gè)3 代菌株落在原始菌株組種（見圖1）。通過GA、QC和SNN 三種方法得出的結(jié)果基本相似，其靈敏度均大于95.00%，其中SNN 算法得出的靈敏度最高（100.00%），其次GA、QC 算法的靈敏度均為97.50%；GA、SNN 和QC算法的特異性分別為89.90%、92.36%、88.86%（見表1）。

圖1 原始菌株與3 代菌株的二維分析圖

表1 應(yīng)用ClinProTools 3.0 軟件得到的各個(gè)算法模型的靈敏度與特異性

2.2.2 特征性峰數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用ClinProTools 對質(zhì)譜峰統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，峰169、158、174、168 為區(qū)分的最為主要的特征峰，這4 個(gè)特征性峰的Anderson-Darling 檢驗(yàn)的P 值（PAD）均接近0（見表2），因這些峰呈非正態(tài)性分布，而秩和檢驗(yàn)的P 值（PWKW）值均＜0.05，說明兩組菌株之間的這4 個(gè)峰的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 區(qū)分原始菌株和三代菌株的特征性峰的峰值統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)

3 討論

近年來，MALDI-TOF MS 為一種快速鑒定病原性細(xì)菌種屬的新技術(shù)，是利用微生物之間擁有的自身獨(dú)特的蛋白質(zhì)組成原理，分析檢測蛋白質(zhì)指紋圖譜,經(jīng)過軟件分析處理，再與數(shù)據(jù)庫比對，通過分析病原菌菌株間蛋白豐度的細(xì)小差異[4]，能在幾分鐘之內(nèi)完成對微生物種或?qū)偎降蔫b定。在臨床中，MALDI-TOF MS 技術(shù)的應(yīng)用不僅限于菌種或?qū)俚目焖勹b定[5-6]，同時(shí)已涉及多個(gè)領(lǐng)域，如流行病學(xué)、細(xì)菌快速分型、耐藥分析和毒力檢測等[7]，尤其是目前耐藥菌感染的嚴(yán)峻形勢，學(xué)者們加快了對快速檢測細(xì)菌耐藥性及其變遷方法的探索,應(yīng)用MALDI-TOF MS尋找特異質(zhì)譜峰是分析耐藥性及其變遷的關(guān)鍵。

Gaibani 等[8-9]評(píng)估了實(shí)時(shí)單峰法檢測CRKP 的性能，結(jié)果顯示，準(zhǔn)確率為98%、陽性預(yù)測值為98%、陰性預(yù)測值為97%。該方法的高預(yù)測值表明MALDI-TOF MS 可作為篩選CRKP 的一線工具。本研究應(yīng)用MALDI-TOF MS 比較陰性對照（原始菌株）和待測菌株（黃連素感觸后）所記錄的峰值數(shù)量和強(qiáng)度，當(dāng)細(xì)菌耐藥性變化越大時(shí),峰譜圖發(fā)生變化越大，對20 株CRKP 菌株圖譜建立模型，得到二維圖顯示作用前菌株和第3 代菌株大部分落在相應(yīng)的分組中，說明菌株的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，且兩者間存在較大的差異。三種算法靈敏度均大于95%，特異性大于88%；峰169、158、174、168 是用于區(qū)分的最為主要的特征性峰，可能原因是黃連素改變了CRKP 蛋白或者多肽的表達(dá)，導(dǎo)致形成的峰譜圖出現(xiàn)差異。但也存在少量 菌株模棱兩可的情況，無法清晰地分入組中，可能存在一些可影響因素，比如細(xì)菌培養(yǎng)基的選擇、細(xì)菌的培養(yǎng)條件、樣品處理以及基質(zhì)結(jié)晶等可能會(huì)影響質(zhì)譜的峰圖[10]，因此實(shí)驗(yàn)還需要進(jìn)一步完善。

綜上所述，使用MALDI-TOF MS 技術(shù)對黃連素作用前后的產(chǎn)CRKP 菌進(jìn)行蛋白質(zhì)峰譜分析，結(jié)果顯示黃連素作用后其蛋白質(zhì)譜峰有顯著差異，可能黃連素改變了CRKP 菌某些基因序列，從而改變了蛋白質(zhì)或多肽的表達(dá)，改變的結(jié)構(gòu)與其耐藥性可能存在相關(guān)性，但對使用黃連素后改變的蛋白所對應(yīng)基因尚未有明確，有待于進(jìn)一步研究，這也為后續(xù)的進(jìn)一步研究提供思路。同時(shí)應(yīng)用MALDI-TOF MS 分析質(zhì)譜圖的峰值變化可提示某些耐藥類型，對于已有MALDI-TOF MS 設(shè)備作為常規(guī)細(xì)菌種或?qū)勹b定的臨床實(shí)驗(yàn)室，對細(xì)菌耐藥性相關(guān)質(zhì)譜峰分析只需增加數(shù)據(jù)分析步驟，成本低廉，也避免工作人員復(fù)雜的操作培訓(xùn)，具有遠(yuǎn)大的應(yīng)用前景。