豬TRIM3基因克隆、生物信息學及組織表達分析

張 航，沙惠陽，李華瑋，黃良宗，趙孟孟

(1.佛山科學技術學院生命科學與工程學院，佛山 528231；2.河南牧業(yè)經濟學院食品與生物工程學院，鄭州 450046；3.佛山科學技術學院附屬教學動物醫(yī)院，佛山 528231)

三基序結合蛋白(tripartite motif-containing，TRIM)家族在人上已發(fā)現有80多個成員，是一組高度保守的E3泛素連接酶蛋白，參與細胞生長、分化、凋亡、細胞內運輸和轉錄調節(jié)等多種生物進程[1]。該家族成員都含有3個保守結構域，分別為N-端的RING結構域[2]、B-box鋅指結構域[3]、卷曲核心結構域(coiled-domain，CC)和1個額外的可變C-端結構域[4]。已有研究表明，TRIM家族成員與許多臨床的生理和病理過程有關，如TRIM8已被證明在膠質母細胞瘤和乳腺癌等多種癌癥中發(fā)揮腫瘤抑制作用[5]；TRIM21作為自身抗原在自身免疫疾病中被廣泛研究[6]；TRIM32的缺失突變引起神經系統(tǒng)的罕見遺傳病[7]。因此，對TRIM蛋白功能及作用機制的研究對認識疾病的發(fā)展具有重要意義。

病毒侵襲是困擾中國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的關鍵問題之一。開發(fā)靶向治療藥物，提高豬體自身免疫成為解決這一關鍵問題的方向之一。先天免疫是機體抵抗外來病原微生物感染的第一道防線。病原微生物作為病原相關分子模式被模式識別受體識別，產生一系列信號級聯反應促進細胞分泌干擾素(interferon，IFN)。產生的IFN與細胞表面受體結合，通過信號轉導器和JAK-STAT途徑激活信號級聯反應，導致大量干擾素刺激基因(interferon stimulates genes，ISGs)的表達。ISGs的大量表達使機體處于抗病毒狀態(tài)以保證宿主處于正常生理狀態(tài)。目前已經篩選鑒定出多數TRIM家族成員作為ISGs參與病毒生命周期的各個環(huán)節(jié)，包括病毒侵入、基因組復制以及病毒裝配與釋放等過程，如TRIM41通過與核衣殼蛋白(NP)相互作用從而使NP泛素化和隨后的蛋白質降解抑制A型流感病毒感染[8]；TRIM22也可以泛素化NP，并將其作為蛋白質降解的靶點[9]；TRIM25的C-端SPRY結構域與維甲酸誘導基因Ⅰ(retinoic acid-inducible gene Ⅰ，RIG-Ⅰ)的2CARD結構域結合，激活RIG-Ⅰ使其發(fā)生泛素化，從而促進β干擾素(interferon-β，IFN-β)的產生[10]。因此，深入研究ISGs的抗病毒機制對于開發(fā)靶向治療藥物具有重要意義。

TRIM3是TRIM家族成員之一，該蛋白除TRIM家族共有結構外，還含有1個Filamin結構域和1個C-末端NHL結構域[11]。目前對TRIM3的研究主要集中在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中。TRIM3是一種候選腫瘤抑制基因，通過核轉錄因子-κB(NF-κB)、Musashi-Notch、p38等多條信號通路抑制腫瘤細胞的生長、侵襲與轉移，參與腫瘤的臨床分期和預后[12-14]。在抑制病毒感染過程中，TRIM5、TRIM14、TRIM21、TRIM25、TRIM38發(fā)揮重要作用[15-19]，同為E3泛素連接酶的TRIM3是否在病毒感染中發(fā)揮作用鮮見報道。Li等[20]發(fā)現鼠源TRIM3基因介導Toll樣受體3(Toll-like receptor 3，TLR3)泛素化，從而正向調控TLR3介導的先天免疫和炎癥反應。但豬源TRIM3基因是否參與先天免疫仍然未知。因此，研究豬源TRIM3基因對豬病的防治具有重要意義。本研究以大白豬肝臟組織為試驗材料，克隆豬TRIM3基因并對其進行生物信息學分析，預測其蛋白的結構及可能的功能，同時分析TRIM3基因在各組織中的表達差異，旨在為進一步研究豬TRIM3基因免疫學特點及其參與豬先天性免疫和抗病毒感染中的分子機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

分別采集健康30日齡大白豬公豬心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、氣管和結腸等組織，—80 ℃保存?zhèn)溆?。TRIzol總RNA抽提試劑盒(R0016)和BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix(2×，Low ROX)均購自上海碧云天生物科技有限公司；cDNA一鏈合成試劑盒(R111)、2×TaqMaster Mix、DL5000 DNA Marker、膠回收/DNA純化試劑盒(DC301)、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞和質粒DNA小提試劑盒(DC201)均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；pMD18-T購自寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司；實時熒光定量PCR儀(CFX ConnectTMOptics Module)購自伯樂生命醫(yī)學產品(上海)有限公司。

1.2 引物設計與合成

參考野豬TRIM3基因(GenBank登錄號：XM_021062339.1)CDS序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計克隆和實時熒光定量PCR引物，以GAPDH(GenBank登錄號：NM_001206359.1)為內參基因，引物信息見表1。引物均由天一輝遠基因科技有限公司合成。

表1 引物信息

1.3 總RNA提取及cDNA合成

采用TRIzol總RNA抽提試劑盒提取豬各組織總RNA，用超微量分光光度計測定RNA濃度，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量，確定總RNA完整度且純度符合試驗要求。取0.5 μg總RNA，利用反轉錄試劑盒(HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit)合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 豬TRIM3基因CDS區(qū)克隆與測序

以反轉錄合成的肝臟組織cDNA為模板進行PCR反應，PCR反應體系25 μL：cDNA模板2 μL，10 μmol/L 上、下游引物各1 μL，2×TaqMasterMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，43 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將特異性條帶切膠回收后連接pMD18-T載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，疑似菌落挑至400 μL含有氨芐抗生素的1.5 mL EP管，37 ℃、200 r/min搖至4 h后做菌液PCR鑒定。菌液PCR反應體系10 μL：菌液2 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，2×TaqMasterMix 5 μL，ddH2O 2 μL。菌液PCR反應程序同上。菌液PCR鑒定正確后送天一輝遠基因科技有限公司進行測序。

1.5 相似性比對及系統(tǒng)進化樹構建

從NCBI網站中搜索并下載相關物種的TRIM3基因序列，包括野豬(Susscrofa，GenBank登錄號：XM_021062339.1)、人(Homosapiens，GenBank登錄號：AF220021.1)、獼猴(Macacamulatta，GenBank登錄號：NM_001266201.1)、小鼠(Muspahari，GenBank登錄號：XM_029538710.1)、牛(Bosindicus，GenBank登錄號：XM_027563142.1)、山羊(Caprahircus，GenBank登錄號：XM_018059468.1)、馬(Equuscaballus，GenBank登錄號：XM_023645901.1)、雞(Gallusgallus，GenBank登錄號：XM_040657774.1)、鵝(Ansercygnoidesdomesticus，GenBank登錄號：XM_013170643.1)、鴨(Anasplatyrhynchos，GenBank登錄號：XM_038179015.1)、大鼠(Rattusnorvegicus，GenBank登錄號：NM_031786.2)、黑猩猩(Pantroglodytes，GenBank登錄號：XM_016920269.2)、響尾蛇(Crotalustigris，GenBank登錄號：XM_039348142.1)。使用DNAStar軟件進行TRIM3基因序列相似性比對；利用Mega 7.0軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構建系統(tǒng)進化樹，自展分析Bootstrap 1 000次。

1.6 生物信息學分析

利用ExPASy在線軟件的ProtParam程序(https:∥web.expasy.org/protparam/)預測TRIM3蛋白的理化性質；利用Net OGlyc 4.0在線程序(https:∥www.expasy.org/search/Net OGlyc)預測TRIM3蛋白糖基化位點；運用Net Phos 3.1在線程序(https:∥www.expasy.org/search/Net Phos/)預測TRIM3蛋白磷酸化位點；利用WOLF PSORT在線軟件(https:∥www.genscript.com/wolf-psort.html)預測TRIM3蛋白亞細胞定位；利用SignalP-4.1 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和TMHMM 2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線程序預測蛋白信號肽及跨膜螺旋結構；利用ProtScale在線程序(https:∥web.expasy.org/protscale/)預測TRIM3蛋白親/疏水性；利用SOPMA在線軟件(https:∥nspa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=/NPSA/npsa_sopma.html)預測TRIM3蛋白二級結構；利用SWISS-MODEL在線軟件(http:∥www.swissmodel.expasy.org)預測TRIM3蛋白三級結構。

1.7 組織表達分析

分別對豬心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、氣管和結腸組織中TRIM3基因進行實時熒光定量PCR檢測。PCR反應體系10 μL：SYBR Premix ExTaqTMⅡ(2×)5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)混合0.5 μL，cDNA 4.5 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法分析TRIM3基因在豬不同組織中的相對表達量，每個樣品重復3次。數據處理采用GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software,San Diego，CA)軟件的多重比較方法，數據以平均值±標準差來表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 豬TRIM3基因克隆

以大白豬肝臟組織cDNA為模板進行PCR擴增，得到約2 235 bp擴增片段(圖1A)，條帶清晰明亮，與預期結果相符。經連接、轉化、挑菌后進行菌液PCR鑒定，結果獲得了約2 235 bp大小片段(圖1B)，表明成功克隆了豬TRIM3基因CDS區(qū)。

M，DL5000 DNA Marker；1、3，陰性對照；2，TRIM3基因PCR擴增產物；4，菌液PCR鑒定結果

2.2 相似性比對及系統(tǒng)進化樹構建

相似性比對結果顯示，大白豬TRIM3基因核苷酸序列與其他物種的相似性為75.1%～99.7%，其中與野豬的相似性最高，達99.7%；與鴨的相似性最低，為75.1%(圖2)。系統(tǒng)進化樹構建結果顯示，TRIM3基因在大白豬和野豬中先聚為一類，與野豬親緣關系最近，山羊和牛次之，與鵝的親緣關系最遠(圖3)。

圖2 不同物種TRIM3基因核苷酸序列比對

圖3 TRIM3基因系統(tǒng)進化樹

2.3 TRIM3蛋白生物信息學分析

2.3.1 理化性質、糖基化和磷酸化位點預測 大白豬TRIM3蛋白由744個氨基酸組成，分子式為C3514H5614N1048O1071S28，分子質量為80.58 ku，理論等電點(pI)為8.32，偏堿性。該蛋白含有20種必需氨基酸，其中含量最多的是甘氨酸(9.4%)，亮氨酸(9.0%)次之(表2)。預測不穩(wěn)定系數為40.85，證明TRIM3編碼蛋白不穩(wěn)定；理論半衰期在體外哺乳動物網織紅細胞中為30 h，在酵母體內>20 h且在大腸桿菌體內>10 h。親水性平均值(GRAVY)為-0.312，因此TRIM3蛋白為親水性蛋白；不含N-糖基化位點和O-糖基化位點；可能存在60個磷酸化位點，其中絲氨酸(Ser)磷酸化位點40個、蘇氨酸(Thr)磷酸化位點14個、酪氨酸(Tyr)磷酸化位點6個(圖4)。

表2 豬TRIM3蛋白氨基酸組成

圖4 豬TRIM3蛋白磷酸化位點預測

2.3.2 親/疏水性預測 利用ExPASy中ProtScale程序對大白豬TRIM3蛋白進行親/疏水性分析，結果顯示第182位氨基酸處有最大疏水值為2.400，第466位氨基酸處有最小親水值為-2.600(圖5)，即TRIM3為親水性蛋白。

圖5 豬TRIM3蛋白親/疏水性預測

2.3.3 亞細胞定位 大白豬TRIM3蛋白亞細胞定位預測結果顯示，TRIM3蛋白分布于細胞質、細胞核、過氧化物酶體和線粒體中，占比分別為52.2%、30.4%、8.7%和8.7%。

2.3.4 信號肽和跨膜螺旋結構預測 蛋白潛在信號肽剪切位點預測結果顯示，大白豬TRIM3蛋白沒有信號肽裂解位點。剪切位點分值(C值)為0.088(<0.32)，無剪切位點；信號肽分值(S值)為0.176(<0.87)，無信號肽；綜合剪切點分值(Y值)為0.071(<0.33)；S平均值為0.059(<0.48)，不屬于分泌蛋白；大白豬TRIM3蛋白D值為0.065，推測TRIM3蛋白不含有信號肽且不屬于分泌蛋白(圖6)。對大白豬TRIM3蛋白跨膜結構域預測顯示，TRIM3蛋白所有氨基酸均在細胞膜外；無跨膜螺旋結構(圖7)，說明大白豬TRIM3蛋白為膜外蛋白。

圖6 豬TRIM3蛋白信號肽預測

圖7 豬TRIM3蛋白跨膜結構域預測

2.3.5 二級結構和三級結構預測 利用SOPMA在線程序對大白豬TRIM3蛋白二級結構進行預測，結果顯示α-螺旋、β-轉角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈分別占26.08%、8.60%、41.67%和23.66%(圖8)。利用SWISS-MODEL在線程序構建大白豬TRIM3蛋白可能的三級結構模型，結果見圖9，全局模型質量估計值為0.35，與模板的相似性為81.52%，說明模型構建合理。

c和最短線，無規(guī)則卷曲；h和最長線，α-螺旋；e和中長線，延伸鏈；t和中短線，β-轉角

圖9 豬TRIM3蛋白三級結構預測

2.4 豬TRIM3基因在不同組織中的相對表達量

由圖10可知，TRIM3基因在豬心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、氣管和結腸組織中均有表達，其中，在肺臟中的相對表達量最高，且顯著高于其他組織(P<0.05)；在腎臟中的表達量次之；在心臟、肌肉和結腸中的相對表達量最少，且顯著低于其他組織(P<0.05)。

肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)

3 討 論

本試驗成功克隆大白豬TRIM3基因，并對該基因核苷酸序列與其他幾個物種進行相似性比對，比對結果與系統(tǒng)進化樹結果保持一致，顯示大白豬與野豬親緣關系最近，與鴨親緣關系最遠，證實TRIM3序列在各物種間具有高度保守性，符合生物進化特征，且具有廣泛的同源性。TRIM3氨基酸序列不穩(wěn)定，說明TRIM3蛋白容易失去活性；TRIM3蛋白沒有信號肽位點，說明TRIM3蛋白不能轉運，只會滯留到合成部位；TRIM3蛋白具有60個磷酸化位點，推測其可能參與某些細胞通路的調節(jié)，這與之前的報道一致[20]。TRIM3蛋白氨基酸序列親水性殘基多于疏水性殘基，表現為親水性，進一步說明TRIM3屬于不穩(wěn)定蛋白。亞細胞定位顯示TRIM3蛋白主要位于細胞質，這在預測蛋白跨膜結構域中進一步得到證實，說明TRIM3蛋白可能在細胞質中合成。TRIM3蛋白二級結構和三級結構預測結果一致，為進一步了解TRIM3蛋白的功能奠定基礎?？傊?，對TRIM3蛋白生物學功能的預測有利于揭示其可能參與的生物進程，為進一步研究TRIM3參與抗病毒天然免疫提供理論基礎。

實時熒光定量PCR檢測結果表明，TRIM3基因在大白豬不同組織中均有表達，這可能與TRIM3可通過各種途徑介導腫瘤發(fā)生及轉移過程相關[21-25]；在肺臟中的相對表達量最高，在氣管中的表達量也較高，說明該基因與呼吸系統(tǒng)的調節(jié)密切相關，為豬呼吸系統(tǒng)疾病的治療提供參考；在腎臟中表達量較高，可能與之前報道的TRIM3過表達通過抑制干擾素調節(jié)因子3途徑和NLRP3炎癥小體預防急性腎損傷[26]相關；在脾臟中表達量較高，推測其與豬的免疫功能有關。研究報道，鼠源TRIM3泛素連接酶影響海馬神經元樹突狀脊柱形態(tài)[27]，斑馬魚的TRIM3a在神經系統(tǒng)的發(fā)育及神經信號的傳導中起重要作用[28]，人源TRIM3可通過激活PI3K/Akt信號通路減輕帕金森病的細胞凋亡，提示TRIM3在神經系統(tǒng)調節(jié)中發(fā)揮作用，豬源TRIM3是否參與神經系統(tǒng)的調節(jié)還有待進一步探索。

激活先天免疫是宿主抵御病原體的必要條件。已報道豬源TRIM21依賴于RING結構域和蛋白酶體抑制豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的復制，但不影響病毒附著和內吞[16]。在抑制豬流行性腹瀉病毒增殖中TRIM21通過蛋白酶體途徑靶向并降解核衣殼蛋白[29]。之前研究表明，TRIM3是一種高度保守的E3泛素連接酶，通過泛素化TLR3以引起先天抗病毒反應，但具體的作用機制尚未解釋清楚，病毒蛋白與宿主蛋白的相互作用還需進一步驗證[20]。本研究成功克隆大白豬TRIM3基因，并對其理化性質進行預測，為揭示抗病毒天然免疫反應，提高豬體免疫力抵抗病毒感染提供理論依據。

4 結 論

本研究成功克隆大白豬TRIM3基因CDS全長序列，其片段長度為2 235 bp，編碼744個氨基酸，屬于親水性蛋白，二級結構中α-螺旋、β-轉角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈分別占26.08%、8.60%、41.67%和23.66%，以無規(guī)則卷曲為主，屬于不穩(wěn)定蛋白。TRIM3基因在豬各組織中均有表達，在肺臟中表達量最多，且極顯著高于其他組織。本試驗結果為進一步研究TRIM3基因的免疫學特點及參與豬先天免疫和抗病毒感染中的分子機制提供理論依據。