酶解麥胚制備風味活性肽的研究

趙原，金艷，張民

（天津科技大學食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室食品科學與工程學院，天津 300457）

小麥作為我國重要的糧食作物，其加工副產(chǎn)物小麥胚芽約占小麥籽粒的3%，其蛋白質(zhì)含量約30%，具有明顯的資源優(yōu)勢和營養(yǎng)價值[1]。然而，目前小麥胚芽主要作為飼料廣泛應用于養(yǎng)殖業(yè)，產(chǎn)品附加值較低，造成了極大的資源浪費[2]。

活性肽一般含有2個～20個氨基酸，分子量小于6 000 Da，具有良好的生物活性，包括抗氧化、抗高血壓、抗血栓、抗菌和抗炎作用等[3-4]。與傳統(tǒng)藥物相比，活性肽具有易吸收、低毒、高效的競爭優(yōu)勢，在制藥領(lǐng)域有非常好的應用前景。目前常用的制備方法包括發(fā)酵和酶解。同時，肽類物質(zhì)也具有一定的食品風味特性，如呈鮮和增甜。從食物蛋白中提取或者通過氨基酸合成得到的分子量低于3 000 Da的呈味肽，因在天然食品以及加工食品中產(chǎn)生鮮明的特征滋味而引起人們的廣泛關(guān)注，已有多項研究從禽畜肉類、水產(chǎn)品、豆類等各種食物中制備獲得呈味肽[5]。相比于傳統(tǒng)的調(diào)味劑，呈味肽具有低熱量、天然健康的特性，具有非常好的開發(fā)前景和應用價值。因此，本研究以脫脂麥胚為原料，將風味與營養(yǎng)相統(tǒng)一，研究和開發(fā)具有生物活性的麥胚風味肽，為提高小麥副產(chǎn)物綜合利用附加值、提升糧食資源綜合利用率提供新的思路，具有廣闊的市場前景和研究價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂小麥胚芽（蛋白含量約為30%）：河南省鯤華生物技術(shù)有限公司。

風味蛋白酶（食品級）：諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；濃鹽酸、濃硫酸（均為分析純）：天津市化學試劑一廠；無水乙醇、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：美國Sigma公司；2，2'-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽[2，2'-Azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS]：上海麥克林生化科技有限公司；草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、抑菌酶、桿菌肽、乙氨酰-乙氨酰-乙氨酸（標準品）：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司；5'-尿嘧啶核苷酸、5'-鳥嘌呤核苷酸、5'-次黃嘌呤核苷酸、5'-腺嘌呤核苷酸（標準品）：壇墨質(zhì)檢標準物質(zhì)中心。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平（AB204-N）：上海精科實業(yè)有限公司；電熱鼓風干燥箱（GZX-9070MBE）：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋（XMTD-204）：天津歐諾儀器儀表有限公司；pH計（DHSJ-3F）：上海儀電科學儀器股份有限公司；酶標儀（Synergy HTX）：美國伯騰儀器有限公司；氨基酸分析儀（L 8900）：日立公司；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（ISQ 7000）、真空冷凍干燥機（MODULYOD-230）：賽默飛世爾科技公司；離心機（TDZ5-WS）：長沙湘儀離心機儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解麥胚單因素試驗

以脫脂小麥胚芽粉為原料，用磷酸鹽緩沖溶液配制一定底物濃度的麥胚溶液，磁力攪拌器調(diào)漿5min，95℃水浴10 min后冷卻至酶解溫度，加入風味蛋白酶，酶解3 h。經(jīng)90℃水浴滅酶15 min后離心（3 500 r/min、20 min），上清液冷凍干燥后備用。參考張玲等[6]的方法配制雙縮脲試劑測定酶解物中肽含量，并計算麥胚肽得率。單因素試驗設(shè)計如下。

固定酶解溫度為50℃，酶添加量4%，底物濃度4%，以麥胚肽得率為指標，選取酶解pH值為4、5、6、7、8，考察酶解pH值對酶解制備麥胚肽的影響。

固定酶解pH值為6，酶添加量4%，底物濃度4%，以麥胚肽得率為指標，選取酶解溫度30、40、50、60、70℃，考察酶解溫度對酶解制備麥胚肽的影響。

固定酶解pH值為6，酶解溫度為50℃，底物濃度4%，以麥胚肽得率為指標，選取酶添加量2%、3%、4%、5%、6%，考察酶添加量對酶解制備麥胚肽的影響。

固定酶解pH值為6，酶解溫度為50℃，酶添加量4%，以麥胚肽得率為指標，選取底物濃度2%、3%、4%、5%、6%，考察底物濃度對酶解制備麥胚肽的影響。

1.3.2 感官品評

將酶解物配制為10 mg/mL樣液并經(jīng)121℃滅菌20 min，選擇經(jīng)過培訓的10名感官評定員（5男5女，年齡20歲～30歲）組成感官評定小組對其進行品評，感官評分標準如表1所示。

表1 感官評分標準Table 1 Standard of sensory evaluation

1.3.3 揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定

參考孫浩然[7]的方法，選擇頂空固相微萃取技術(shù)對酶解物氣味進行收集，再利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進行鑒定。

1.3.4 游離氨基酸含量的測定

參考吳陽[8]的方法稍作改動，稱取適量樣品充分溶解于超純水后與10%磺基水楊酸以3∶1的體積比混勻，于4℃下靜置1 h后反復低溫離心（10 000 r/min，10 min），取上清液，經(jīng)0.22 μm水膜過濾后上機進行測定。

1.3.5 呈味核苷酸含量的測定

參考呂麗等[9]的方法，稍作改動，采用高效液相色譜法，色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液（pH4.6）與甲醇的體積比97∶3；柱溫30℃；進樣量20μL；檢測波長254 nm；流速0.6 mL/min。樣品經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進樣測定，同時利用標準品的出峰時間及峰面積做線性回歸方程。

1.3.6 有機酸含量的測定

參考GB 5009.157—2016《食品安全國家標準食品中有機酸的測定》[10]，采用高效液相色譜法進行有機酸的測定。

1.3.7 肽分子量分布的測定

參考張佳男[11]的方法，稍作改動，采用高效液相色譜法，色譜條件：TSK-gel 2000 SWXL色譜柱（7.8 mm×30 cm）；流動相為乙腈-水-三氟乙酸體積比20∶80∶0.1；柱溫30 s；流速0.5 mL/min。進樣前用0.22 μm微孔濾膜過濾。以標準品的保留時間和相對分子質(zhì)量的對數(shù)做線性回歸方程。

1.3.8 超濾分離

將酶解物配制成一定濃度的溶液，依次使用截留量為10000Da和3000Da的超濾管，然后以8000 r/min在4℃下離心15 min，收集各組分濾液，-80℃冷凍干燥，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.9 DPPH自由基清除能力的測定

參考Wang等[12]的方法，取一定體積的不同濃度樣品水溶液，加入等體積0.1 mmol/L DPPH的無水乙醇溶液，混勻，室溫避光反應30 min后在517 nm處測得各吸光度，以相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸做對照試驗。DPPH自由基清除率用以下公式計算。

式中：A為樣品+0.1 mmol/L DPPH無水乙醇溶液的吸光度；A0為樣品+無水乙醇溶液的吸光度；A1為水+0.1 mmol/L DPPH無水乙醇溶液的吸光度；A2為水+無水乙醇溶液的吸光度。

1.3.10 ABTS＋自由基清除能力的測定

參考Chen等[13]的方法，將等體積7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L過硫酸鉀溶液混勻，室溫避光反應12 h～16 h后取一定體積混合液經(jīng)無水乙醇稀釋得到ABTS工作液，使其室溫避光放置30 min后在734 nm處的吸光度為0.70±0.02。取40 μL待測液和160 μL ABTS工作液于96孔酶標板反應，測定其在734 nm處的吸光度，以相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸做對照試驗。ABTS＋自由基清除率用以下公式計算。

式中：A0為水+ABTS工作液的吸光度；A1為樣品+ABTS工作液的吸光度；A2為樣品+水的吸光度。

1.3.11 羥自由基清除能力的測定

參考朱楚楚[14]的方法，依次向試管中加入1.0 mL 6.0 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液、1.0 mL 6 mmol/L的硫酸亞鐵溶液和1.0 mL樣品溶液，最后加1.0 mL 6 mmol/L的過氧化氫溶液啟動反應，搖勻后在37℃水浴反應30 min，測定其在510 nm波長處的吸光度，以相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸做對照試驗。羥自由基清除率用以下公式計算。

式中：A0為硫酸亞鐵+過氧化氫+水+水楊酸的吸光度；A1為硫酸亞鐵+過氧化氫+樣品+水楊酸的吸光度；A2為硫酸亞鐵+水+樣品+水楊酸的吸光度。

1.3.12 還原力的測定

參考趙寒青[15]的方法，取不同濃度的樣品溶液各1 mL，依次加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH6.6）和2.5 mL質(zhì)量分數(shù)為1%的亞鐵氰化鉀溶液，渦旋30 s，在50℃水浴條件下反應20 min，迅速冷卻后加入2.5 mL質(zhì)量分數(shù)為10%的三氯乙酸溶液終止反應，混勻離心（3 000 r/min，10 min），取上清液 2.5 mL于試管，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL質(zhì)量分數(shù)為0.1%的氯化鐵溶液后再次混勻，室溫避光放置10 min后于700 nm處測其吸光度，以相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸做對照試驗。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗平行進行3次，試驗結(jié)果以平均值±標準差表示。利用Origin 2019b、GraphPad Prism 8和IBM SPSS Statistics 26進行數(shù)據(jù)分析和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 風味蛋白酶酶解麥胚的單因素試驗結(jié)果

2.1.1 酶解pH值對麥胚肽得率和風味的影響

酶解pH值對麥胚肽得率和風味的影響如圖1所示。

圖1 酶解pH值對麥胚肽得率和風味的影響Fig.1 Effects of pH value of enzymatic hydrolysis on the yield and flavor of wheat germ peptides

在不同酶解pH值條件下利用風味蛋白酶進行麥胚酶解，麥胚肽得率有顯著差異，隨著酶解pH值的提高，肽得率呈現(xiàn)一個先上升后趨于平緩的趨勢，在pH值為7時達到最大，此時麥胚肽得率為（6.11±0.14）%。同時，感官評分結(jié)果表明，酶解pH值的改變對酶解物的咸味和香味有一定影響，且均無異味產(chǎn)生，這可能是由于酶解pH值影響美拉德反應程度的不同從而生成不同風味物質(zhì)。當酶解pH值為7時呈現(xiàn)一定的咸鮮風味和較好的香氣，因此選擇酶解pH7為最佳。

2.1.2 酶解溫度對麥胚肽得率和風味的影響

酶解溫度對麥胚肽得率和風味的影響如圖2所示。

圖2 酶解溫度對麥胚肽得率和風味的影響Fig.2 Effects of enzymatic hydrolysis temperature on the yield and flavor of wheat germ peptides

當酶解溫度由30℃升高到70℃，麥胚肽得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在50℃時達到最大。其原因可能是風味蛋白酶活性在30℃～50℃范圍內(nèi)隨著溫度的升高而提高，蛋白水解度逐漸上升，而當溫度大于60℃時酶活受到抑制導致水解度下降。結(jié)合感官評分結(jié)果，酶解溫度在50℃和60℃時酶解物表現(xiàn)出較好的香氣和鮮味，因此選擇50℃為最佳酶解溫度。

2.1.3 酶添加量對麥胚肽得率和風味的影響

酶添加量對麥胚肽得率和風味的影響如圖3所示。

圖3 酶添加量對麥胚肽得率和風味的影響Fig.3 Effects of enzyme addition on the yield and flavor of wheat germ peptides

隨著蛋白酶添加量的增大，麥胚肽得率不斷提高，當酶添加量大于4%時，麥胚肽得率有所下降并逐漸趨于平緩，可能是反應中的酶達到一定含量時，酶與底物的反應過剩導致反應速度變小，繼續(xù)增大酶添加量，反應體系中的水解度的變化已經(jīng)不明顯。結(jié)合感官評分結(jié)果，在酶添加量介于3%～6%時，酶解物有一定的咸鮮風味，其它味覺感官不突出，但整體呈現(xiàn)一定香氣。綜合上述情況，選擇4%為最佳酶添加量。

2.1.4 底物濃度對麥胚肽得率和風味的影響

底物濃度對麥胚肽得率和風味的影響如圖4所示。

圖4 底物濃度對麥胚肽得率和風味的影響Fig.4 Effects of substrate concentration on the yield and flavor of wheat germ peptides

底物濃度過高，體系的流動性變差，使底物蛋白與酶分子之間的相互運動減弱，降低底物蛋白與酶分子的碰撞概率，進而反應速度減慢；其次，體系中的底物蛋白會在酶的活性位點積累，形成無活性的中間產(chǎn)物，從而抑制水解反應[16]。由圖4可以看到，隨著底物濃度的增加，多肽的得率呈現(xiàn)顯著下降的趨勢。同時，當?shù)孜餄舛葹?%時，鮮、咸味較為突出，其它味覺感官不突出，且呈現(xiàn)一定香氣。綜合上述情況，選擇2%為最佳底物濃度。

2.2 揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定

酶解物中揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定結(jié)果如表2所示。

表2 酶解物中揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定Table 2 Determination of volatile flavor substances in the hydrolysate

經(jīng)過對比特征揮發(fā)性化合物的保留時間和遷移時間，對酶解物的揮發(fā)性風味成分進行定性分析，得到27種化合物，其中包括5種醇類、2種醛類、2種酯類、3種酸類、1種酚類、1種酮類、11種烴類和2種雜環(huán)類，這些化合物構(gòu)成了酶解物的揮發(fā)性風味輪廓。其中，烴類物質(zhì)的含量最高，其次是醇類和酸類。烴類化合物可能是由脂肪氧化降解產(chǎn)生的，且大部分烴類物質(zhì)香氣較弱或無氣味[17-18]。壓榨后，麥胚中的油脂不能完全去除，因此，醇類物質(zhì)可能是由于脫脂麥胚殘油中的不飽和脂肪酸被氧化酶氧化，再被裂解酶或氧化還原酶催化生成[19]。醇類一般具有令人愉悅的氣味，苯乙醇是我國規(guī)定允許使用的食用香料，具有清甜的玫瑰樣香氣。不飽和醇類的閾值較飽和醇低，對風味貢獻大[20]。酸類物質(zhì)是酯類化合物合成的前體物質(zhì)之一，可以由氨基酸降解后通過氧化或還原作用產(chǎn)生，也可通過飽和脂肪酸自身氧化降解產(chǎn)生[21]。正己酸、乙酸和辛酸整體上表現(xiàn)出不愉快的香氣。除此之外，醛類和酯類物質(zhì)也為產(chǎn)物提供了較好的花果樣香氣。其中，醛類物質(zhì)主要來自脂肪的氧化分解或者美拉德反應，閾值較低，對氣味形成的貢獻較大[22-24]。酯類物質(zhì)由醇和羧酸酯化而成，通常為食物提供良好的香氣[25]，如γ-壬內(nèi)酯有濃郁椰子香氣，常用于調(diào)配食用香精。

2.3 游離氨基酸含量的測定

酶解物中游離氨基酸含量如表3所示。

表3 酶解物中游離氨基酸的含量Table 3 Content of free amino acids in the hydrolysate

氨基酸間的相互作用對酶解物的風味有一定的影響[19]。根據(jù)對游離氨基酸滋味特征的描述，游離氨基酸呈味特征以鮮味、甜味、苦味為主[26]，對酶解物中的游離氨基酸的含量進行測定，可以發(fā)現(xiàn)鮮味氨基酸和甜味氨基酸的含量遠低于其閾值，苦味氨基酸中尤其以精氨酸的含量較高，達到10.132 mg/g，這可能是由于過度的酶解，肽中的疏水性氨基酸逐漸暴露在側(cè)鏈的外面，是酶解物呈苦味的原因之一[19]。

2.4 呈味核苷酸含量的測定

酶解物中呈味核苷酸含量如表4所示。

表4 酶解物中呈味核苷酸的含量Table 4 Content of flavoring nucleotides in the hydrolysate

呈味核苷酸的含量與酶解物的風味密切相關(guān)，其中AMP、GMP和IMP是鮮味的重要貢獻者，并與游離氨基酸存在協(xié)同作用[27]。相關(guān)研究分析了酶解物中UMP、GMP、IMP、AMP的含量。GMP和IMP是主要的呈鮮味核苷酸，其閾值分別為0.2 mg/g和1.8 mg/g[28-29]。其中，在酶解物中檢出GMP含量為（0.143±0.026）mg/g。

2.5 有機酸含量的測定

酶解物中有機酸含量如表5所示。

表5 酶解物中有機酸的含量Table 5 Content of organic acids in the hydrolysate

有機酸是主要的酸味物質(zhì)成分，其酸性源于羧基，其含量和種類對產(chǎn)品的風味特性起到非常重要的作用。有機酸會影響感官特性，不僅能通過自身酸味調(diào)節(jié)口腔對其它滋味的感知，又能通過影響體系pH值來調(diào)控滋味物質(zhì)之間的交互作用，從而影響消費者對產(chǎn)品的接受程度[30-31]。有機酸可分為揮發(fā)酸和不揮發(fā)酸，不揮發(fā)酸包括酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸等。其中，酶解物中的酒石酸和琥珀酸的含量相對較高，是主要呈味有機酸。

鮮味作為第5種基本味覺，是由鮮味物質(zhì)與受體結(jié)合產(chǎn)生的味覺感受，根據(jù)化學結(jié)構(gòu)的差異性，鮮味物質(zhì)可分為氨基酸及其鹽類、核苷酸類、有機酸類、肽類等[32]。琥珀酸及其鈉鹽作為有機酸類，被認定屬于鮮味物質(zhì)，貢獻了特殊的鮮味和酸味[33-34]。琥珀酸的閾值為10.6 mg/100 g，在不同的濃度下，琥珀酸會產(chǎn)生強烈的咸味和苦味[35]。

2.6 肽分子量分布的測定

酶解物中肽分子量分布如表6所示。

表6 酶解物中肽分子量分布Table 6 Molecular weight distribution of peptides in the hydrolysate

酶解物中肽分子量主要分布在小于3 000 Da的部分，占總量的（63.93±1.23）%，其次是 3 000 Da～10 000 Da和大于10 000 Da的部分。有研究表明，呈味肽的分子量主要集中在3 000 Da以下[5]，因此，后續(xù)試驗重點研究部分是分子量小于3 000 Da的酶解物。

2.7 抗氧化活性研究

對分子量小于3000Da酶解物的DPPH自由基清除率、ABTS＋自由基清除率、羥自由基清除率和還原力進行測定，以抗壞血酸為陽性對照，結(jié)果如圖5～圖8所示。

圖5 DPPH自由基清除能力的測定Fig.5 Measurement of DPPH free radical scavenging ability

圖6 ABTS＋自由基清除能力的測定Fig.6 Measurement of ABTS＋free radical scavenging ability

圖7 羥自由基清除能力的測定Fig.7 Measurement of hydroxyl free radical scavenging ability

圖8 還原力的測定Fig.8 Determination of reducing power

在濃度為0.1 mg/mL～10.0 mg/mL時，分子量小于3 000 Da的酶解物的DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率、羥自由基清除率和還原力都隨著濃度的增加而增加。其中，分子量小于3 000 Da的酶解物的DPPH自由基清除能力（IC50值為10.327 mg/mL）和還原力相對較弱，遠低于同濃度下的抗壞血酸。在濃度為10.0 mg/mL時，分子量小于3 000 Da的酶解物對ABTS+自由基的清除能力只略低于抗壞血酸，分別為92.22%和99.67%，IC50值為0.448 mg/mL。相同濃度下，分子量小于3 000 Da的酶解物對羥自由基的清除能力也只略低于抗壞血酸，分別為95.51%和99.93%，IC50值為0.574 mg/mL?？傮w而言，分子量小于3 000 Da的酶解物具有較好的體外抗氧化活性。

3 結(jié)論

通過單因素試驗優(yōu)化風味蛋白酶酶解麥胚制備風味活性肽的工藝參數(shù)，并對酶解物中風味物質(zhì)含量、肽分子量分布及其體外抗氧化活性進行了測定。結(jié)果表明，麥胚最佳酶解條件為pH7，底物濃度2%，酶解溫度50℃，酶添加量4%，此時麥胚肽得率達到（8.17±0.70）%。在此工藝條件下，酶解物中的揮發(fā)性風味物質(zhì)以烴類、酸類和醇類物質(zhì)為主，主要呈鮮物質(zhì)天冬氨酸的含量為0.936 mg/g，5'-鳥嘌呤核苷酸的含量為（0.143±0.026）mg/g，琥珀酸的含量為（18.75±2.45）mg/g，使酶解物整體表現(xiàn)出一定的咸鮮滋味并伴有清淡的香氣。同時，體外抗氧化試驗結(jié)果表明分子量小于3 000 Da的酶解物的DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率、羥自由基清除率的IC50值分別為 10.327、0.448、0.574 mg/mL，表現(xiàn)出較好的抗氧化活性。綜上，本文所制備的麥胚酶解物兼具良好的風味特性和抗氧化活性，為充分開發(fā)優(yōu)質(zhì)資源小麥胚芽，提高小麥副產(chǎn)品的市場化應用，促進營養(yǎng)健康食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供參考。