ε-多聚賴(lài)氨酸和谷胱甘肽影響抗真菌藥物對(duì)煙曲霉作用效果

仲?lài)?guó)維， 婁新宇， 徐鳳嬌， 曹佳頤， 呂薈杰

(南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫學(xué)系，江蘇 南京 211166)

煙曲霉是一種重要的人類(lèi)病原真菌，其孢子在環(huán)境中普遍存在。持續(xù)大量吸入這些孢子可以導(dǎo)致鼻竇炎、哮喘，對(duì)免疫缺陷人群來(lái)說(shuō)，侵襲性感染甚至可以引起較高的死亡率[1-4]。迄今為止，三唑類(lèi)藥物是治療侵襲性曲霉病(invasive aspergillosis，IA)的一線抗真菌藥物，主要包括氟康唑(fluconazole，F(xiàn)LC)、伊曲康唑(itraconazol，ITC)以及伏立康唑(voriconazole，VRC)[5-8]。作為目前較常用的全身抗真菌藥物之一，ITC結(jié)構(gòu)環(huán)上3位氮原子能與游離氧競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合細(xì)胞色素P450亞鐵血紅素的鐵離子，最終抑制真菌細(xì)胞膜中14-α-去甲基化酶(Cyp51A/Erg11A)合成麥角甾醇并積累毒性甾醇，導(dǎo)致細(xì)胞膜不完整，菌體無(wú)法生長(zhǎng)[8-9]。然而，近年來(lái)隨著唑類(lèi)藥物在臨床和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛而持續(xù)地使用，煙曲霉唑類(lèi)耐藥率呈上升趨勢(shì)，最終導(dǎo)致唑類(lèi)抗真菌治療無(wú)效[8,10-12]。目前，新型抗真菌藥物棘白菌素類(lèi)(echinocandins)中的卡泊芬凈(caspofungin acetate, CS)正在被推薦為侵襲性曲霉感染的挽救療法，其作用機(jī)理是通過(guò)抑制細(xì)胞壁β-(1,3)葡聚糖的合成，使曲霉細(xì)胞不能形成完整的細(xì)胞壁[9]。與唑類(lèi)藥物情況類(lèi)似，隨著CS的應(yīng)用，臨床上已經(jīng)出現(xiàn)少量耐藥菌株。因此，煙曲霉感染及其對(duì)常見(jiàn)抗真菌藥物的抗藥性正逐步成為人類(lèi)健康的一大威脅，尤其是頻繁的城市改建和人口的大量流動(dòng)都加劇了世界公共衛(wèi)生面臨的這一問(wèn)題的嚴(yán)重性[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)，煙曲霉耐藥的主要機(jī)制為靶點(diǎn)基因突變導(dǎo)致的藥物和靶點(diǎn)結(jié)合力呈不同程度的下降。因此，防止耐藥菌出現(xiàn)的一個(gè)途徑就是尋找不同的藥物組合，利用不同靶點(diǎn)藥物的協(xié)同作用[13]。ε-多聚賴(lài)氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)是一種由小白鏈霉菌(Streptomycesalbulus)經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的多肽類(lèi)物質(zhì)，由25～35個(gè)賴(lài)氨酸殘基通過(guò)α-羥基和ε-氨基之間的酰胺鍵構(gòu)成同型均聚多肽，其分子量為5 kDa左右，具有廣泛的抗菌作用，在人體內(nèi)可分解成必須氨基酸賴(lài)氨酸[14-16]。ε-PL對(duì)釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)以及梨果黑斑病菌(Alternariaalternata)的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，且成濃度依賴(lài)關(guān)系[14,16]。目前的研究表明，ε-PL的抑菌機(jī)制是破壞真菌細(xì)胞膜產(chǎn)生孔隙，影響初級(jí)代謝，如碳水化合物、醇、脂類(lèi)和氨基酸的代謝水平[16]。有研究將ε-PL與乳酸鏈球菌素(nisin)在體外聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)該組合通過(guò)解體細(xì)胞膜產(chǎn)生協(xié)同殺菌效果[16]。谷胱甘肽(glutathione, γ-L-glutamyl-L-cysteinyl-glycine, GSH)是好氧原核生物和真核生物中含量最豐富的硫醇，在許多生物過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，例如防御有害異物、重金屬和活性氧ROS，穩(wěn)定細(xì)胞膜、線粒體膜和細(xì)胞核膜結(jié)構(gòu)[18-19]。GSH的生物合成是由γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶(γ-L-glutamyl-L-cysteine synthetase, γ-GCS)和GSH合成酶連續(xù)兩步催化合成的[18,20]。在構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)中，γ-GCS的編碼基因?yàn)間csA，gcsA基因敲除得到構(gòu)巢曲霉?fàn)I養(yǎng)缺陷型菌株[21]。在GSH和抗真菌藥物作用方面，有研究顯示GSH與抗壞血酸在小鼠體內(nèi)可拮抗氟康唑的抗菌作用[22]?；讦?PL和GSH兩種多肽在體內(nèi)外影響抗菌效果的研究，本研究首次研究了ε-PL和GSH與臨床常見(jiàn)抗真菌藥物ITC、VRC和CS在體外聯(lián)合抗煙曲霉的效果及其可能的作用機(jī)制。此外，通過(guò)敲除煙曲霉谷胱甘肽合成酶基因gcsA和gshA，以此了解煙曲霉細(xì)胞內(nèi)GSH對(duì)唑類(lèi)藥物耐受性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本研究所使用的菌株及來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 菌株及來(lái)源

1.1.2 培養(yǎng)基 ①M(fèi)M基礎(chǔ)培養(yǎng)基：每升含20×Salts(每升含NaNO3120 g, KCl 10.4 g, KH2PO430.4 g, MgSO4·7H2O 10.4 g) 50 mL，微量元素(每升含ZnSO4·7H2O 22 g， H3BO311 g, MnCl2·4H2O 5 g， FeSO4·7H2O 5 g， CoCl2·5H2O 1.6 g, CuSO4·5H2O 1.6 g, (NH4)6MO7O241.1 g, EDTA 50 g) 1 mL，葡萄糖10 g，pH 6.5，固體培養(yǎng)基添加2 g瓊脂粉；②YAG豐富培養(yǎng)基：每升含酵母粉5 g，葡萄糖20 g，微量元素1 mL，固體培養(yǎng)基添加2 g瓊脂粉；③YUU豐富培養(yǎng)基：YAG的基礎(chǔ)上添加5 mmol/L尿苷和10 mmol/L尿嘧啶。培養(yǎng)基的具體配制見(jiàn)參考文獻(xiàn)[9]。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 ε-PL購(gòu)自Sigma公司；GSH購(gòu)自上海阿拉丁有限公司；DMSO購(gòu)自北京索萊寶有限公司；ITC、VRC和CS均購(gòu)自南京森貝伽有限公司；活性氧檢測(cè)試劑盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)購(gòu)自上海碧云天有限公司。試劑均為粉末，純度均>99%，PCR相關(guān)試劑購(gòu)自南京諾唯贊有限公司。多功能酶標(biāo)儀(M200，瑞士Tecan SUNRISE)。

1.2 方法

1.2.1 平板點(diǎn)菌實(shí)驗(yàn) 用0.01%無(wú)菌Tween-80溶液將培養(yǎng)2 d的煙曲霉孢子洗至1.5 mL 離心管中，10 000 r/min,4 ℃離心5 min，用無(wú)菌去離子水清洗兩遍，離心去上清。無(wú)菌生理鹽水重懸孢子，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并將孢子濃度調(diào)整為1×107個(gè)/mL。移液槍吸取2 μL菌懸液點(diǎn)到相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h。

1.2.2 最低抑菌濃度測(cè)定 ITC和VRC用DMSO溶解配制成4 mg/mL儲(chǔ)存液，CS用無(wú)菌水配制成4 mg/mL儲(chǔ)存液。E-test實(shí)驗(yàn)法：使用YAG或添加一定濃度ε-PL和GSH的固體培養(yǎng)基作為基底，取100 μL 1×106個(gè)孢子/mL待測(cè)試菌的孢子懸液和20 mL融化的培養(yǎng)基混勻。略干，然后用滅菌的鑷子夾取E-test試條貼于平板中間，37 ℃培養(yǎng)48 h。ITC、VRC最低抑菌濃度MIC(minimum inhibitory concentration)值判定為100%抑制生長(zhǎng)時(shí)的最低藥物濃度，CS最低有效濃度MEC(minimum effective concentration)值判定為抑制菌絲體生長(zhǎng)呈小而圓形緊縮狀態(tài)時(shí)的最低藥物濃度。

1.2.3gcsA和gshA基因缺失菌株的構(gòu)建 本研究中使用的所有引物見(jiàn)表2，均由南京金斯瑞生物有限公司合成。采用融合PCR結(jié)合同源重組替換的方法進(jìn)行g(shù)csA基因缺失菌株的構(gòu)建。首先，用引物gcsAP1/P3和gcsAP4/P6分別擴(kuò)增長(zhǎng)度約為1 kb的gcsA基因的上下游同源臂，然后用pyr4 F/R從質(zhì)粒pAL5上擴(kuò)增篩選標(biāo)記pyr4基因。再將上述三個(gè)片段混合作為模板，用引物gcsAP2/P5將左同源臂、篩選標(biāo)記和右同源臂融合。最后，將融合片段轉(zhuǎn)入ku80缺失突變體A1160細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)同源重組后，gcsA基因被pyr4基因替換，得到缺失突變體。gshA基因的敲除同上述方法。

表2 本研究所用引物

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè) 黑色透明玻璃底的細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)加入2 mL液體YAG培養(yǎng)基，將待檢測(cè)菌株的孢子(1×105個(gè))加入培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)10 h后，用PBS洗滌菌絲3次，加入終濃度15 μmol/mL的DCFH-DA(2, 7-Dichlorofuorescin Diacetate)，然后37 ℃避光孵育30 min。用PBS洗滌菌絲3次。加入200 μL含有 1 μg/mL ITC、1 μg/mL ITC+1 mg/mL ε-PL或1 μg/mL ITC+10 mg/mL GSH組合的PBS溶液，37 ℃避光孵育3 h。被染色和處理的菌絲體在波長(zhǎng)495 nm的激發(fā)光下，用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)530 nm的發(fā)射熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS的定量。未染色菌絲體作為空白對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 常見(jiàn)氨基酸抗菌效果

前期研究發(fā)現(xiàn)外源添加常見(jiàn)氨基酸能影響煙曲霉對(duì)ITC的耐受性[9]。有些氨基酸例如色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸能拮抗ITC；有些則能增強(qiáng)ITC的殺菌效果，例如賴(lài)氨酸、組氨酸和精氨酸[23]。為了觀察氨基酸單獨(dú)存在時(shí)對(duì)煙曲霉是否具有抑制作用，通過(guò)培養(yǎng)基添加實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)了19種氨基酸(10 mg/mL，pH值6.5～7.0)對(duì)煙曲霉的抑菌效果。結(jié)果表明除組氨酸、半胱氨酸、色氨酸、酪氨酸和賴(lài)氨酸這5種氨基酸抑菌作用明顯外，其他氨基酸均無(wú)明顯的抑菌作用。在添加組氨酸、半胱氨酸和色氨酸時(shí)，煙曲霉菌落相比對(duì)照明顯變??；而在賴(lài)氨酸存在時(shí)，煙曲霉的孢子產(chǎn)量相對(duì)于對(duì)照明顯減少(圖1)。

圖1 19種不同外源性氨基酸對(duì)煙曲霉A1160c的體外作用效果Fig.1 In vitro effects of 19 different exogenous amino acids on A. fumigatus A1160c

2.2 ε-PL與抗真菌藥物的協(xié)同作用

有研究發(fā)現(xiàn)，賴(lài)氨酸能夠增強(qiáng)兩性霉素B的體外抗真菌效果[24]。但由于單體的抗菌肽在復(fù)雜的生物環(huán)境中可被鹽、多陰離子聚合物以及蛋白質(zhì)水解酶迅速降解，從而限制了其治療潛力[25-27]。弱抗真菌肽通過(guò)多聚化形成的多價(jià)肽，如ε-PL，與其單體相比具有更好的抗真菌活性[27]?；谝陨涎芯浚狙芯繉ⅵ?PL與唑類(lèi)藥物中的ITC、VRC，以及棘白菌素類(lèi)藥物CS分別進(jìn)行體外聯(lián)用，檢測(cè)其聯(lián)用效果，探究ε-PL是否可以增強(qiáng)臨床抗真菌藥物對(duì)煙曲霉的活性。結(jié)果如圖2A所示，從菌落大小上來(lái)看，1 mg/mL的ε-PL對(duì)煙曲霉有輕微的抑菌作用，與單獨(dú)使用0.1 μg/mL ITC相比，1 mg/mL ε-PL與0.1 μg/mL ITC聯(lián)用對(duì)煙曲霉的抑制效果最為明顯，1 mg/mL ε-PL與0.1 μg/mL CS聯(lián)用抑菌效果次之，1 mg/mL ε-PL與0.1 μg/mL VRC聯(lián)用抑菌效果排最后。

E-test實(shí)驗(yàn)顯示，1 mg/mL ε-PL可以將ITC、VRC和CS三種抗菌藥物的MIC值分別從2、0.125、0.38 μg/mL下降至1、0.064、0.094 μg/mL(圖2B)。綜上，ε-PL和ITC或CS聯(lián)用具有協(xié)同殺滅煙曲霉的作用，其中以ε-PL聯(lián)合CS的抗菌效果最佳。因此，ε-PL具有成為ITC和CS的協(xié)同增效殺菌劑的潛力。

2.3 GSH與抗真菌藥物的拮抗作用

如圖3A平板點(diǎn)菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，對(duì)照菌A1160c的長(zhǎng)勢(shì)在添加1 mg/mL GSH的平板上與在MM平板上無(wú)明顯區(qū)別，而其長(zhǎng)勢(shì)在GSH和抗真菌藥物CS或ITC同時(shí)存在時(shí)比在CS或ITC單獨(dú)存在時(shí)要好。據(jù)此結(jié)果可知，GSH能夠拮抗CS或ITC的活性。

為了探明敲除煙曲霉GSH合成的相關(guān)基因?qū)熐股L(zhǎng)的影響，將煙曲霉γ-GCS基因gcsA(locus_tag=AFUB_035300)和GSH合成酶基因gshA(locus_tag=AFUB_054160)分別在A1160菌株中做了定點(diǎn)敲除。結(jié)果顯示，相比對(duì)照菌株A1160c，在MM平板上gcsA基因缺失菌株(命名為ΔgshA)無(wú)法生長(zhǎng)，而gshA基因敲除菌株(命名為ΔgshA)的生長(zhǎng)情況與A1160c幾乎一致(圖3)。另外，抗真菌藥物作用于ΔgshA時(shí)沒(méi)有表現(xiàn)出耐藥或者更加敏感的表型(圖3)。

2.4 外源添加GSH對(duì)ΔgcsA致死表型的影響

ΔgcsA在MM培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，推測(cè)其可能和構(gòu)巢曲霉ΔgcsA一樣都是營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株[21]。為了研究培養(yǎng)基中添加GSH能否回補(bǔ)煙曲霉ΔgcsA的生長(zhǎng)，將A1160c、ΔgcsA、ΔgshA三株菌在一系列濃度梯度的GSH平板上培養(yǎng)，如圖4所示，8 mmol/L的GSH更能部分彌補(bǔ)ΔgcsA的營(yíng)養(yǎng)缺陷表型。表明γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸是菌體生長(zhǎng)必需的多肽，可以代替GSH，而外源補(bǔ)充的GSH不能完全被ΔgshA菌體吸收利用。

圖2 ε-PL與抗真菌藥物的協(xié)同抗菌作用Fig.2 Synergistic effect of ε-PL and antifungal drugs on A1160cA： YAG平板點(diǎn)菌測(cè)試ε-PL(1 mg/mL)與ITC、VRC、CS(0.1 μg/mL)三種抗真菌藥物聯(lián)用時(shí)的抗菌效果；B： ε-PL(1 mg/mL)與ITC、VRC、CS(0.1 μg/mL)三種抗真菌藥物聯(lián)用的E-test藥敏試驗(yàn)A： Effect of ε-PL (1 mg/mL) in combination with ITC, VRC or CS (0.1 μg/mL) on A1160c when cultured on YAG agar plates; B： E-test showing synergistic antifungal effect of ε-PL (1 mg/mL) and ITC, VRC, or CS (0.1 μg/mL)

圖3 GSH與抗真菌藥物的聯(lián)用對(duì)A1160c和ΔgshA的作用效果Fig.3 The effect of GSH combined with antifungal drugs and GSH on the A1160c and ΔgshA strainsA： MM或MM添加抗真菌藥物和GSH的平板上點(diǎn)菌培養(yǎng)48 h比較A1160c和ΔgshA菌落表型；B： 診斷PCR驗(yàn)證相比A1160c，ΔgshA菌株中的gshA基因全長(zhǎng)被pyr4基因替代A： Colony comparison of wild-type (A1160c) and ΔgshA. Strains were grown on MM agar plates supplemented with ITC, VRC, CS and GSH at the indicated concentrations for 48 h; B： PCR analysis showing the full-length gshA was replaced by pyr4 gene in ΔgshA

圖4 ΔgcsA和ΔgshA在添加不同濃度GSH的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況Fig.4 The growth of ΔgcsA and ΔgshA on medium supplemented with the indicated concentrations of GSH

2.5 ITC和ε-PL聯(lián)合用藥時(shí)菌體內(nèi)ROS含量變化

已有研究發(fā)現(xiàn)ITC可以刺激菌體內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，從而增強(qiáng)其抗菌作用，如H2O2可參與多種信號(hào)途徑的活化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[22，28]。為確認(rèn)ε-PL和GSH分別在ITC抗菌中的作用效果是否與菌體內(nèi)ROS的濃度有關(guān)，檢測(cè)了ITC單獨(dú)作用以及分別與ε-PL和GSH聯(lián)用時(shí)菌體內(nèi)ROS的含量。結(jié)果如圖5A所示，在1 μg/mL ITC的基礎(chǔ)上分別加入1 mg/mL ε-PL或10 mg/mL GSH刺激菌絲體時(shí)，ε-PL顯著地增強(qiáng)了ITC刺激菌體內(nèi)產(chǎn)生ROS的能力，而GSH則減少了ITC刺激菌體細(xì)胞產(chǎn)生的ROS。該結(jié)果與先前的研究發(fā)現(xiàn)，ε-PL通過(guò)刺激細(xì)胞內(nèi)ROS生成而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而GSH可以降低唑類(lèi)藥物誘導(dǎo)的ROS的結(jié)果一致[16，22]。為進(jìn)一步證明ROS與ITC聯(lián)用時(shí)的協(xié)同作用，測(cè)試了0.1 μg/mL ITC聯(lián)合1 mmol/L H2O2的抗菌效果，表明H2O2確實(shí)能夠增強(qiáng)ITC的抗菌活性(圖5B)。

圖5 ROS參與ε-PL與ITC的協(xié)同作用Fig.5 ROS involves in synergistic effect of ε-PL and ITCA:ITC單獨(dú)作用以及分別與ε-PL和GSH聯(lián)用時(shí)菌體內(nèi)的ROS含量。熒光強(qiáng)度值為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值(***P<0.001)；B:1 mmol/L H2O2增強(qiáng)了0.1 μg/mL ITC的抗菌活力A:ROS measurement in mycelia when ITC was alone and ITC combined with ε-PL or GSH. Fluorescence intensity values are presented as the means ± SD of three biological replicates and analyzed by one-way ANOVA with unpaired Student′s t-test (***P<0.001); B:Combination of 1 mmol/L H2O2 and 0.1 μg/mL ITC enhanced the activity against A. fumigatus

3 討 論

通過(guò)平板測(cè)試、MIC值測(cè)定、基因敲除和ROS檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)研究了常見(jiàn)氨基酸以及常見(jiàn)多肽ε-PL和GSH對(duì)體外抗煙曲霉效果的影響。常見(jiàn)氨基酸中只有組氨酸、半胱甘酸、色氨酸、酪氨酸和賴(lài)氨酸這5種氨基酸有一定程度的抑菌作用。賴(lài)氨酸多聚化形成的ε-PL與ITC聯(lián)用產(chǎn)生抗真菌的協(xié)同作用，推測(cè)該作用機(jī)制為ε-PL可以增強(qiáng)ITC刺激菌體細(xì)胞產(chǎn)生ROS的能力。相比與唑類(lèi)藥物聯(lián)用，ε-PL與CS聯(lián)用產(chǎn)生了更高強(qiáng)度的協(xié)同作用。ε-PL可以破壞真菌細(xì)胞膜，而CS的靶點(diǎn)是細(xì)胞壁，推測(cè)二者通過(guò)作用于不同的靶點(diǎn)從而發(fā)揮協(xié)同抗菌效果。

GSH在生物體內(nèi)具有解毒和消除ROS的作用，生物體缺少GSH合成的關(guān)鍵酶GCS將無(wú)法生長(zhǎng)，必須通過(guò)外源攝入補(bǔ)充。本研究發(fā)現(xiàn)gcsA基因?qū)τ跓熐股L(zhǎng)尤為重要，缺失后即使外源添加不同濃度的GSH也無(wú)法完全恢復(fù)至正常的生長(zhǎng)表型。已有研究指出，抗壞血酸和GSH等具有還原性的物質(zhì)可以拮抗氟康唑的抗菌活性[22]。本研究發(fā)現(xiàn)GSH不僅對(duì)ITC有拮抗作用，同時(shí)對(duì)CS也有拮抗作用。結(jié)合ROS檢測(cè)結(jié)果，認(rèn)為GSH與抗真菌藥物的拮抗作用不是直接作用于藥物的靶點(diǎn)，而是通過(guò)消除上述抗真菌藥物誘導(dǎo)菌體細(xì)胞產(chǎn)生的ROS而實(shí)現(xiàn)的。

活性氧ROS是由分子氧衍生而來(lái)的各種分子，可對(duì)DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)造成氧化損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[16]。除抑制麥角甾醇合成特定作用方式，很多唑類(lèi)藥物在抗真菌過(guò)程中一般具有ROS誘導(dǎo)作用，而誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS有助于增強(qiáng)抗真菌藥物的抗菌效果[22]。相反，淬滅或減少唑類(lèi)誘導(dǎo)的ROS積累則導(dǎo)致唑類(lèi)抗真菌活性顯著降低，產(chǎn)生一定程度的藥物耐受。本研究也表明ε-PL以及GSH與抗真菌藥物在體外的聯(lián)合作用與ROS的生成和消除有著密切聯(lián)系，這一發(fā)現(xiàn)可為臨床抗真菌感染的聯(lián)合用藥治療策略提供參考。