多株功能菌種混合培養(yǎng)條件的響應(yīng)面優(yōu)化及其生長(zhǎng)關(guān)系

白紅娟 , 衛(wèi)燕紅, 李 斌, 王海賓, 楊官娥, 蔣雪琴, 胡錦俊, 宋 雨

(1. 中北大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院， 山西 太原 030051；2. 山西醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 山西 太原 030001)

微生物制劑在治理農(nóng)田土壤重金屬(鉛、鎘、鉻、鋅和銅等)污染和抑制病蟲害等方面具有綠色、經(jīng)濟(jì)、高效的優(yōu)勢(shì)[1]。目前，常用的制劑有光合細(xì)菌、芽胞桿菌、乳酸桿菌等單一菌劑[2-8]，以及多株菌種按一定比例組成的復(fù)合菌劑[9-12]。由于單一菌劑和復(fù)合菌劑制備有自身的局限性，因此開發(fā)混合培養(yǎng)方法制備多株功能菌種制劑具有重要意義。與單一菌種培養(yǎng)相比，混合培養(yǎng)的工藝簡(jiǎn)單，成本較低，菌株之間的相互協(xié)同共生能充分發(fā)揮群體的聯(lián)合作用，促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)繁殖，底物被充分利用，提高生物量與菌株抗逆性，降低染菌率，從而取得最佳應(yīng)用效果[13]。Nguyen等[14]采用酵母菌-醋酸菌混菌培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)混合培養(yǎng)可顯著提高活菌數(shù)和生理代謝功能；許麗娟等[15]將釀酒酵母和干酪乳桿菌混合培養(yǎng)與單株培養(yǎng)進(jìn)行比較，兩者的活菌數(shù)各增加了0.39×108cfu/mL和2.53×108cfu/mL。同時(shí)，混合培養(yǎng)能產(chǎn)生更多的代謝產(chǎn)物或新的代謝產(chǎn)物。例如，將醋酸桿菌和乳酸桿菌混合培養(yǎng)，不僅能夠增加原有代謝產(chǎn)物異戊酸、乙酸乙酯、甲酸辛酯的含量，還會(huì)產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物2,3-丁二酮[16]。不同菌種之間的混合培養(yǎng)不僅能夠形成穩(wěn)定的菌群，還能增加培養(yǎng)液中還原糖和有機(jī)酸的含量，促進(jìn)多酚化合物的代謝[17]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)光合細(xì)菌單一菌劑能有效修復(fù)鉛、鎘或鉻[4-5]污染的土壤；文獻(xiàn)報(bào)道沼澤紅假單胞菌和枯草芽胞桿菌按一定比例組成的復(fù)合菌劑能修復(fù)鎘污染土壤，且能促進(jìn)作物生長(zhǎng)[11]；植物乳酸桿菌單一菌劑能夠防治病原微生物并修復(fù)污染土壤中銅和鋅[7]。為此，本研究將光合細(xì)菌(PSB)、枯草芽胞桿菌(BS)和植物乳酸桿菌(LP)進(jìn)行混合培養(yǎng)，利用單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基配方以及培養(yǎng)條件，通過(guò)功能菌的加性模型法、生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)以及混合培養(yǎng)的生長(zhǎng)關(guān)系分析它們之間的生長(zhǎng)關(guān)系，以期為多功能菌劑的混合培養(yǎng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 光合細(xì)菌(Photosynthetic bacteria，PSB)，包括球形紅細(xì)菌(Rhodobactersphaeroides)H菌株、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)N菌株和深紅紅螺菌(Rhodospirilliumrubrum)M菌株，均由山西大學(xué)光合細(xì)菌研究室分離、鑒定并保存。植物乳酸桿菌(Lactobacillusplantarum, LP)為中北大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室保存，枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis, BS)購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基 光合細(xì)菌(PSB)培養(yǎng)基：蘋果酸2.5 g，酵母膏1.0 g，(NH4)2SO41.25 g，MgSO40.2 g，CaCl20.07 g，K2HPO40.9 g，KH2PO40.6 g，pH值為7，蒸餾水 1 000 mL；枯草芽胞桿菌(BS)和植物乳酸桿菌(LP)培養(yǎng)基分別采用NB和MRS培養(yǎng)基。功能菌培養(yǎng)基以光合細(xì)菌(PSB)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑及儀器設(shè)備 蘋果酸、(NH4)2SO4、MgSO4、CaCl2等均為分析純，酵母膏為生物試劑，購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。高壓蒸汽滅菌鍋(BXM-30R，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；分析天平(AL204，梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；超凈操作臺(tái)(SW-CJ-1F，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；人工氣候箱(KRQ-300，上海德州市昊誠(chéng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；高速離心機(jī)(HC-3018，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化 分別將實(shí)驗(yàn)室保存的球形紅細(xì)菌H菌株、沼澤紅假單胞菌N菌株以及深紅紅螺菌M菌株于PSB液體培養(yǎng)基中活化，將這3株細(xì)菌按活菌數(shù)1∶1∶1混合培養(yǎng)48 h，即為PSB種子液。將BS和LP分別接種于NB和MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，備用。

1.2.2 菌株抑菌試驗(yàn) 濾紙片法[18]測(cè)定功能菌之間的抑菌情況。向每個(gè)加有固體混合培養(yǎng)基的平板中，各加入100 μL的上述三種菌懸液(活菌數(shù)均為1×106cfu/mL)，涂布均勻后，于平板中等距離放入4個(gè)直徑為6.00 mm無(wú)菌濾紙片，在3個(gè)濾紙片上分別滴加15 μL上述三種菌液中的一種菌懸液(活菌數(shù)均為1×106cfu/mL)，另外一個(gè)濾紙片滴加無(wú)菌水作對(duì)照，培養(yǎng)48 h，觀察抑菌圈產(chǎn)生狀況，每次試驗(yàn)做3個(gè)平行。

1.2.3 功能菌混合培養(yǎng)條件的單因素及響應(yīng)面優(yōu)化 ① 功能菌混合培養(yǎng)條件優(yōu)化的單因素試驗(yàn)：以PSB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將功能菌(PSB種子液∶BS∶LP=1∶0.6∶0.3，活菌數(shù)比)接種到250 mL錐形瓶中，裝液量為100 mL，光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，分別考察以下因素對(duì)功能菌菌株生長(zhǎng)的影響：外加碳源 (葡萄糖、果糖、蔗糖或淀粉)，碳源添加量(5、10、15和20 g/L)，氮源1.25 g (蛋白胨、黃豆粉、硫酸銨、氯化銨或尿素)。這幾種功能菌生長(zhǎng)的適宜溫度范圍均為20～40 ℃，PSB和BS適宜的pH范圍為5～9，LP適宜的pH為6.5左右，設(shè)置培養(yǎng)溫度20、25、30、35、40 ℃，初始pH 5、6、7、8、9，接種量為接種后的初始培養(yǎng)活菌數(shù)分別為1.26×109、1.58×109、1.90×109、2.22×109、2.54×109cfu/mL，培養(yǎng)時(shí)間12、24、36、48、60 h?；罹鷶?shù)的測(cè)定采用平板菌落計(jì)數(shù)法。② 功能菌混合培養(yǎng)條件的響應(yīng)面優(yōu)化：在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[19]選擇對(duì)功能菌混合培養(yǎng)條件有顯著影響的3個(gè)因素培養(yǎng)溫度(A)、初始pH(B)、培養(yǎng)時(shí)間(C)為自變量，以總活菌數(shù)(Y)為響應(yīng)變量，利用Design-Expert 10.0軟件進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化菌種混合培養(yǎng)條件的實(shí)驗(yàn)因素及水平Table 1 Response surface methodology for optimizing mixed culture conditions of strains

1.2.4 功能菌混合培養(yǎng)的生長(zhǎng)關(guān)系 ① 加性模型法對(duì)微生物兩兩相互作用類型的預(yù)測(cè)：參照文獻(xiàn)[20]方法，利用加性模型計(jì)算相互作用分?jǐn)?shù)。相互作用分?jǐn)?shù)計(jì)算公式：

式中，α1、α2和α3分別代表PSB和BS、PSB和LP、BS和LP兩兩混合培養(yǎng)的相互作用分?jǐn)?shù)，NCO1、NCO2和NCO3分別代表PSB和BS、PSB和LP、BS和LP兩兩混合培養(yǎng)48 h的活菌數(shù)，NPSB、NBS和 NLP分別代表PSB、BS和LP純培養(yǎng)48 h的活菌數(shù)。α>0表示協(xié)同作用，α<0表示拮抗作用。② 功能菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型分析：選擇修正的Gompertz[21]方程式對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到待估參數(shù)以及擬合曲線。

式中，t為時(shí)間(h)；yt為t時(shí)的菌液濃度(109cfu/mL)；ymin為最小菌液濃度(109cfu/mL)；A為菌數(shù)增長(zhǎng)的對(duì)數(shù)值；μmax為最大比生長(zhǎng)速率(h-1)；λ為延滯期(h)。③ 功能菌混合培養(yǎng)的生長(zhǎng)關(guān)系：測(cè)定3種功能菌在最佳培養(yǎng)條件下混合培養(yǎng)與純培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)胞生長(zhǎng)量, 通過(guò)比較兩種培養(yǎng)條件下細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的繁殖代數(shù)(N)、生長(zhǎng)速率常數(shù)(R)與世代時(shí)間(G)的差異，分析3種功能菌混合培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)關(guān)系。計(jì)算公式：繁殖代數(shù)N=3.322(lgx2-lgx1)；生長(zhǎng)速率常數(shù)R=N/(t2-t1)；世代時(shí)間G=1/R。式中，t1、t2為菌種進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期初期與末期的培養(yǎng)時(shí)間；x2、x1為菌種進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期初期與末期的活菌數(shù)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 利用軟件Design-Expert 10.0對(duì)響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差值，采用Microsoft Excel 2019和Origin 8.0軟件分析與作圖，運(yùn)用SPSS22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株抑菌試驗(yàn)分析

菌株抑菌試驗(yàn)是鑒定菌株間能否共存的常用方法，試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 3種功能菌的抑菌情況Fig.1 Bacteriostasis situation of the three functional strains

從圖1可以看出，濾紙周圍無(wú)抑菌圈，說(shuō)明這三種功能菌PSB(H菌株、N菌株和M菌株)、BS和LP之間無(wú)抑制作用，可以共存，因此這三種功能菌可以混合培養(yǎng)。

2.2 功能菌混合培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件優(yōu)化的單因素試驗(yàn)

對(duì)功能菌混合培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以促進(jìn)混合菌株的生長(zhǎng)。圖2為功能菌混合培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件優(yōu)化的單因素試驗(yàn)結(jié)果。由圖2A可知，在混合培養(yǎng)過(guò)程中，葡萄糖作為外加碳源時(shí)，BS和LP的活菌數(shù)最高，分別為3.84×109cfu/mL和1.37×109cfu/mL；而蔗糖作為外加碳源時(shí)，PSB的活菌數(shù)最高，為10.4×109cfu/mL?？偟膩?lái)說(shuō)，這3種菌在這4種外加碳源中均能很好生長(zhǎng)，而蔗糖作為外加碳源時(shí)的總菌數(shù)最高，為13.52×109cfu/mL，因此，選擇蔗糖作為混合菌混合培養(yǎng)的外加碳源。由圖2B可知，當(dāng)蔗糖添加量為10 g/L時(shí)，總活菌數(shù)最高，再增加蔗糖用量時(shí)，總活菌數(shù)反而會(huì)下降，因此選擇10 g/L作為蔗糖的添加量。由圖2C可知，當(dāng)硫酸銨作為氮源時(shí)，PSB、BS和LP均生長(zhǎng)最好，總活菌數(shù)最多，因此選擇硫酸銨作為菌種混合培養(yǎng)的氮源。由圖2D可知，隨著培養(yǎng)溫度的不斷升高，PSB、BS和LP三者的活菌數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)培養(yǎng)溫度為30 ℃時(shí)，除BS菌株(35 ℃時(shí)活菌數(shù)最高)外，其余活菌數(shù)均最高，總活菌數(shù)為13.52×109cfu/mL；再隨著溫度的升高，總活菌數(shù)降低，可能是溫度過(guò)高影響了菌株的酶活性。由圖2E可知，隨著初始pH由酸性向堿性變化時(shí)，活菌數(shù)呈先上升后下降趨勢(shì)，初始pH 6～8時(shí)，PSB、BS和LP的活菌數(shù)無(wú)顯著差異，但pH 5和pH 9時(shí)，活菌數(shù)明顯低于pH 7時(shí)的活菌數(shù)，可能是pH過(guò)高或過(guò)低會(huì)破壞酶的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶的活性降低。由圖2F可知，接種量對(duì)活菌數(shù)沒有顯著影響，接種量在接種后的初始活菌數(shù)為1.90×109cfu/mL時(shí)，總活菌數(shù)增長(zhǎng)最大，所以選擇該接種量為最佳接種量。由圖2G可知，PSB、BS和LP的活菌數(shù)均隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)呈先上升后下降趨勢(shì)，24 h時(shí)三者的活菌數(shù)最高，總活菌數(shù)達(dá)到13.52×109cfu/mL，之后活菌數(shù)逐漸降低。

圖2 碳源種類(A)、碳源添加量(B)、氮源種類(C)、培養(yǎng)溫度(D)、初始pH(E)、接種量(F)和培養(yǎng)時(shí)間(G)對(duì)混合功能菌生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of carbon source (A), carbon source addition (B), nitrogen source (C), culture temperature (D),initial pH (E), inoculum(F)and culture time (G) on growth of mixed functional strains字母不同表示差異顯著性(P<0.05)Different letters indicate significant difference (P<0.05)

2.3 菌種混合培養(yǎng)條件響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選出對(duì)功能菌混合培養(yǎng)條件影響顯著的3個(gè)因素培養(yǎng)溫度(A)、初始pH (B)、培養(yǎng)時(shí)間(C)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2，方差分析見表3。由表3可知，回歸模型(P<0.01)表明方程模型極顯著，失擬項(xiàng)值(P=0.928 7>0.05)，失擬項(xiàng)不顯著。該回歸模型的總決定系數(shù)R2=0.999 8，說(shuō)明該模型可信度高，擬合程度較好，試驗(yàn)誤差小，因此該回歸方程模型成立，能夠準(zhǔn)確分析總活菌數(shù)與培養(yǎng)溫度(A)、初始pH(B)及培養(yǎng)時(shí)間(C)3個(gè)因素之間的關(guān)系及其交互作用的影響?；貧w模型的一次項(xiàng)A、B、C、交互項(xiàng)AC、BC及二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)活菌數(shù)影響極顯著(P<0.01)，交互項(xiàng)AB對(duì)活菌數(shù)影響不顯著(P>0.05)。通過(guò)F值和顯著水平得到影響功能菌生長(zhǎng)的各因素順序?yàn)榕囵B(yǎng)時(shí)間(C)>培養(yǎng)溫度(A)>初始pH(B)。

通過(guò)軟件Design Expert 10.0模擬，響應(yīng)面可以直觀地看出培養(yǎng)溫度、初始pH、培養(yǎng)時(shí)間3個(gè)因素交互作用對(duì)活菌數(shù)的影響(圖3)。圖3中曲面弧度表示兩個(gè)因素共同作用對(duì)活菌數(shù)的影響程度，弧度越大表明影響作用越強(qiáng)烈，反之越弱。3因素兩兩交互項(xiàng)對(duì)活菌數(shù)影響的強(qiáng)弱順序?yàn)锳C>BC>AB。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 響應(yīng)面二元回歸方程方差分析結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面軟件分析結(jié)果，功能菌混合培養(yǎng)的最佳條件為培養(yǎng)溫度31.5 ℃、初始pH值7.1，培養(yǎng)時(shí)間28.0 h。最佳培養(yǎng)條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到PSB活菌數(shù)為(10.55±0.23)×109cfu/mL，BS活菌數(shù)為(2.49±0.11)×109cfu/mL，LP活菌數(shù)為(0.86±0.08)×109cfu/mL，各個(gè)功能菌的活菌數(shù)均有所上升。根據(jù)每種功能菌的活菌數(shù)計(jì)算得出3種菌的總活菌數(shù)為13.9×109cfu/mL，與模型預(yù)測(cè)的最高總活菌數(shù)(14.01×109cfu/mL)相比，相對(duì)誤差僅為0.79%，說(shuō)明該模型具有準(zhǔn)確性和有效性。

圖3 各因素交互作用對(duì)混合菌種生長(zhǎng)的影響Fig.3 The interaction of various factors on the growth of mixed strains

2.4 3種功能菌混合培養(yǎng)的生長(zhǎng)關(guān)系

2.4.1 兩菌混合培養(yǎng)過(guò)程分析 根據(jù)加性模型計(jì)算結(jié)果得出，相互作用分?jǐn)?shù)α1、α2、α3分別為0.087、0.399、0.145，均大于0，初步推測(cè)這3種功能菌兩兩之間為協(xié)同作用。

2.4.2 菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析 菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型擬合結(jié)果如圖4和表4所示。在圖4中，擬合值與實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本保持一致，擬合菌體生長(zhǎng)曲線與測(cè)得的實(shí)驗(yàn)值保持同步變化，且都存在一個(gè)延遲期，隨后進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，最后到達(dá)穩(wěn)定期。除此之外，與純培養(yǎng)相比，三者的活菌數(shù)都有不同程度的提高，混合培養(yǎng)條件下PSB為優(yōu)勢(shì)菌種，活菌數(shù)增加明顯，表明混合培養(yǎng)對(duì)PSB的促進(jìn)作用最大，BS和LP的活菌數(shù)增長(zhǎng)幅度較小。由表4可知，各方程的相關(guān)系數(shù)均在0.95以上，修正的Gompertz方程能較好地反映混合前后3種功能菌的生長(zhǎng)過(guò)程，模型擬合良好，能準(zhǔn)確反映功能菌混合培養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中菌體生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。對(duì)各功能菌純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)特征參數(shù)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，混合后3種功能菌的最大比生長(zhǎng)速率μmax均增大，延滯期λ均減小，說(shuō)明混合培養(yǎng)能夠促進(jìn)菌株的生長(zhǎng)。

圖4 PSB(a)、BS(b) 和 LP(c)的生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve of PSB(a)、BS(b) and LP(c)

2.4.3 功能菌混合培養(yǎng)的生長(zhǎng)關(guān)系 通過(guò)生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程計(jì)算得出各功能菌純培養(yǎng)時(shí)和混合培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)特征參數(shù)，結(jié)果見表5。從表5中可以看出，PSB、BS和LP在混合培養(yǎng)時(shí)，其生長(zhǎng)速率均表現(xiàn)出比純培養(yǎng)快，世代時(shí)間比純培養(yǎng)短的特征。其中，混合培養(yǎng)PSB和LP的生長(zhǎng)速率常數(shù)均分別提高了0.03 h-1，世代時(shí)間分別提高了7.0 h和4.3 h，極大地提高了生長(zhǎng)效率；而混合培養(yǎng)BS相對(duì)來(lái)說(shuō)提高的少一些，生長(zhǎng)速率和世代時(shí)間分別提高了0.02 h-1和2.0 h。因此，實(shí)驗(yàn)表明PSB、BS和LP三者之間存在互為有利的互生關(guān)系。

表4 PSB、BS和LP的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)

表5 功能菌在不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)特征比較

3 討 論

微生物生長(zhǎng)不僅取決于菌種本身的特性，還需要合適的培養(yǎng)條件。培養(yǎng)條件的優(yōu)化是菌株應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中所經(jīng)歷的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，直接關(guān)系到菌劑的質(zhì)量和生產(chǎn)效益[22]。本研究通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化混合功能菌的培養(yǎng)條件，促進(jìn)混合功能菌的生長(zhǎng)，為功能菌的混合培養(yǎng)提供參考。本研究中PSB以蘋果酸為碳源，BS和LP以糖類為碳源，考察添加糖類作為混合菌的外加碳源，用量參照NB和MRS培養(yǎng)基；這3種菌均能利用酵母膏生長(zhǎng)，因此以BS和LP能夠利用的幾種常用氮源為研究對(duì)象，考察不同氮源對(duì)混合菌的影響，用量參照光合細(xì)菌培養(yǎng)基中(NH4)2SO4的用量。單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果表明，功能菌混合培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)條件為外加碳源10 g/L蔗糖，氮源1.25 g/L (NH4)2SO4，培養(yǎng)溫度31.5 ℃，初始pH 7.1，接種量為接種后的初始活菌數(shù)1.90×109cfu/mL，培養(yǎng)時(shí)間28.0 h。這3種菌混合培養(yǎng)后，活菌數(shù)均有不同程度的提高。韓梅等[23]的研究成果也表明，混合培養(yǎng)能夠促進(jìn)多菌株生長(zhǎng)，提高微生物活性。此次試驗(yàn)證實(shí)響應(yīng)面優(yōu)化PSB、BS和LP的培養(yǎng)條件具有可行性，為進(jìn)一步綜合利用菌株的混合培養(yǎng)提供參考。

在微生物培養(yǎng)過(guò)程中，可以通過(guò)建立數(shù)學(xué)模型實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物動(dòng)態(tài)變化的快速預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)，了解微生物代謝過(guò)程[24]。Deseure等[25]以乳酸作為碳源，在準(zhǔn)連續(xù)模式下運(yùn)行的光-生物反應(yīng)器中培養(yǎng)莢膜紅細(xì)菌時(shí)，通過(guò)Gompertz模型的建立,計(jì)算該菌的生長(zhǎng)，有助于連續(xù)發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程的自動(dòng)化和控制。宋增光等[26]通過(guò)研究發(fā)酵過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，建立紫紅曲菌發(fā)酵薏米的菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型，模型的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值擬合效果良好，所建Logistic模型能較好反映紫紅曲菌發(fā)酵薏米過(guò)程中的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)變化。Sharma等[27]使用修正的Logistic模型模擬植物乳桿菌CRA52在乳清滲透培養(yǎng)基中的增長(zhǎng)，該模型很好地解釋了植物乳桿菌CRA52的生長(zhǎng)行為以及乳酸和植物乳桿菌素的形成。本研究選擇修正的Gompertz方程擬合出菌株純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線，分析各功能菌生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，直觀地了解各功能菌的生長(zhǎng)過(guò)程，通過(guò)模型的建立實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物動(dòng)態(tài)變化的快速預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)分析菌種混合培養(yǎng)與純培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)特征，確定混合菌的生長(zhǎng)關(guān)系。馮栩等[28]將分離的4株功能菌進(jìn)行純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)，通過(guò)構(gòu)建動(dòng)力學(xué)模型對(duì)各菌種在不同時(shí)間的菌體生長(zhǎng)量進(jìn)行預(yù)測(cè)，進(jìn)而比較各菌純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)特征參數(shù)，判斷混合培養(yǎng)條件下各個(gè)菌種之間的生長(zhǎng)關(guān)系。謝航等[29]通過(guò)比較地衣芽胞桿菌、莢膜紅假單胞菌和假絲酵母菌在純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)條件下的繁殖代數(shù)、生長(zhǎng)速率常數(shù)與世代時(shí)間的差異，確定這3種功能菌混合培養(yǎng)的生長(zhǎng)關(guān)系。本研究根據(jù)動(dòng)力學(xué)方程求出PSB、BS和LP純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)特征參數(shù)，隨著生長(zhǎng)速率常數(shù)的提高和世代時(shí)間的縮短，初步證明了PSB、BS和LP對(duì)彼此的生長(zhǎng)具有不同程度的促進(jìn)作用，三者之間為互為有利的互生關(guān)系。其相互促進(jìn)生長(zhǎng)的原因可能是培養(yǎng)前期BS的生長(zhǎng)消耗了其中的氧氣，為PSB和LP的生長(zhǎng)提供了厭氧環(huán)境；PSB的光能代謝過(guò)程可以將純培養(yǎng)中單一的反應(yīng)進(jìn)行徹底，進(jìn)一步提高活菌數(shù)；LP維持了混合菌種生長(zhǎng)過(guò)程中的pH。因此這3種功能菌混合培養(yǎng)后，活菌數(shù)均有不同程度的提高，這與李勤生等[30]研究的光合細(xì)菌與異養(yǎng)細(xì)菌混合培養(yǎng)能夠相互促進(jìn)生長(zhǎng)的結(jié)論一致，可能是由于菌種之間的相互協(xié)同共生作用促進(jìn)了微生物的生長(zhǎng)繁殖。此次試驗(yàn)僅測(cè)定了混合培養(yǎng)過(guò)程的活菌數(shù)，對(duì)培養(yǎng)過(guò)程中的溶解氧、pH、代謝產(chǎn)物尚未進(jìn)行檢測(cè)，需通過(guò)進(jìn)一步試驗(yàn)進(jìn)行分析，初步探明菌種之間的協(xié)同共生作用機(jī)理，為混合培養(yǎng)過(guò)程進(jìn)行更有效的理論指導(dǎo)。

復(fù)合微生物菌劑中含有多類菌種，通過(guò)微生物菌種之間的生命活動(dòng)及其代謝產(chǎn)物的協(xié)同共生作用，修復(fù)重金屬污染和防治病原微生物的效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單一菌種。例如，在鎘、砷污染嚴(yán)重的土壤中，施用沼澤紅假單胞菌、膠質(zhì)紅假單胞菌、糞假單胞菌、苯甲酸鹽紅長(zhǎng)命菌，能促使小麥、菜豆、煙草和水稻等作物穩(wěn)產(chǎn)，同時(shí)降低了作物對(duì)重金屬的吸收，比單一菌的實(shí)施效果更好[31]。Zervas等[32]研究表明，葉層細(xì)菌甲基桿菌屬(Methylobacteriumspp.)菌株可以通過(guò)分泌代謝物細(xì)菌素、羥基苯甲酸等保護(hù)植物免受病原微生物的侵害，并且能夠持續(xù)生長(zhǎng)。本研究通過(guò)混合培養(yǎng)方法制備的多功能菌劑拓展了單一菌株的功能，在后續(xù)的研究工作中進(jìn)一步將該多功能菌劑應(yīng)用于土壤重金屬污染的修復(fù)和防治病蟲害，并對(duì)菌種混合培養(yǎng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，為該多功能菌劑的進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供參考。