細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶和脂肪酶固體培養(yǎng)基及接種和培養(yǎng)時間的研究

張東升， 徐一馨， 宋雙民， 周 瑋

(1.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023)

鑒于許多行業(yè)對纖維素水解酶和脂肪酶需求的增加，選擇一種簡單、直觀、快速、準(zhǔn)確的方法篩選和鑒定產(chǎn)纖維素酶和脂肪酶細(xì)菌是極其重要的[1-2]。目前，通常采用平板法初步篩選產(chǎn)纖維素酶和脂肪酶細(xì)菌，該方法簡單、直觀、快速，適合大規(guī)模篩選和鑒定[2-4]。因此，平板法能否準(zhǔn)確識別細(xì)菌產(chǎn)酶特性，將影響細(xì)菌鑒定的準(zhǔn)確性。除了環(huán)境條件，平板法準(zhǔn)確鑒定細(xì)菌產(chǎn)酶特性的關(guān)鍵因素是培養(yǎng)基，培養(yǎng)基必須滿足細(xì)菌生長且保證陽性細(xì)菌產(chǎn)酶，陰性細(xì)菌不產(chǎn)酶，這樣的培養(yǎng)基一直被不斷地更新替換，以便找到一種能靈敏和準(zhǔn)確地鑒定細(xì)菌產(chǎn)酶的培養(yǎng)基。本文就目前鑒定產(chǎn)纖維素酶和脂肪酶的最佳培養(yǎng)基進行了研究。國外鑒定產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌培養(yǎng)基，由Hankin等[5]最早提出使用羧甲基纖維素鈉替代天然纖維素作為碳源，纖維素酶的產(chǎn)生時間由原來7 d縮短到2 d；由Wood[6]最先使用剛果紅取代十六烷基三甲基溴化銨(HAB)做為染色劑，提高了透明圈視覺的可視性，后又由Wood[7-8]和Fatma[4]進行了驗證，至此，羧甲基纖維素鈉做為碳源、剛果紅做為染色劑成為篩選和鑒定產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌培養(yǎng)基的公認(rèn)成分。最初使用的平板培養(yǎng)基除了含有羧甲基纖維素鈉和剛果紅外，還含有較多的無機礦物鹽、無機氮 ((NH4)2SO4、NaNO3)和酵母膏等成分，較少使用蛋白胨[4，9-11]。但近年來，很多文獻報道產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌培養(yǎng)基成分簡單，僅含有蛋白胨和羧甲基纖維素鈉[12-15]。迄今為止，利用平板法鑒定產(chǎn)脂肪酶細(xì)菌培養(yǎng)基中的降解底物尚未統(tǒng)一，目前使用較多的底物有三丁酸甘油酯[15-19]、三油酸甘油酯[20-21]和Tween-80[22-23]等，其中三油酸甘油酯被公認(rèn)是鑒定脂肪酶的最佳底物[22]，而對三丁酸甘油酯和Tween-80 的說法不一，有人認(rèn)為三丁酸甘油酯和Tween-80不是脂肪酶降解的最佳底物[24]，而有人認(rèn)為是脂肪酶降解的最佳底物[16，22]；除上述最常見的脂肪酶鑒定底物外，期刊[25]和實驗指導(dǎo)書[26]也選用自然油脂作為脂肪酶鑒定底物；國外對脂肪酶最佳底物篩選的文章較多[2，15-16，20，24]，Samad等[22]比較了三丁酸甘油酯、三油酸甘油酯、Tween-20、60、80為底物的培養(yǎng)基，表明Tween-80為脂肪酶最佳底物，而三丁酸甘油酯和三油酸甘油酯產(chǎn)生的暈圈邊界不清，導(dǎo)致測量不準(zhǔn)確。培養(yǎng)基里除了底物種類決定脂肪酶鑒定是否準(zhǔn)確外，用來識別細(xì)菌脂肪酶產(chǎn)生的方法也至關(guān)重要，目前大多數(shù)文獻使用平板顯色法[18-19，22],也有使用鈣沉淀暈圈法[26]，兩種方法哪種更加敏感和準(zhǔn)確，尚無文獻報道。綜上所述，選擇一種滿足絕大多數(shù)細(xì)菌生長并同時產(chǎn)纖維素酶或脂肪酶的培養(yǎng)基是極其重要的。本文研究了實驗指導(dǎo)書和期刊上常用鑒定細(xì)菌纖維素酶和脂肪酶培養(yǎng)基，同時考察了菌種的培養(yǎng)時間和接種后培養(yǎng)時間對細(xì)菌纖維素酶或脂肪酶活性的影響，選擇一種細(xì)菌纖維素酶或脂肪酶產(chǎn)生的最佳培養(yǎng)基以及最佳接種和培養(yǎng)時間，為實驗指導(dǎo)書的編寫和快速、準(zhǔn)確地鑒定纖維素酶和脂肪酶產(chǎn)生菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源及培養(yǎng) 本研究所有菌種均為大連海洋大學(xué)自主分離并經(jīng)生理生化和16S rRNA鑒定的一些益生菌株及教學(xué)實驗課使用的標(biāo)準(zhǔn)菌株，均屬異養(yǎng)細(xì)菌(表1)。實驗前先將-80 ℃保存的菌株經(jīng)營養(yǎng)瓊脂或2216E平板活化、純化，4 ℃保存?zhèn)溆?，再從冰箱中取出活化?5 ℃恒溫培養(yǎng)16～20 h，作為實驗菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨、2216E培養(yǎng)基。①各種產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基。A培養(yǎng)基[13]: 蛋白胨 10.0 g，酵母粉 10.0 g，羧甲基纖維素鈉(CMC-Na) 10.0 g，NaCl 5.0 g，KH2PO41.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL；B培養(yǎng)基[12]:蛋白胨10 g，酵母粉 5 g，羧甲基纖維素鈉 10 g，NaCl 5 g，瓊脂 15 g，水 1 000 mL；C凍水培養(yǎng)基[27]:蛋白胨 5 g，NaCl 5 g，羧甲基纖維素鈉 8 g，瓊脂 15 g，水 1 000 mL；D培養(yǎng)基[28]:KH2PO42 g，(NH4)2SO44 g，MgSO40.3 g，CaCl20.3 g，F(xiàn)eSO45 mg，MnSO41.6 mg，ZnCl21.7 mg，CoCl22.0 mg，羧甲基纖維素鈉 20 g，瓊脂粉 15 g，蒸餾水 1 000 mL；S培養(yǎng)基[29]:第一層:瓊脂 20 g，水1 000 mL；第二層：NH4NO31 g，CaCl20.1 g，K2HPO40.5 g，F(xiàn)ePO40.02 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 1 g，酵母膏 0.05 g，羧甲基纖維素鈉 8 g，瓊脂 15 g，水 1 000 mL。上述培養(yǎng)基pH值7.0～7.2。②各種產(chǎn)脂肪酶培養(yǎng)基。Tween-20培養(yǎng)基[22,30]：蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，CaCl2·H2O 0.1 g，Tween-20 10 g，瓊脂 15 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值7.0～7.4，1.6%中性紅溶液 1 mL；Tween-60培養(yǎng)基[22,30]：蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，CaCl2·H2O 0.1 g，Tween-60 10 g，瓊脂 15 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.4；Tween-80培養(yǎng)基[22,30]：蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，CaCl2·H2O 0.1 g，Tween-80 10 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.4；葡萄糖-Tween-80培養(yǎng)基[27]：葡萄糖 20 g，酵母粉 5 g，蛋白胨 5 g，CaCl2·H2O 0.1 g，Tween-80 10 g，瓊脂 15 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值7.0～7.4；三丁酸培養(yǎng)基[22,30]：蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，CaCl2·H2O 0.1 g，甘油三丁酸酯 10 g，瓊脂 15 g，蒸餾水 1 000 mL，1.6%中性紅溶液 1 mL，pH值7.0～7.4；三油酸培養(yǎng)基[22,30]：蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，CaCl2·H2O 0.1 g，三油酸甘油脂 10 g，瓊脂 15 g，蒸餾水 1 000 mL，1.6%中性紅溶液1 mL ，pH值7.0～7.4；油脂培養(yǎng)基[26]：蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，牛肉膏 5 g，香油 10 g，瓊脂 15 g，蒸餾水 1 000 mL，1.6%中性紅溶液1 mL，pH值7.0～7.4；無氮-Tween-80培養(yǎng)基[22]：Tween-80 10 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，1.6%中性紅溶液1 mL， pH值7.0～7.4。上述培養(yǎng)基配制完成后，含糖培養(yǎng)基115 ℃滅菌30 min，不含糖培養(yǎng)基121 ℃滅菌20 min，冷卻后倒平板，待用。

表1 實驗菌株

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基對細(xì)菌生長和纖維素酶或脂肪酶產(chǎn)生的影響 首先按象限法將平板均分4份，在4象限內(nèi)點種同一種細(xì)菌，將1.1.1實驗菌株接種到1.1.2纖維素酶或脂肪酶培養(yǎng)基上，同一菌株同種培養(yǎng)基重復(fù)2個平板，25 ℃培養(yǎng)，每隔24 h觀察細(xì)菌生長和酶的產(chǎn)生情況，培養(yǎng)72 h時，測量纖維素酶培養(yǎng)基上已生長細(xì)菌的菌落直徑，然后采用0.2%的剛果紅染液[13]染色1 h，1 mol/L NaCl溶液脫色1 h，倒出NaCl溶液，5%的醋酸溶液固定40 min，觀察透明圈產(chǎn)生情況，并測量透明圈直徑，透明圈直徑與菌落直徑比代表纖維素酶活性，公式為a=R/r，其中：a表示纖維素酶活性；R表示纖維素酶透明圈直徑；r表示菌落直徑。比值越大，認(rèn)為該菌株產(chǎn)纖維素酶能力越強；當(dāng)脂肪酶培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌120 h時，測定其暈圈直徑(R)與菌落直徑(r)比值(a)，即為脂肪酶活性；最終將細(xì)菌均能生長及產(chǎn)纖維素酶或脂肪酶的培養(yǎng)基，選做培養(yǎng)細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶或脂肪酶的最適培養(yǎng)基，進行后續(xù)試驗。

1.2.2 瓊脂含量對細(xì)菌纖維素酶和脂肪酶活性的影響 將瓊脂含量分別設(shè)為13‰、15‰、18‰、20‰，選擇1.2.1中的最適培養(yǎng)基和操作步驟點種陽性菌，25 ℃恒溫培養(yǎng)72 h(纖維素酶)和120 h(脂肪酶)，測量纖維素酶或脂肪酶的活性并觀察透明圈或暈圈與邊界的清晰度，選擇最佳瓊脂含量。

1.2.3 海水、淡水培養(yǎng)基對細(xì)菌纖維素酶和脂肪酶活性的影響 根據(jù)1.2.1和1.2.2實驗的最適培養(yǎng)基和最佳瓊脂含量，分別用陳海水、蒸餾水配制培養(yǎng)基，根據(jù)1.2.1點種陽性菌種，25 ℃分別培養(yǎng)72 h(纖維素酶)和120 h(脂肪酶)，測定海水、淡水培養(yǎng)基對纖維素酶和脂肪酶產(chǎn)生的影響。

1.2.4 菌種培養(yǎng)時間對細(xì)菌纖維素酶和脂肪酶活性的影響 按照1.2.1方法，點種不同培養(yǎng)時間的陽性細(xì)菌于瓊脂含量為13‰的最佳培養(yǎng)基中，25 ℃分別培養(yǎng)72 h(纖維素酶)和120 h(脂肪酶)，比較接種不同培養(yǎng)時間的細(xì)菌纖維素酶和脂肪酶活性，確定接種細(xì)菌的最佳培養(yǎng)時間。

1.2.5 培養(yǎng)時間對細(xì)菌纖維素酶和脂肪酶活性的影響 接種培養(yǎng)18 h的細(xì)菌于瓊脂含量為13‰的最適培養(yǎng)基上，25 ℃分別培養(yǎng)24、48、72、96、120、144 h，測定細(xì)菌纖維素酶和脂肪酶的活性，確定測定纖維素酶和脂肪酶的最佳培養(yǎng)時間。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件計算所有數(shù)據(jù)均值(Mean±Std)，同一實驗設(shè)計、不同組別的纖維素酶或脂肪酶均值之間進行多重比較時,當(dāng)各組均值方差齊性大于0.05時，采用Tukey進行顯著性比較；當(dāng)各組均值方差齊性小于0.05時，采用Game-howell進行顯著性比較，顯著性設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基對細(xì)菌生長和纖維素酶或脂肪酶產(chǎn)生的影響

不同培養(yǎng)基對細(xì)菌生長和纖維素酶的產(chǎn)生具有較大影響(表2)。以無機氮為氮源的培養(yǎng)基(D、S)細(xì)菌生長較差，且生長的細(xì)菌僅有少數(shù)產(chǎn)纖維素酶；而以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基(A、B、C)上生長的細(xì)菌較多，且陽性菌株均產(chǎn)纖維素酶，說明蛋白質(zhì)是纖維素酶產(chǎn)生的最佳氮源。除此以外，培養(yǎng)基必須含某些礦物鹽和生長素(A、B培養(yǎng)基)，用來篩選和鑒定細(xì)菌是否產(chǎn)纖維素酶的最佳培養(yǎng)基應(yīng)含蛋白胨、酵母膏、CMA-Na和必需礦物鹽，由于A和B培養(yǎng)基成分相近，而A培養(yǎng)基僅比B培養(yǎng)基多了KH2PO4成分，但在A培養(yǎng)基上菌落和纖維素酶直徑較大，因此最終確定A培養(yǎng)基為目前細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶最適培養(yǎng)基，并進行后續(xù)試驗。

表2 不同培養(yǎng)基對細(xì)菌生長和纖維素酶產(chǎn)生的影響

以蛋白胨為氮源，含有不同碳源的脂肪酶產(chǎn)生培養(yǎng)基，對細(xì)菌生長和脂肪酶產(chǎn)生的影響較大(表3，圖1)。Tween-20最有利于細(xì)菌生長和脂肪酶的產(chǎn)生，其次為Tween-60和Tween-80，被認(rèn)為用來篩選脂肪酶的最佳底物三油酸甘油酯，僅一株細(xì)菌生長，因此確定用Tween-20培養(yǎng)基進行后續(xù)實驗。用來觀察脂肪酶產(chǎn)生的試劑顯色法較差，難以鑒別出脂肪酶活性較低的細(xì)菌，且變色圈與周圍培養(yǎng)基界線不清，Ca2+與脂類分解產(chǎn)物脂肪酸生成的暈圈與周圍培養(yǎng)基界限清晰，能鑒定出產(chǎn)脂肪酶活性較低的細(xì)菌(圖2)，因此確定Ca2+作為脂肪酶產(chǎn)生的最佳指示劑。

表3 碳源對細(xì)胞生長和脂肪酶產(chǎn)生的影響

圖1 嗜氣芽胞桿菌在不同碳源培養(yǎng)基上的暈圈及透明圈Fig.1 Halo or transparent circlesof B.aerophil on different carbon source mediaa為菌落，b為暈圈,c為透明圈，箭頭為暈圈或透明圈與周圍培養(yǎng)基的界限a is the colony, b is the halo, c is the transparent circle, and the arrow is the boundary between the halo or transparent circle and the surrounding medium

圖2 不同菌種在Tween-20培養(yǎng)基上的暈圈形態(tài)Fig.2 Halo morphology of different strains on tween-20 mediumB.S.、B.C.、S.A.、B.sp.L15、B.A.、B.L.分別代表枯草芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、L15芽胞桿菌、嗜氣芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌，下圖同B.S., B.C., S.A., B.sp.L15, B.A., B.L. respectively represent Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus,Bacillus sp. L15, Bacillus aerophil and Bacillus licheniformis, the same below

2.2 瓊脂含量對細(xì)菌纖維素酶和脂肪酶活性和清晰度的影響

瓊脂含量對細(xì)菌纖維素酶和脂肪酶活性和清度晰的影響均與細(xì)菌種類有關(guān)(圖3、4)?？傮w來說，瓊脂含量為13‰時，纖維素酶活性較低，瓊脂含量為15‰和20‰時，纖維素酶活性較高，其中B.sp.L15、B.L.兩株細(xì)菌在瓊脂含量為15‰時，酶活性顯著高(P<0.05)，其余菌株在瓊脂含量不同時，酶活性差異不顯著，但瓊脂含量為13‰時，纖維素酶產(chǎn)生的透明圈與周圍介質(zhì)界限最清晰，20‰時最不清晰(圖4A)。瓊脂含量對細(xì)菌脂肪酶活性的影響與對纖維素酶活性的影響略有不同，瓊脂含量為13‰時，大多數(shù)細(xì)菌脂肪酶活性較高，但所有菌株在培養(yǎng)基瓊脂含量為13‰時，脂肪酶暈圈與周邊培養(yǎng)基界限最清晰(圖4B)。綜合瓊脂含量對纖維素酶和脂肪酶活性和邊界清晰度的影響，選擇瓊脂含量13‰為平板法鑒定纖維素酶和脂肪酶的最佳用量。

圖3 瓊脂含量對細(xì)菌纖維素酶(A)和脂肪酶(B)活性的影響Fig.3 Effect of AGAR content on cellulose (A) and lipase (B) activities of bacteria13、15、18、20為培養(yǎng)基的瓊脂含量(‰)；B.S.、B.C.、B.M.、B.sp.L15、B.A.、B.L.、S.A.分別代表枯草芽胞桿菌、蠟狀芽胞桿菌、巨大芽胞桿菌、芽胞桿菌L15菌株、嗜氣芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌；同一細(xì)菌柱狀圖上的小寫字母不同代表產(chǎn)酶差異顯著(P﹤0.05)，小寫字母相同代表差異不顯著；R/r為透明圈直徑/菌落直徑比(n=8)，下圖同13, 15，18， and 20 were AGAR content of the medium (‰) ；B.S., B.C.,B.M.,B.sp.L15, B.A., B.L.，S.A. represents B. subtilis, B. cereus, B. megacephalus, B.sp.L15 strain, B. aerophilus, B. licheniformis, S. aureus respectively. Different lowercase letters on the bar chart of the same bacterium indicated significant difference in enzyme production (P<0.05), while the same lowercase letters indicated no significant difference. R/r Transparent circle diameter/colony diameter(n=8), the same below

圖4 瓊脂含量(‰)對纖維素酶透明圈(A)和脂肪酶暈圈(B)清晰度的影響Fig.4 Effect of AGAR content(‰)on the clarity of cellulase transparent circle (A) and lipase halo (B)

2.3 海水、淡水溶劑對細(xì)菌纖維素酶和脂肪酶活性的影響

本研究顯示使用同一種培養(yǎng)基，分別用蒸餾水和海水配制時，凡在海水、淡水培養(yǎng)基上生長的陽性菌株，均產(chǎn)纖維素酶或脂肪酶，其活性與菌株來源海水、淡水無關(guān)，而在海、淡水培養(yǎng)基產(chǎn)纖維素酶或脂肪酶的活性差異與菌株有關(guān)。本研究證實所有陽性菌株均在海水配制的培養(yǎng)基上產(chǎn)生的纖維素酶高于淡水配制的培養(yǎng)基，但大多數(shù)菌株在海水配制的培養(yǎng)基上脂肪酶活性較高，少數(shù)菌株在淡水培養(yǎng)基上脂肪酶活性較高(圖5)。

2.4 菌種培養(yǎng)時間對細(xì)菌纖維素酶和脂肪酶活性的影響

接種培養(yǎng)時間不同的菌種對纖維素酶和脂肪酶活性較小的細(xì)菌影響較小，對活性較大的細(xì)菌影響較大(圖6)。就纖維素酶和脂肪酶活性較大的細(xì)菌而言，接種培養(yǎng)16～24 h的菌種，纖維素酶活性最高，接種培養(yǎng)24～32 h的菌種，脂肪酶活性最高(P<0.05)。因此,為了比較不同細(xì)菌產(chǎn)酶情況，建議接種產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌菌種的最佳培養(yǎng)時間統(tǒng)一為18 h,接種產(chǎn)脂肪酶細(xì)菌菌種的最佳培養(yǎng)時間為28 h。

圖5 海水、淡水培養(yǎng)基對細(xì)菌纖維素酶(A)和脂肪酶(B)活性的影響Fig.5 Influenceof marine and fresh water media on cellulase (A) and lipase (B) activities of bacteriaFM：淡水培養(yǎng)基；SM：海水培養(yǎng)基FM： fresh medium； SM： sea medium

圖6 菌種的培養(yǎng)時間對纖維素酶(A)和脂肪酶(B)活性的影響Fig.6 Influence of culture time of an inoculum on cellulase (A) and lipase (B) activities

2.5 接種后的培養(yǎng)時間對細(xì)菌纖維素酶和脂肪酶活性的影響

不同培養(yǎng)時間對細(xì)菌纖維素酶和脂肪酶活性均有影響(圖7)，均對酶活性較高的菌株影響顯著(P<0.05)。細(xì)菌纖維素酶產(chǎn)生時間較早，在培養(yǎng)到24 h時，即產(chǎn)生纖維素酶，不同菌株酶活性最大時，需要培養(yǎng)時間不同，變化在24～72 h之間；而細(xì)菌的脂肪酶產(chǎn)生時間較晚，有些菌株需培養(yǎng)到96 h時，才有脂肪酶暈圈產(chǎn)生，但產(chǎn)生最大脂肪酶活性的時間不定，大部分菌株培養(yǎng)到120 h時，脂肪酶活性比96 h有較大的增長，隨后有些菌株脂肪酶活性降低，有些菌株緩慢增長，因此建議測定纖維素酶活性的最佳培養(yǎng)時間為48 h,測定脂肪酶活性的最佳培養(yǎng)時間為120 h。

圖7 接種后的培養(yǎng)時間對細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶(A)和脂肪酶(B)活性的影響Fig.7 Effect of culture time after inoculation on cellulase (A) and lipase (B) activity of bacteria

3 討 論

3.1 氮源和碳源對細(xì)菌生長和纖維素酶及脂肪酶產(chǎn)生的影響

合適的碳源和氮源是細(xì)菌生長和繁殖的必要條件，大部分異養(yǎng)細(xì)菌生長繁殖需要有機氮源，目前已確定鑒定細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基的最佳碳源為羧甲基纖維素鈉，但最佳氮源尚未確定。有些實驗指導(dǎo)書[27,29]和期刊上[28,31]鑒定細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基使用的是無機氮源，而有些選用的是有機氮源[13-14]。本研究對無機和有機氮源進行了比較，證明有機蛋白胨是鑒定細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基中的最佳氮源，與文獻觀點一致[32],而無機氮源并不是細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶的理想氮源，這可能與產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌均為異養(yǎng)菌有關(guān)。

國內(nèi)外對細(xì)菌產(chǎn)脂肪酶培養(yǎng)基的研究主要集中在對脂肪酶降解底物的篩選上[2，11，15-16，20，22]，盡管普遍認(rèn)為三油酸甘油酯是脂肪酶的最佳底物，但三油酸甘油酯難乳化，較少使用[22]，而目前的常用底物是三丁酸甘油脂[18-19]和Tween-80[20，22，24]。本研究表明三油酸甘油酯和三丁酸甘油酯不是用來鑒定細(xì)菌脂肪酶的理想底物，與文獻報道類似[22]，但本研究顯示Tween-80也不是脂肪酶鑒定的最佳底物，這與Samad等[22]報道不同，本研究使用較多細(xì)菌種類進行驗證，而Samad等使用細(xì)菌種類較少，且實驗所用的培養(yǎng)基僅含碳源，無氮源，這可能導(dǎo)致結(jié)論不同。本研究證實以Tween-20為底物的培養(yǎng)基是鑒定脂肪酶活性的最佳底物，而Tween-20適合長鏈脂肪酶，因此，認(rèn)為鑒定脂肪酶的最佳底物為Tween-20；用Ca2+作為觀察脂肪酶產(chǎn)生效果優(yōu)于變色方法，可能由于Ca2+與脂肪酸反應(yīng)生成的沉淀，肉眼對此敏感所致。

3.2 瓊脂含量對細(xì)菌纖維素酶和脂肪酶活性和清晰度的影響

目前，用平板法鑒定細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶和脂肪酶活性，仍存在透明圈和周圍介質(zhì)界限不清[1-2]，致使測量結(jié)果不準(zhǔn)確。本研究表明透明圈和周圍培養(yǎng)基界限清晰度與瓊脂含量呈負(fù)相關(guān)，與文獻報道[33]一致，這是因為當(dāng)瓊脂含量多時，瓊脂形成的大分子結(jié)構(gòu)致密，影響平板內(nèi)其他營養(yǎng)物和細(xì)菌分泌物(如纖維素酶和脂肪酶分子)遷移速率的均一性，影響了酶分子遷移速率不一致，導(dǎo)致透明圈與周圍培養(yǎng)基界限不清晰或暈圈邊界不規(guī)則。

3.3 海水、淡水溶劑對細(xì)菌纖維素酶和脂肪酶產(chǎn)生和活性的影響

淡水分離的細(xì)菌是否可在海水培養(yǎng)基里產(chǎn)纖維素酶和脂肪酶？反之，海水分離細(xì)菌是否可在淡水培養(yǎng)基里產(chǎn)纖維素酶和脂肪酶？其結(jié)論可為益生菌的應(yīng)用提供技術(shù)支持，本研究顯示所有菌株在海水培養(yǎng)基上纖維素酶活性較高，這可能與細(xì)菌防止海水中鈉鹽過多進入細(xì)胞內(nèi)需要較高的能量，促使細(xì)菌分泌較多的纖維素酶以滿足細(xì)菌在海水中生長所致，也與細(xì)菌的最適鹽度有關(guān)，所有芽胞桿菌的最適鹽度均為0～20；而少數(shù)實驗菌株在海水中分泌的脂肪酶略低于淡水，這可能與細(xì)菌分解的脂肪酶產(chǎn)生的能量較高有關(guān)，可能某些菌株脂肪酶的分泌不需要海水中某些離子的參與，其原因還有待于進一步研究。

3.4 菌種的培養(yǎng)時間對細(xì)菌纖維素酶和脂肪酶產(chǎn)生時間和活性的影響

有關(guān)文獻鑒定和篩選產(chǎn)纖維素酶和脂肪酶細(xì)菌時，一般接種培養(yǎng)18 h的菌種[12-13，18，27-28]，接種其他培養(yǎng)時間的菌種，對纖維素酶和脂肪酶活性是否具有顯著影響，尚未見報道。本研究顯示，鑒定細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶菌種的最佳培養(yǎng)時間與文獻報道相近，接種培養(yǎng)了24 h之前的菌種最好，而鑒定產(chǎn)脂肪酶細(xì)菌的最佳菌種培養(yǎng)時間比文獻晚，菌種的培養(yǎng)時間在24～32 h之間最好，這可能與細(xì)菌本身分泌脂肪酶的時間較后有關(guān)，具體原因需進一步研究。接種不同培養(yǎng)時間的同一菌種對細(xì)菌開始產(chǎn)纖維素酶和脂肪酶的時間沒有影響，這可能與細(xì)菌分泌纖維素酶和脂肪酶的時間與細(xì)菌本身基因有關(guān)。

3.5 接種后的培養(yǎng)時間對纖維素酶和脂肪酶活性的影響

在篩選和鑒定細(xì)菌是否產(chǎn)纖維素酶或脂肪酶時，往往采用平板培養(yǎng)細(xì)菌48 h[12，28]或48～72 h[18]。本研究證實，細(xì)菌培養(yǎng)到48 h時，細(xì)菌纖維素酶活性最大，與文獻一致，細(xì)菌培養(yǎng)到120 h時，脂肪酶活性最大,與文獻不同。培養(yǎng)時間影響細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶和脂肪酶活性，這種結(jié)果推測可能與細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上的生長發(fā)育程度有關(guān)，在液體培養(yǎng)基里細(xì)菌酶活性最大發(fā)生在細(xì)菌穩(wěn)定期的前期[34-35]，但不同細(xì)菌穩(wěn)定期發(fā)生的時間不同，因此最大酶活性發(fā)生的培養(yǎng)時間也不同，不同菌種或同一菌種培養(yǎng)條件不同，其穩(wěn)定期時間不同，本研究測定的溫度為25 ℃，與文獻不同，但纖維素酶活性最大的培養(yǎng)時間與文獻相同，說明本研究的實驗結(jié)果具有很好的參考價值，可供研究者參考使用。

綜上所述，鑒定和篩選產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的最佳培養(yǎng)基為含蛋白胨的A培養(yǎng)基，瓊脂含量為13‰，菌種的培養(yǎng)時間為16～24 h，測定時的培養(yǎng)時間為48 h；脂肪酶的最佳培養(yǎng)基為含有Tween-20的培養(yǎng)基，瓊脂含量為13‰，菌種的培養(yǎng)時間為24～36 h，測定時的培養(yǎng)時間為120 h。

致謝：本研究陽性菌種(嗜氣芽胞桿菌Bacillusaerophilus、蠟樣芽胞桿菌B.cereus、巨大芽胞桿菌B.megatherium、地衣芽胞桿菌B.licheniformis)由大連海洋水產(chǎn)動物醫(yī)院提供。