隆林黃牛、潿洲黃牛冷凍精液制作的研究

文│鄧祝新 黃麗云 劉瑞鑫 許春榮 王英群 洪少鋒 李美珍 何復(fù)明 許鵬 方奕雄 蔣世強(qiáng) 魏莎*（廣西壯族自治區(qū)畜禽品種改良站）

廣西壯族自治區(qū)畜禽品種改良站積極響應(yīng)國家政策的號(hào)召，打好種業(yè)翻身仗，積極推進(jìn)《廣西地方家畜品種遺傳材料采集與保存》項(xiàng)目。其中，對(duì)廣西地方品種進(jìn)行遺傳材料采集，并且獲得了明顯的成效，對(duì)廣西畜牧種業(yè)做出重要貢獻(xiàn)。隆林黃牛、潿洲黃牛具有以下特性：

（1）兩者屬于放養(yǎng)型黃牛，野性比較強(qiáng)，人工比較難馴服，增加了人工采精的難度。

（2）兩者飼養(yǎng)基本都是單純以進(jìn)食青草為主，性欲差，精液稀。究其原因，為提高公牛性欲和精液量，在公牛飼養(yǎng)中進(jìn)行圈養(yǎng)、隔離調(diào)教，增加蛋白性飼料投入，最終達(dá)到預(yù)期效果。鮮精活力完全達(dá)到制作冷凍精液的要求。

一、黃牛鮮精的采集

使用法國卡蘇公司專售的IMV采精筒，用75%的酒精進(jìn)行全面消毒，晾干，裝好后備用。采精筒水溫控制在45～50℃，內(nèi)胎氣壓要充足，充滿整個(gè)采精筒內(nèi)胎，最好形成三角形裂口，涂少量專用潤滑劑在采精筒內(nèi)壁，保護(hù)公牛陰莖插入時(shí)不受傷。固定好臺(tái)牛，等待公牛爬跨時(shí)，采精員迅速將采精筒套入公牛陰莖，收集牛精，待公牛下滑時(shí)拿開采精筒。采集結(jié)束后放水，排氣壓。取出集精杯，將精液送到實(shí)驗(yàn)室窗口內(nèi)，浸泡在37℃的恒溫水浴鍋內(nèi)。注意事項(xiàng)：如果采精筒的水溫低于45℃或高于50℃時(shí)采精筒的內(nèi)膽溫度并不合適牛陰莖的感受溫度，嚴(yán)重影響精液采集是否成功，甚至讓公牛發(fā)怒，產(chǎn)生抵觸不再爬跨。如果內(nèi)膽溫度過高，在采集牛精的同時(shí)部分精液流經(jīng)內(nèi)膽時(shí)，精子會(huì)因溫度過熱而被燙死一部分，人為造成損失。

二、黃牛鮮精的鏡檢與稀釋

1.黃牛鮮精稀釋液直接采用了法國卡蘇公司的產(chǎn)品（BIOXCELL freezing medium for bull semen，稀釋液250 毫升/瓶）。必須使用雙蒸高壓滅菌蒸餾水，按照1∶4的比例配制等溫混合均勻后放置于35℃的恒溫水浴鍋內(nèi)待用。

2.接到集精杯后輕輕搖勻精液，用肉眼觀察精液顏色是否有異?；螂s質(zhì)。合格的精液做好采精記錄，取10微升原精進(jìn)行顯微鏡鏡檢，觀察精液情況，活力達(dá)到0.7以上且無雜質(zhì)、無污染、死精少的原精可以使用（一般鮮精活力在0.6以下的不建議制作冷凍精液），接著用密度儀測量精子密度，2.4毫升（0.9%氯化鈉）＋100微升的原精，放到比色皿中搖勻，放入卡蘇IMV光譜密度儀中測量，按照密度儀的提示量進(jìn)行稀釋。重點(diǎn)要求：

（1）稀釋過程中一邊搖勻一邊取樣鏡檢觀察精子情況，直到稀釋合適為止，加稀釋液總量一般不超過推薦量。

（2）稀釋液和牛精液要同時(shí)浸泡在37℃的水浴鍋中，以達(dá)到兩者溫度一致，在稀釋時(shí)減少溫差對(duì)精子活力的影響。

（3）稀釋完成后，將精液浸泡在水浴鍋中等待分裝，稀釋間的室溫要求在25℃左右，稀釋后的精液溫度基本維持在26℃左右，目的是讓精子從采集出來到稀釋完成的整個(gè)過程中逐級(jí)降溫。稀釋后要求每支0.25毫升細(xì)管內(nèi)總精子數(shù)在3000萬以內(nèi)，有效精子數(shù)為800～1000萬個(gè)，少于800萬個(gè)有效精子數(shù)的為不合格產(chǎn)品。

三、黃牛鮮精的灌裝與平衡

稀釋后的牛精液分裝到0.25毫升容量的細(xì)管中，筆者使用法國卡蘇公司生產(chǎn)的IS4全自動(dòng)精液灌裝一體機(jī)、多米諾A系列噴碼機(jī)，聯(lián)合灌裝成產(chǎn)品。每支0.25毫升細(xì)管內(nèi)有效精液含量在0.185～0.21為合格產(chǎn)品。重點(diǎn)要求：

（1）灌裝的同時(shí)必須搖勻精液，達(dá)到分裝均勻的效果。

（2）精液灌裝的室溫控制在23～25℃為佳，讓精液再次逐級(jí)降溫。防止精液溫度回升，如果溫度回升會(huì)對(duì)精液造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷。

平衡的要求：灌裝完成后的細(xì)管精液從25℃左右的室溫立即放到開放式的平衡柜內(nèi)。此時(shí)平衡柜的工作溫度為4～8℃。當(dāng)所有細(xì)管精液在平衡柜內(nèi)完成上托架、排管，約1小時(shí)穩(wěn)定后，再把細(xì)管精液轉(zhuǎn)移到4℃的密閉式恒溫柜內(nèi)靜置3～4個(gè)小時(shí)。此時(shí)是最關(guān)鍵的精子休眠期，禁止再次打開恒溫柜，防止精液回溫。

四、黃牛冷凍精液的制作過程

經(jīng)過3個(gè)小時(shí)以上的平衡后進(jìn)行冷凍。打開電腦冷凍程序，打開冷凍儀，開啟液氮閥門，并檢查液氮壓力，選擇牛冷凍精液制作專用程序，點(diǎn)擊進(jìn)入冷凍程序。當(dāng)冷凍程序提示冷凍柜達(dá)到4℃時(shí)迅速打開冷凍柜蓋子，將平衡好的細(xì)管精液放入冷凍柜對(duì)應(yīng)的架子上，然后蓋上蓋子。等待約2分鐘后點(diǎn)擊開始冷凍。約7.5分鐘后冷凍結(jié)束，此時(shí)關(guān)掉風(fēng)扇，戴上手套，取出細(xì)管凍精，迅速浸泡到液氮容器中，產(chǎn)品成型，冷凍結(jié)束。

五、黃牛冷凍精液的解凍與活率觀察

1.細(xì)管凍精的解凍檢查。將水浴鍋溫度調(diào)節(jié)至38℃，用溫度計(jì)測量實(shí)際水溫，38～39℃為最佳解凍溫度。選擇5毫升指型管，加入1毫升牛凍精解凍液，置于水浴鍋架子上浸泡，將一支冷凍精液取出，迅速浸泡到水浴鍋中解凍，均勻搖晃30秒以上，待溶解完后取出，擦干細(xì)管表面水分，減掉封口端，將精液完全擠到指型管解凍液內(nèi)，水浴搖均勻，用移液槍取10微升進(jìn)行鏡檢觀察。重點(diǎn)要求：解凍時(shí)，細(xì)管必須水浴搖晃，解凍時(shí)間30秒以上。水溫必須恒定在38～39℃，顯微鏡觀察時(shí)載物臺(tái)必須配備恒溫板。一塊玻片分別取3滴10微升精液在3個(gè)視野下進(jìn)行觀察，綜合評(píng)定活力。0.35或0.35以上為合格，否則為不合格。

2.生產(chǎn)制作要點(diǎn)。

（1）采精工作中控制采精筒的內(nèi)膽水溫才能采到好的精液。否則，黃牛爬跨時(shí)只射精清，并不是真正射精，導(dǎo)致采不到精液。

（2）在精液稀釋工作中，首先將鮮精搖勻，精液取樣位置不同，對(duì)精子密度測量值會(huì)有一定偏差，因此，在實(shí)際工作中一定要將理論值與實(shí)際值相結(jié)合，反復(fù)鏡檢看稀釋效果。

（3）必須做到逐級(jí)降溫，這是鮮精稀釋后最重要的部分，嚴(yán)格逐步降溫過程，禁止回溫，防止造成不可逆的損傷。平衡溫度嚴(yán)格要求在4℃，平衡時(shí)間要求穩(wěn)定在3～4小時(shí)后才能進(jìn)行冷凍制作。經(jīng)測試，解凍溫度為38～39℃最合適，必須采取水浴解凍，將整支精液完全擠到解凍液內(nèi)搖勻，取10微升滴片，鏡檢觀察活力。多看幾個(gè)視野內(nèi)的精子，采取綜合評(píng)定。隆林黃牛、潿洲黃牛的公牛采集到的原精活力基本都在0.7以上，個(gè)別公牛原精偏稀，飼養(yǎng)管理過程中多增加精料，多運(yùn)動(dòng)，堅(jiān)持公牛分欄飼養(yǎng)，以采到更好的精液，才能制作出更完美的凍精。