野生鳥(niǎo)類(lèi)新城疫病毒分離株的生物學(xué)特性和系統(tǒng)發(fā)育分析

楊少華，黃慶華，崔 寧，孫守禮，許傳田

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所 山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100)

新城病病毒(Newcastle disease virus，NDV) 又稱為禽副黏病毒Ⅰ型(avian paramyxovirus serotype 1，APMV-1),在分類(lèi)上屬于單鏈負(fù)股RNA病毒目(Mononegavirales)、副黏病毒科(Paramyxoviridae)副黏病毒亞科(Paramyxovirinae)禽腮腺炎病毒屬[1]。NDV是家禽尤其是雞傳染性最強(qiáng)的疾病之一，能感染家禽和野生鳥(niǎo)類(lèi)。NDV 基因組約15.2 kb，編碼6種主要結(jié)構(gòu)蛋白(3′-NP-P-M-F-HN-L-5′)和2種非結(jié)構(gòu)蛋白(V和W)[2]。血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)和融合蛋白(F)是2種在NDV致病性和抗原性中起作用的表面蛋白[3-4]。F 蛋白也被廣泛用于NDV的系統(tǒng)發(fā)育分類(lèi)[5-8]，NDV可分為2類(lèi)，包括Ⅰ類(lèi)(ClassⅠ)1個(gè)基因型和Ⅱ類(lèi)(ClassⅡ)18個(gè)基因型[9-12]。根據(jù)NDV對(duì)雞的致病性，可分為高致病性、中致病性和低致病性[13-15]。F 蛋白裂解位點(diǎn)的氨基酸序列是NDV毒力的主要分子決定因子[16-17]。生物學(xué)檢測(cè)如NDV感染后雞胚的平均死亡時(shí)間(MDT)和1日齡雞的腦內(nèi)致病性指數(shù)(ICPI)與NDV對(duì)雞的致病性有關(guān)[14,16]。野生水禽被認(rèn)為是NDV 的天然儲(chǔ)存庫(kù)，一般攜帶的毒株為弱毒株，對(duì)家禽無(wú)致病性，但有研究表明家禽暴發(fā)ND與持續(xù)存在于野鳥(niǎo)體內(nèi)的NDV有關(guān)[18]。本研究旨在對(duì)分離自野鳥(niǎo)的9株NDV分離株的生物性、抗原性、致病性進(jìn)行了研究，為我國(guó)新城疫流行病學(xué)、病毒進(jìn)化的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品與雞胚從山東東營(yíng)黃河口濕地采集該區(qū)域健康野鳥(niǎo)泄殖腔拭子352份，9～11日齡SPF雞胚購(gòu)自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所SPF場(chǎng)。

1.2 主要試劑反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、Taq酶、RNA酶抑制劑、TRIzol和膠回收試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司。

1.3 病毒的分離與鑒定按照《新城疫診斷技術(shù)》(GB16550-2008)中的方法，將棉拭子樣品經(jīng)處理后接種9～11日齡SPF雞胚，37℃孵育4 d，棄掉24 h死亡雞胚，測(cè)血凝(HA)和血凝抑制(HI)效價(jià)，陽(yáng)性尿囊液-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 致病指數(shù)檢測(cè)對(duì)分離株進(jìn)行了MDT和ICPI測(cè)定，試驗(yàn)流程按照OIE 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.5 RNA提取和RT-PCR擴(kuò)增TRIzol法提取病毒RNA，然后立即反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增所用引物為：P1： 5′-CACCAAGCTGGAGAAAGGGCATAC-3′，P2：5′-CAGTATGTT-TGCAGCATTCTGGTTGG-3′。PCR反應(yīng)條件：95℃ 2 min；94℃ 40 s，58℃ 40 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，陽(yáng)性樣品送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.6 遺傳進(jìn)化分析利用分析軟件Lasergene和MAGA 5軟件對(duì)分離株和GenBank中參考毒株F基因變異區(qū)(47～420 nt)進(jìn)行序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析，采用鄰位相連法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離鑒定352份棉拭子樣品采自健康野鳥(niǎo)泄殖腔，通過(guò)接種雞胚及血凝和血凝抑制試驗(yàn)，共分離NDV 9株，其中分離自燕鴨6株、赤麻鴨2株、大麻鳽1株，NDV分離率為2.56%(9/352)。

2.2 分離株的生物學(xué)特性通過(guò)致病指數(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)8個(gè)毒株為弱毒株，如分離株CH/JL01、CH/JL02、CH/JL03、CH/JL04、CH/JL07、CH/JL08 其MDT>120 h，ICPI<0.2，分離株CH/JL05和CH/JL09 MDT>96 h，而ICPI分別為0.5和<0.2。值得注意的是分離自健康燕鴨的毒株CH/JL06為中等毒力毒株，其MDT為79 h，ICPI為1.62(表1)，該毒株對(duì)家禽的致病性有待進(jìn)一步研究。

表1 野鳥(niǎo)NDV分離株的特征

2.3 分離株的遺傳進(jìn)化分析利用MEGA 5軟件對(duì)9個(gè)分離株和36個(gè)參考株F基因高變區(qū)(47～420 nt)系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，9個(gè)分離株分屬于2個(gè)群4個(gè)基因型，包括ClassⅠ 2個(gè)基因型和ClassⅡ2個(gè)基因型(圖1)。其中CH/JL01、CH/JL02、CH/JL038和CH/JL04屬于ClassⅠ1.1.1基因型，與2010年鴨源分離株NDV 10-062高度同源；CH/JL07、CH/JL08屬于1.2基因型，與2008年鴨源分離株NDV08-046同源性最高。CH/JL05、CH/JL06 屬于基因Ⅱ型，與疫苗株 LaSota 基因高度同源。CH/JL09屬于基因Ⅰ型，與2010年鴨源分離株guangxi20同源性最高，與疫苗株V4的核苷酸同源性次之(圖1)。

圖1 9株野鳥(niǎo)源NDV分離株F基因可變區(qū)(47～420 nt)系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.4 F蛋白裂解位點(diǎn)及其毒力9個(gè)NDV分離株F蛋白裂解位點(diǎn)氨基酸基序及其生物學(xué)特性見(jiàn)表1。CH/JL01、CH/JL02、CH/JL038、CH/JL04、CH/JL07、CH/JL08 等6個(gè)分離株F蛋白裂解位點(diǎn)氨基酸序列為112E-R-Q-E-R-L117，具有典型低毒力NDV的分子特征。分離株CH/JL05、CH/JL06 和CH/JL09的基序?yàn)?12G-R-Q-G-R-L117，與疫苗株LaSota的基序相同，為低毒力株。然而MD和ICPI試驗(yàn)表明分離株CH/JL06/為中等毒力毒株，這與系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果不一致，表明F蛋白的裂解位點(diǎn)基序并不是決定NDV毒力的唯一因素。

3 討論

NDV可分為2大類(lèi)，包括Ⅰ類(lèi)1個(gè)基因型和Ⅱ類(lèi)18個(gè)基因型[9-12]，Ⅰ類(lèi)NDV在活禽市場(chǎng)和野鳥(niǎo)中分離較多，多為不致病的弱毒株[14,18-20]，國(guó)內(nèi)外對(duì)其分子流行病學(xué)研究報(bào)道較少。已有的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示我國(guó)目前Ⅰ類(lèi)NDV主要分布于我國(guó)華東、華中、華南和西南等東部和南部地區(qū)[19]。山東東營(yíng)黃河口濕地位于東亞—澳大利亞西亞候鳥(niǎo)遷徙線路上，是鳥(niǎo)類(lèi)南北遷徙的重要中轉(zhuǎn)站和越冬棲息地。本研究從山東東營(yíng)黃河口濕地健康野鳥(niǎo)的352份棉拭子樣品中分離了9株NDV病毒，分離率為2.56%(9/352)，其中Ⅰ類(lèi)NDV 6株，表明Ⅰ類(lèi)NDV在野鳥(niǎo)中的污染面廣分離率高，與研究報(bào)道結(jié)果相符[19-20]。Ⅰ類(lèi)NDV1.1.2基因型是目前野鳥(niǎo)源NDV的優(yōu)勢(shì)基因型[20]，本試驗(yàn)分離的NDV中有4個(gè)毒株屬于1.1.1基因型，與2010年鴨源分離株NDV 10-062高度同源；2株屬于1.2基因型，與2008年分離于家鴨的毒株NDV08-046同源性最高[21]，一方面說(shuō)明這2個(gè)基因型NDV在山東東營(yíng)地區(qū)野鳥(niǎo)中占比較高，另一方面也說(shuō)明病毒傳播可能發(fā)生在禽類(lèi)和野生鳥(niǎo)類(lèi)之間。由于這2個(gè)宿主間常發(fā)生NDV毒株的持續(xù)交換[22]，因此養(yǎng)殖場(chǎng)需要排除野生鳥(niǎo)類(lèi)對(duì)家禽的干擾。

本試驗(yàn)分離了2株NDV CH/JL05和CH/JL06與疫苗毒LaSota高度同源，同屬于基因Ⅱ型，其F蛋白裂解位點(diǎn)氨基酸基序?yàn)?12G-R-Q-G-R-L117，符合低毒力NDV分子特征。MDT和ICPI致病性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)毒株CH/JL05的生物學(xué)試驗(yàn)結(jié)果與分子特征相符，為低毒力株，而另一分離株CH/JL06 MDT和ICPI分別為79 h和1.62，是中等毒力的毒株，這與系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果及F蛋白裂解位點(diǎn)處的分子特征不符，表明F蛋白裂解位點(diǎn)基序不是決定NDV毒力的唯一因素，感染宿主的不同可能也是NDV毒力和致病力存在極大差異的因素。推測(cè)毒株CH/JL06可能來(lái)源于家禽疫苗毒，在野鳥(niǎo)體內(nèi)其毒力逐漸變強(qiáng)，盡管不清楚其在自然界中毒力變強(qiáng)的機(jī)制，但在實(shí)驗(yàn)室中已經(jīng)被證實(shí)低毒力株可在氣囊傳代中變?yōu)閺?qiáng)毒株[23]。野鳥(niǎo)是NDV的天然儲(chǔ)庫(kù)，其攜帶的NDV基因譜廣泛，有的毒株甚至有返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)家禽養(yǎng)殖構(gòu)成巨大的潛在威脅。盡管我國(guó)實(shí)施了嚴(yán)格的 ND疫苗接種計(jì)劃，使得ND的發(fā)生由大流行轉(zhuǎn)變?yōu)樯l(fā)性疾病，但來(lái)自宿主的選擇性免疫壓力可以促進(jìn)NDV的進(jìn)化，在接種LaSota弱毒疫苗的家禽中也不斷發(fā)生ND疫情[8]，因此有必要進(jìn)一步加強(qiáng)野鳥(niǎo)的NDV監(jiān)控和流行病學(xué)調(diào)查。