雞血藤總黃酮對(duì)環(huán)磷酰胺所致小鼠肝損傷的保護(hù)作用

史鑫銳，陳瀅鍇，陳中婷，趙尉丹，江明生，陳海蘭

（1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005；2.北京生泰爾科技股份有限公司，北京 102600）

雞血藤為豆科（Leguminosae）密花豆屬植物密花豆（Spatholobus suberectus Dunn）的干燥藤莖［1］，又名大血藤，分布于廣西、云南、廣東、貴州、福建等地，主產(chǎn)于廣西，以廣西產(chǎn)者為道地藥材［2］。 雞血藤性溫，味苦、甘，歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)血活血、舒筋活絡(luò)［3］的功效，常用于治療月經(jīng)不調(diào)、血虛萎黃、 麻木癱瘓及風(fēng)濕麻痹等。 現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，雞血藤具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、酪氨酸酶雙向調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)靜催眠［4-5］等作用。雞血藤的化學(xué)成分主要含有黃酮類（包括異黃酮類、黃酮醇類、異黃烷類等）、萜類、甾醇類、木質(zhì)素類、蒽醌類及兒茶素類化合物等［6］。 陳海蘭等［7］發(fā)現(xiàn)雞血藤總黃酮對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹急性炎癥具有較強(qiáng)的抑制作用， 且在體外對(duì)LPS 刺激免疫細(xì)胞引起的NO 和炎癥細(xì)胞因子的分泌具有顯著抑制作用，證實(shí)雞血藤總黃酮具有抗炎活性。同時(shí)， 雞血藤總黃酮乙酸乙酯部位對(duì)LPS 處理RAW264.7 細(xì)胞引起的氧化應(yīng)激損傷具有一定的保護(hù)作用， 能降低LPS 誘導(dǎo)氧化應(yīng)激細(xì)胞內(nèi)ROS和NO 的含量，具有抗氧化作用［8］。 王妮佳等［9］發(fā)現(xiàn)雞血藤總黃酮能抑制HeLa 細(xì)胞由G0/G1 期向S 期與G2/M 期的轉(zhuǎn)化，具有抗腫瘤功能。

環(huán)磷酰胺是臨床上廣泛應(yīng)用的化學(xué)藥物，主要用于自身免疫性疾病，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡、腎病綜合征以及癌癥的治療［10］，但毒副作用比較大，可導(dǎo)致膀胱損傷、肝損傷、免疫抑制、脫發(fā)、畸形等［5，11］。 環(huán)磷酰胺代謝活化物的治療作用是非常明顯的， 但其毒性作用目前還沒(méi)有有效的防治對(duì)策［12］。 該試驗(yàn)旨在探討雞血藤總黃酮對(duì)環(huán)磷酰胺所致小鼠肝損傷的保護(hù)作用， 為減輕環(huán)磷酰胺的毒副作用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明系小鼠60 只，SPF 級(jí)，體重（20±2）g，雌雄各半，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房標(biāo)準(zhǔn)籠中飼養(yǎng)7 d，自由進(jìn)食、飲水，使其適應(yīng)環(huán)境。 試驗(yàn)前禁食12 h，禁水6 h。

1.1.2 藥品與試劑

雞血藤總黃酮（TFSD），棕黃色粉末，由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室通過(guò)乙醇提取法從廣西崇左產(chǎn)雞血藤中提取得到。 環(huán)磷酰胺（CTX）， 購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司。 黃嘌呤氧化酶（XOD）、超氧化物歧化酶（SOD）、髓過(guò)氧化物歧化酶（MPO）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）等檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究中心。 TNFα、IL-6 與IL1-β 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒購(gòu)于美國(guó)eBioscience 公司。

1.1.3 儀器設(shè)備

電子分析天平 （型號(hào)：AB104-L）， 瑞士梅特勒—托利多公司產(chǎn)品； 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) （型號(hào)：3K-15），德國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品；超純水儀（型號(hào)：Q5UV），美國(guó)Millipore 公司產(chǎn)品；多功能酶標(biāo)儀（型號(hào)：Multimode Plate Reader），瑞士PerkinElmer公司產(chǎn)品。 全自動(dòng)生化分析儀（型號(hào)：AU5800），貝克曼庫(kù)爾特公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)小鼠的分組與處理

將60 只昆明系小鼠隨機(jī)分為6 組： 對(duì)照組、CTX 組、TFSD100 組、CTX ＋TFSD25 組、CTX ＋TFSD50 組、CTX＋TFSD100 組，每組10 只，雌雄各半。 對(duì)小鼠腹腔注射CTX 建立肝損傷模型，灌胃給予不同劑量TFSD。試驗(yàn)周期為7 d。具體處理方法見(jiàn)表1。

表1 小鼠分組與處理方法

1.2.2 肝組織氧化還原相關(guān)酶活力水平的測(cè)定

小鼠處死后，采集肝臟，取一小塊稱重，按照1∶9 比例加入預(yù)冷的生理鹽水，制成勻漿。然后將勻漿轉(zhuǎn)移至滅菌的1.5 mL EP 管內(nèi)，4 ℃、5 000 r/min離心10 min 后，取上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)SOD、XOD、MPO 和GSH-Px 活力。

1.2.3 血液生化檢查

眼球采血獲取血液樣本后，4 ℃、5 000 r/min離心5 min，然后取部分血清，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和堿性磷酸酶（ALP）活力。

1.2.4 炎癥因子水平的檢測(cè)

從“1.2.3”項(xiàng)下分離的血清中取部分樣品采用商品化ELISA 試劑盒檢測(cè)炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β 水平。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），采用LSD 法進(jìn)行組間比較，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞血藤總黃酮對(duì)環(huán)磷酰胺所致肝損傷小鼠肝臟中氧化還原酶活力的影響

如表2 所示，經(jīng)CTX 處理后，小鼠肝臟中的SOD 和GSH-Px 活力與對(duì)照組小鼠相比顯著下降（P＜0.05）， 表明CTX 可引起小鼠肝臟中氧化還原酶活力的代償性降低。 25、50、100 mg/（kg·BW）的TFSD 處理均可顯著（P＜0.05）抑制由CTX 引起的SOD 活力降低，25 mg/（kg·BW） 的TFSD 可顯著（P＜0.05）抑制CTX 處理小鼠的GSH-Px 活力。

表2 小鼠肝臟氧化還原酶活力測(cè)定結(jié)果（n=10）

另外，CTX 處理可引起小鼠肝臟中XOD 和MPO 活力顯著（P＜0.05）升高，而單獨(dú)給予TFSD 處理的小鼠肝臟XOD 和MPO 活力與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05），表明CTX 可引起肝臟中氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，而TFSD 則對(duì)肝臟中氧化還原狀態(tài)無(wú)不良影響。 不同劑量的TFSD 處理可抑制CTX 引起的XOD 和MPO 活力升高，50、100 mg/（kg·BW）的TFSD 處理組可顯著（P＜0.05）抑制由CTX 引起的XOD 活 力 升 高，25、50、100 mg/（kg·BW）的TFSD 處理均可顯著（P＜0.05）抑制由CTX 引起的MPO 活力升高。

2.2 雞血藤總黃酮對(duì)環(huán)磷酰胺所致肝損傷小鼠血液生化指標(biāo)的影響

如表3 所示，CTX 處理對(duì)小鼠血清中的AST活力無(wú)顯著（P＞0.05）影響，但顯著（P＜0.05）降低ALT 活力，而單獨(dú)使用TFSD 顯著（P＜0.05）降低小鼠血清中的ALT 和AST 活力。 對(duì)CTX 處理的小鼠給予25、50 mg/（kg·BW）TFSD 可顯著 （P＜0.05）降低血清中AST 活力，給予25、50、100 mg/（kg·BW）TFSD 均可顯著（P＜0.05）降低血清中的ALT活力。

表3 小鼠血液生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果（n=10） 單位：U/L

另外，CTX 處理可顯著（P＜0.05）提高小鼠血清中的ALP 活力，而經(jīng)CTX 處理的TFSD 組ALP活力與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05），表明CTX可引起小鼠血清中ALP 活力升高， 而TFSD 則對(duì)ALP 活力無(wú)明顯影響。 用25、50、100 mg/（kg·BW）的TFSD 處理后，均可顯著（P＜0.05）抑制由CTX導(dǎo)致的ALP 活力升高。

2.3 雞血藤總黃酮對(duì)環(huán)磷酰胺所致肝損傷小鼠炎癥因子分泌水平的影響

由表4 可知，CTX 處理小鼠后， 血清中TNFα 水平有所升高，但與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05），給予25、50 mg/（kg·BW）的TFSD 可略微降低CTX 處理小鼠血清中的TNF-α 水平， 但與CTX 組及對(duì)照組相比差異均不顯著（P＞0.05）。

表4 小鼠血清中炎癥因子分泌水平的測(cè)定結(jié)果（n=10） 單位：pg/mL

CTX 可顯著（P＜0.05）升高小鼠血清中的IL-6水平， 而TFSD100 組與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）。 另外，TFSD 處理未能有效抑制CTX 引起的IL-6 水平升高，25、50、100 mg/（kg·BW）劑量組與CTX 組相比差異均不顯著（P＞0.05）。

與對(duì)照組相比，腹腔注射CTX 后，小鼠血清中的IL-1β 水平顯著（P＜0.05）升高，而TFSD100組的IL-1β 水平與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異 （P＞0.05）。 對(duì)經(jīng)CTX 處理的小鼠給予不同劑量的TFSD，均可顯著（P＜0.05）抑制CTX 引起的IL-1β水平升高。

3 討論

環(huán)磷酰胺是臨床常用的惡性腫瘤治療藥物，主要代謝產(chǎn)物丙烯醛可引起肝細(xì)胞壞死， 導(dǎo)致肝小葉中心充血，肝毒性作用可能與氧化應(yīng)激有關(guān)。該研究通過(guò)腹腔注射環(huán)磷酰胺建立小鼠肝損傷模型，并給予不同劑量的雞血藤總黃酮，通過(guò)分析肝組織中氧化還原酶活力、 血液中炎癥因子分泌水平和血液生化指標(biāo)， 探討雞血藤總黃酮對(duì)環(huán)磷酰胺所致肝損傷的保護(hù)作用。

幾乎所有的細(xì)胞個(gè)體有一套完整的自我保護(hù)系統(tǒng)，用來(lái)清除新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的羥自由基、過(guò)氧化物自由基、過(guò)氧化氫等氧化物質(zhì)，保護(hù)生物大分子免受氧化損傷［13-14］。 SOD、GSH-Px、XOD 和MPO 是維持機(jī)體氧化還原平衡的重要酶，其活力變化直接反映機(jī)體氧化還原狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酰胺可引起小鼠體內(nèi)SOD 和GSH-Px 水平顯著下降，表明環(huán)磷酰胺可打破小鼠體內(nèi)氧化還原動(dòng)態(tài)平衡，引起氧化應(yīng)激，造成肝損傷［15-16］。 邢家瑋等［17］發(fā)現(xiàn)腹腔注射環(huán)磷酰胺可引起小鼠體內(nèi)MPO 水平顯著升高，SOD 水平顯著降低，與該研究結(jié)果一致。 胡小艷等［18］發(fā)現(xiàn)腹腔注射環(huán)磷酰胺可導(dǎo)致XOD 活力顯著提高。 在該研究中，腹腔注射環(huán)磷酰胺引起小鼠肝臟內(nèi)SOD 和GSH-Px 活力顯著下降，XOD 和MPO 活力顯著提高，與前人報(bào)道一致。 使用環(huán)磷酰胺處理小鼠并給予不同劑量的雞血藤總黃酮可提高小鼠肝臟中的SOD 和GSH-Px活力， 降低環(huán)磷酰胺處理小鼠肝臟中的XOD 和MPO 活力，表明雞血藤總黃酮可通過(guò)改變氧化還原酶的活力， 改善環(huán)磷酰胺處理小鼠肝臟中的氧化還原狀態(tài)，保護(hù)機(jī)體不受氧化損傷。

谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）廣泛存在于肝臟組織細(xì)胞內(nèi)， 在機(jī)體蛋白質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用， 這兩個(gè)酶的活力直接反映肝組織的損傷程度，而血清中的ALP 水平對(duì)骨骼、肝膽系統(tǒng)的損傷具有指示意義。 環(huán)磷酰胺的肝毒性作用曾被多次報(bào)道， 對(duì)小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺可引起AST 和ALP 活力顯著升高， 而中藥復(fù)方柴胡垂盆湯［19］、中藥活性成分水蘇糖［20］、藍(lán)莓 花 苷［21］、楊梅素［22］可抑制環(huán)磷酰胺引起的ALT 和AST 水平升高，減輕環(huán)磷酰胺所致肝損傷。 在該研究中，腹腔注射環(huán)磷酰胺后，小鼠血清中的ALP 活力顯著升高，提示模型小組的骨骼和肝膽系統(tǒng)造成了損傷，而使用雞血藤總黃酮處理后，血清ALP 水平顯著下降，表明雞血藤總黃酮對(duì)環(huán)磷酰胺引起的骨骼、肝膽系統(tǒng)損傷具有抑制作用。但是，在該研究中經(jīng)環(huán)磷酰胺處理后，血清中的AST 與ALT 活力水平出現(xiàn)下降，且經(jīng)中低劑量的雞血藤總黃酮處理后，AST 與ALP 水平進(jìn)一步下降， 推測(cè)可能是環(huán)磷酰胺對(duì)肝臟中包括AST 和ALP 在內(nèi)的多種代謝酶的活性產(chǎn)生了一定程度的抑制作用。 此外， 關(guān)于TFSD 的急性毒性試驗(yàn)在國(guó)內(nèi)外還未有報(bào)道，急性毒性可能是造成藥物劑量較高的CTX+TFSD100組的AST 活力與ALP 活力不降反增的原因，具體還需驗(yàn)證。

TNF-α 是巨噬細(xì)胞清除病原微生物或殺死腫瘤細(xì)胞的主要效應(yīng)分子，參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生，且出現(xiàn)在炎癥反應(yīng)的最早期［18］。 分泌的TNF-α 可激活中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，加速其他炎癥因子，如IL-1β、IL-6 等的釋放，擴(kuò)大連鎖反應(yīng)，使機(jī)體產(chǎn)生炎癥［23］。 IL-6 是炎癥反應(yīng)的促發(fā)劑，能誘導(dǎo)B 淋巴細(xì)胞的增殖與分化，從而促使其分泌中和抗體，并可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答與血細(xì)胞的生成。IL-1β和TNF-α 稱為前炎癥因子，在早期固有免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答中具有十分重要的作用。但是，這些炎癥因子的過(guò)量分泌可引起機(jī)體發(fā)熱、腫痛、組織細(xì)胞損壞，導(dǎo)致組織細(xì)胞變性和壞死。 在該研究中，腹腔注射環(huán)磷酰胺提高了TNF-α、IL-1β 和IL-6的分泌水平，且IL-1β 與IL-6 水平與對(duì)照組相比差異顯著，表明環(huán)磷酰胺引起小鼠發(fā)生炎癥反應(yīng)。對(duì)環(huán)磷酰胺處理小鼠給予中低劑量的雞血藤總黃酮，可抑制這幾種炎癥因子的釋放，對(duì)IL-1β 水平的代償性升高表現(xiàn)出顯著的抑制作用， 提示雞血藤總黃酮對(duì)環(huán)磷酰胺引起的炎癥反應(yīng)具有一定的抑制作用， 可保護(hù)機(jī)體組織在炎癥反應(yīng)中免受損傷。但值得注意的是，在正常小鼠和環(huán)磷酰胺處理小鼠中使用100 mg/（kg·BW）TFSD 的小鼠均出現(xiàn)了TNF-α 水平的升高， 由于TNF-α 在細(xì)胞免疫功能調(diào)節(jié)中具有重要作用，TNF-α 水平的升高提示高劑量的TFSD 可能會(huì)通過(guò)早期炎癥的調(diào)節(jié)增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。

4 結(jié)論

腹腔注射環(huán)磷酰胺可造成小鼠肝臟發(fā)生氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，表現(xiàn)為SOD 與GSHPx 活力顯著降低，MPO、XOD 與ALP 活力顯著升高，以及TNF-α、IL-1β 和IL-6 釋放水平升高。 低劑量的雞血藤總黃酮對(duì)環(huán)磷酰胺引起的肝臟氧化還原酶SOD、GSH-Px、XOD、MPO，血清ALP，以及炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的代償性改變具有抑制作用， 且低劑量組的效果最明顯，除XOD、TNF-α、IL-6 外，均具有顯著抑制作用，表明雞血藤總黃酮可通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠肝組織中的氧化還原狀態(tài)及炎癥因子釋放， 對(duì)環(huán)磷酰胺所致肝損傷提供保護(hù)，推薦劑量為25 mg/（kg·BW）。