腹腔注射GnIH 對(duì)雄性小鼠采食、體重和血糖穩(wěn)態(tài)的影響

羅榮榮，陳 磊，徐文鎬，宋星星，張 鑫，左劍雨，2，胡 文，石 艷，韓冬洋，曹雅潔，李 珣

（1. 廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 廣西 南寧 530004；2. 廣西東盟經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所， 廣西 南寧530105）

促性腺激素抑制激素（gonadotropin-inhibitory hormone，GnIH）是Tsutsui 等［1］于2000 年首次在鵪鶉下丘腦內(nèi)分離鑒定到的一種由12 個(gè)氨基酸構(gòu)成的神經(jīng)肽， 該神經(jīng)肽能夠抑制促性腺激素釋放激素的分泌。后續(xù)研究表明，在哺乳動(dòng)物中也存在與GnIH 結(jié)構(gòu)相似的神經(jīng)肽， 其中，RF 酰胺相關(guān)肽-3 （RF amide-related peptide 3，RFRP-3）與GnIH 的生理功能一致，二者均通過(guò)G 蛋白耦聯(lián)受體147（G-protein coupled receptor 147，GPR147）參與動(dòng)物生殖以及內(nèi)分泌、 免疫和攝食等生理過(guò)程的調(diào)控［2-4］。隨著對(duì)GnIH 研究的不斷深入，其在能量代謝方面的調(diào)控作用逐漸展現(xiàn)。有研究表明，下丘腦作為神經(jīng)中樞關(guān)鍵腦區(qū)也參與了動(dòng)物的采食行為和糖代謝調(diào)控［5］。 哺乳動(dòng)物的GnIH 神經(jīng)元主要分布于下丘腦、室旁核、弓狀核和腹內(nèi)側(cè)核等能量調(diào)控區(qū)域［6］。 同時(shí)，Johnson 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)大鼠側(cè)腦室注射GnIH 可導(dǎo)致注射后2 h 內(nèi)食物的攝取量顯著增加。 上述試驗(yàn)結(jié)果有力地證明了GnIH 有可能直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)食欲和能量代謝調(diào)控區(qū)域， 從而參與動(dòng)物的采食行為和代謝的調(diào)控。綿羊和獼猴腦室注射GnIH 增加了食物攝入量，但不影響能量消耗以及動(dòng)物性行為［8-9］。Clarke 等［10］發(fā)現(xiàn)GnIH 會(huì)在限飼條件下被激活，此時(shí)動(dòng)物食欲增加，繁殖行為減少，體內(nèi)GnIH 免疫反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量也減少。 Huo 等［11］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腹腔注射GnIH， 激光共聚焦結(jié)果顯示：GnIH及其受體GPR147 在胰島均有分布，GnIH 在胰島α 細(xì)胞和β 細(xì)胞上均有表達(dá)， 且與胰高血糖素存在共定位。 葡萄糖耐量試驗(yàn)是評(píng)估血糖調(diào)節(jié)能力的重要試驗(yàn)， 胰島素耐量試驗(yàn)是評(píng)價(jià)動(dòng)物胰島素敏感性的重要試驗(yàn)。 該試驗(yàn)對(duì)雄性昆明小鼠腹腔注射GnIH，考查其葡萄糖耐量、胰島素分泌功能和胰島素敏感性是否受到影響， 并探究該神經(jīng)肽對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能及胰島素轉(zhuǎn)錄因子基因（NeuroD1）、胰島素基因（Ins）、胰高血糖素基因（Gcg）、胰島素轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因 （Pdx1） 表達(dá)水平的影響，為豐富動(dòng)物能量代謝理論提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明系小白鼠20 只， 雄性，6 周齡， 體重（26.1±0.3）g，購(gòu)自廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。對(duì)飼養(yǎng)環(huán)境的溫度（25±2）℃、濕度（55±5）%和光照（12 L∶12 D，每天7：00 開(kāi)燈）進(jìn)行嚴(yán)格控制。

1.1.2 試劑與儀器

Trizol、 反轉(zhuǎn)錄酶、DNAMarker、 核苷酸（Oligo dT18）、dNTPs、rTaq DNA 聚 合 酶、Golden View 核酸染料，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；1 mL注射器和葡萄糖購(gòu)自南寧吉運(yùn)生物科技有限公司；舒泰（Zoletil 50）購(gòu)自法國(guó)維克公司；胰島素購(gòu)自諾和諾德公司；血糖試紙、輔理善越佳型至新血糖儀， 購(gòu)自英國(guó)雅培糖尿病護(hù)理公司； 羅氏LightCycler96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀為Roche 公司產(chǎn)品。

胰島素轉(zhuǎn)錄因子基因（NeuroD1）、胰島素基因（Ins）、胰高血糖素基因（Gcg）、胰島素轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因（Pdx1）及β-actin 基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR（qPCR） 分析引物均由深圳華大基因科技有限公司設(shè)計(jì)及合成。 引物信息見(jiàn)表1。

表1 qPCR 引物信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

20 只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后， 隨機(jī)分為2組，每組10 只，分別為對(duì)照組［腹腔注射生理鹽水100 μL/（次·只）］和試驗(yàn)組［腹腔注射20 μg/100 μL GnIH，100 μL/（次·只）］， 每組10 只， 每天注射2次（8：00 和20：00 各1 次），連續(xù)注射21 d。

1.2.2 生長(zhǎng)性能指標(biāo)測(cè)定

從試驗(yàn)開(kāi)始的第1 天對(duì)鼠糧及體重進(jìn)行稱量、記錄。 每天分別于8：00 和20：00 準(zhǔn)時(shí)對(duì)小鼠的體重及剩余鼠糧進(jìn)行稱重并記錄，在此期間小鼠可自由采食及飲水。計(jì)算平均日增重和平均日采食量。平均日增重=（試驗(yàn)結(jié)束時(shí)體重-試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)體重）/試驗(yàn)天數(shù)，平均日采食量=總采食量/天數(shù)［12］。

1.2.3 空腹血糖、葡萄糖耐量及胰島素耐量的檢測(cè)

1.2.3.1 空腹血糖檢測(cè)

空腹血糖檢測(cè)方法參考已有文獻(xiàn)報(bào)道［13］，試驗(yàn)第8 天22：00 對(duì)所有小鼠禁食10 h 處理，試驗(yàn)第9 天8：00 對(duì)所有實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行麻醉，當(dāng)其處于穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)， 使用快速血糖儀檢測(cè)尾靜脈血糖濃度，之后立即進(jìn)行1 次腹腔注射，即對(duì)照組注射生理鹽水100 μL/只， 試驗(yàn)組注射20 μg/100 μL 的GnIH 100 μL/只，此時(shí)記為T=0 min，在T=15、30、45、75、135 min 對(duì)血糖進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3.2 葡萄糖耐量檢測(cè)

葡萄糖耐量檢測(cè)方法參考已有文獻(xiàn)報(bào)道［13］，試驗(yàn)第12 天22：00 對(duì)所有小鼠禁食10 h 處理，試驗(yàn)第13 天8：00 對(duì)所有實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行麻醉，當(dāng)其處于穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)， 使用快速血糖儀檢測(cè)尾靜脈血糖濃度，接著每只小鼠按照2 g/（kg·BW）的劑量腹腔注射0.5 g/mL 的葡萄糖溶液1 次， 此時(shí)記為T=0 min。 在T=15 min 血糖測(cè)定結(jié)束后，進(jìn)行1 次腹腔注射， 即對(duì)照組注射生理鹽水100 μL/只、試驗(yàn)組注射20 μg/100 μL 的GnIH 100 μL/只， 并在T=30、45、75、135 min 時(shí)對(duì)小鼠的血糖進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3.3 胰島素耐量檢測(cè)

胰島素耐量檢測(cè)方法參考已有文獻(xiàn)報(bào)道［13］，試驗(yàn)第16 天22：00 對(duì)所有小鼠禁食10 h 處理，試驗(yàn)第17 天8：00 對(duì)所有實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行麻醉，當(dāng)其處于穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)， 使用快速血糖儀檢測(cè)尾靜脈血糖濃度，此時(shí)記為T=0 min；接著每只小鼠按照2.7 U/（kg·BW） 的劑量腹腔注射0.5 U/mL 的胰島素1 次。 在T=15 min 血糖測(cè)定結(jié)束后，進(jìn)行1 次腹腔注射， 即對(duì)照組注射生理鹽水100 μL/只、試驗(yàn)組注射20 μg/100 μL 的GnIH 100 μL/只， 并在T=30、45、75、135 min 時(shí)對(duì)小鼠的血糖進(jìn)行測(cè)定。

血糖曲線下面積計(jì)算方法參考已有文獻(xiàn)報(bào)道［14］：血糖曲線下面積（min·mg/dL）=15 min×［1/2×（BG0＋BG135）＋1×（BG15＋BG30＋BG45＋BG75＋BG135）］，使用梯形規(guī)則法。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)胰腺中Gcg、Ins、Pdx1、NeuroD1 基因mRNA 表達(dá)水平

試驗(yàn)結(jié)束后解剖小鼠，分離胰腺，經(jīng)液氮速凍處理后轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱保存，按照Trizol 試劑的說(shuō)明書(shū)在無(wú)RNA 酶的環(huán)境下提取總RNA， 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄并獲得cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系20 μL：rTaq DNA 聚合酶10 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板1 μL，ddH2O 8.2 μL；反應(yīng)程序：95 ℃酶激活2 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

使用Graphad prism 6.0 和Adobe illustrator 2019 軟件作圖。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)后符合正態(tài)分布， 使用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。 數(shù)據(jù)表示形式為 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）”。

2 結(jié)果與分析

2.1 腹腔注射GnIH 對(duì)小鼠平均日增重、平均日采食量的影響

由表2 可知，與對(duì)照組相比，腹腔注射GnIH可使小鼠平均日增重極顯著（P＜0.01）升高；腹腔注射GnIH 可使小鼠平均日采食量極顯著 （P＜0.01）升高。

表2 腹腔注射GnIH 對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響 單位：g

2.2 腹腔注射GnIH 對(duì)小鼠空腹血糖的影響

空腹血糖測(cè)定結(jié)果如圖1 所示， 小鼠禁食10 h 腹腔注射GnIH 能夠促進(jìn)小鼠血糖的升高，與對(duì)照組相比，腹腔注射GnIH 在T=15 min 時(shí)血糖升高并達(dá)到最高值（P＜0.001）；隨后在T=30～135 min時(shí)段血糖逐漸下降， 但試驗(yàn)組的血糖仍然顯著高于對(duì)照組。 此外，如圖2 所示，在禁食10 h 后腹腔注射GnIH 能夠極顯著（P＜0.01）增加小鼠空腹血糖曲線下面積。

圖1 慢性腹腔注射GnIH 對(duì)雄性小鼠空腹血糖的影響

圖2 慢性腹腔注射GnIH 后雄性小鼠空腹血糖曲線下面積

2.3 腹腔注射GnIH 對(duì)小鼠葡萄糖耐量的影響

葡萄糖耐量試驗(yàn)是評(píng)價(jià)動(dòng)物血糖代謝功能的重要試驗(yàn)，結(jié)果如圖3 所示。 與對(duì)照組相比，腹腔注射GnIH 后的第15 分鐘時(shí)（T=30 min）血糖顯著（P＜0.05）升高；此外，如圖4 所示雄性小鼠葡萄糖耐量的血糖曲線下面積極顯著（P＜0.01）增加。

圖3 慢性腹腔注射GnIH 對(duì)雄性小鼠葡萄糖耐量的影響

圖4 慢性腹腔注射GnIH 后雄性小鼠葡萄糖耐量的血糖曲線下面積

2.4 腹腔注射GnIH 對(duì)小鼠胰島素耐量的影響

胰島素耐量試驗(yàn)是評(píng)價(jià)動(dòng)物胰島素敏感性的重要試驗(yàn)，結(jié)果如圖5 所示。 與對(duì)照組血糖相比，腹腔注射GnIH 能夠減緩小鼠血糖的降低， 并在T=30 min 時(shí)有顯著差異（P＜0.05）；此外，如圖6 所示雄性小鼠胰島素耐量的血糖曲線下面積極顯著（P＜0.01）增加。

圖5 慢性腹腔注射GnIH 對(duì)小鼠胰島素耐量的影響

圖6 慢性腹腔注射GnIH 后雄性小鼠胰島素耐量的血糖曲線下面積

2.5 腹腔注射GnIH 對(duì)小鼠胰腺Gcg 基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量的影響

結(jié)果如圖7 所示，慢性腹腔注射GnIH 后雄性小鼠胰腺Gcg 基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量顯著（P＜0.05）高于對(duì)照組。

圖7 慢性腹腔注射GnIH 對(duì)雄性小鼠胰腺Gcg 基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量的影響

2.6 腹腔注射GnIH 對(duì)小鼠胰腺Ins 基因mR-NA 相對(duì)表達(dá)量的影響

結(jié)果如圖8 所示，慢性腹腔注射GnIH 后雄性小鼠胰腺Ins 基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量顯著 （P＜0.05）低于對(duì)照組。

圖8 慢性腹腔注射GnIH 對(duì)雄性小鼠胰腺Ins 基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量的影響

2.7 腹腔注射GnIH 對(duì)小鼠胰腺pdx1 基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量的影響

結(jié)果如圖9 所示，慢性腹腔注射GnIH 后雄性小鼠胰腺Pdx1 基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量顯著（P＜0.05）低于對(duì)照組。

圖9 慢性腹腔注射GnIH 對(duì)雄性小鼠胰腺Pdx1 基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量的影響

2.8 腹腔注射GnIH 對(duì)小鼠胰腺NeurD1 基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖10 可知， 慢性腹腔注射GnIH 后雄性小鼠胰腺NeuroD1 基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量顯著（P＜0.05）低于對(duì)照組。

圖10 慢性腹腔注射GnIH 對(duì)雄性小鼠胰腺NeurD1 基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討論

自發(fā)現(xiàn)GnIH 以來(lái)，關(guān)于GnIH 的研究主要集中在生殖調(diào)控方面。 隨著研究的不斷深入，GnIH已經(jīng)被證明是能夠影響采食并可能參與能量代謝的神經(jīng)內(nèi)分泌因子［15］。 該試驗(yàn)通過(guò)對(duì)昆明小鼠進(jìn)行慢性腹腔注射GnIH，探究該神經(jīng)肽對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能及能量代謝的影響， 以期為在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中提高生產(chǎn)性能提供新思路和基礎(chǔ)理論依據(jù)。

Tsutsui 及其同事研究了GnIH 是否將代謝信息傳遞到HPG 軸并調(diào)節(jié)神經(jīng)饋送回路［4］。 在鳥(niǎo)類中，側(cè)腦室注射抗GnIH 抗血清可抑制禁食誘導(dǎo)的食欲，支持GnIH 在進(jìn)食中的刺激作用。Fraley 等［16］還報(bào)道了GnIH 的側(cè)腦室注射降低了成年北京鴨的血漿LH 黃體生成素（luteinizing hormone,LH）濃度并增加了攝食量。 此外，Tachibana 等［17］研究了向雛雞側(cè)腦室內(nèi)注射GnIH 會(huì)刺激食物攝入，揭示了GnIH 在雛雞中誘導(dǎo)的中樞促食欲機(jī)制。在哺乳動(dòng)物中，GnIH 的側(cè)腦室給藥也增加了大鼠［7］和綿羊［10］的食物攝入量。以上研究與該試驗(yàn)結(jié)果一致。

該研究結(jié)果表明小鼠腹腔注射GnIH 具有快速升血糖的作用。 當(dāng)機(jī)體血糖升高時(shí)會(huì)刺激胰島β 細(xì)胞中胰島素分泌增加， 而胰島素可促進(jìn)體細(xì)胞對(duì)血糖的吸收和利用， 并促進(jìn)糖原合成和抑制糖異生，進(jìn)而發(fā)揮其維持血糖平衡的生理功能［18］。此外， 慢性腹腔注射GnIH 小鼠在注射葡萄糖后，其血糖與對(duì)照組相比顯著升高，GnIH 可能降低了機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性，導(dǎo)致葡萄糖清除率顯著下降。 胰島素抵抗的特征是機(jī)體對(duì)胰島素的不敏感以及對(duì)血液中葡萄糖的攝取能力下降， 當(dāng)機(jī)體處于胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)時(shí)會(huì)引起血糖濃度的升高。 該研究表明慢性腹腔注射GnIH 會(huì)引起小鼠血糖代謝的紊亂。 胰島素是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能夠直接降低機(jī)體血糖的激素，在靶器官的代謝影響了整個(gè)機(jī)體的血糖平衡， 而胰島素抵抗（insulin resistance，IR）即機(jī)體細(xì)胞對(duì)胰島素的反應(yīng)表現(xiàn)為不敏感，這將直接影響體內(nèi)血糖的吸收和糖原的分解［19］。 因此， 胰島素抵抗被認(rèn)為是引起能量代謝紊亂發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)重要因素。

研究表明，GnIH 在動(dòng)物的中樞及外周組織器官均有不同程度的表達(dá)和分布［20-21］。 而在該研究中，對(duì)慢性腹腔注射GnIH 小鼠胰腺中的Gcg、Ins、Pdx1、NeuroD1 基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比慢性腹腔注射GnIH小鼠胰腺Gcg 基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量顯著（P＜0.05）升高，Ins、Pdx1、NeuroD1 基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量顯著（P＜0.05）降低。2 種β 細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Pdx1 和NeuroD1 已被證明在葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素基因轉(zhuǎn)錄和胰腺β 細(xì)胞功能中起關(guān)鍵作用［22-23］。 在2 型糖尿病中，由于不能再分泌足夠的胰島素維持正常的血糖水平， 胰島素分泌率總體上有所下降［24］。 這與該試驗(yàn)結(jié)果一致。

綜上所述，猜測(cè)腹腔注射GnIH 可能降低了機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性， 導(dǎo)致葡萄糖清除率顯著下降。這一生理功能的改變推測(cè)是由于GnIH 在引起胰島素分泌下降的同時(shí)誘導(dǎo)了胰島素抵抗的發(fā)生所致。

4 結(jié)論

該研究探討了腹腔注射GnIH 對(duì)小鼠采食、體重和血糖穩(wěn)態(tài)的影響，結(jié)果顯示腹腔注射GnIH 具有促進(jìn)雄性小鼠采食量和體重增加進(jìn)而提高其生長(zhǎng)性能的作用。腹腔注射GnIH 具有快速升血糖的作用，促進(jìn)胰高血糖素的分泌和合成，抑制胰島素轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、 胰島素轉(zhuǎn)錄因子和胰島素的分泌和合成，進(jìn)而引起機(jī)體血糖紊亂。