高良姜倍半萜合成酶基因的生物信息學(xué)和表達(dá)分析

黃瓊林，鄭偉穰，黃學(xué)山，吳民華

（廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 湛江 524023）

高良姜是傳統(tǒng)藥食兩用中藥材，為姜科多年生草本植物高良姜AlpiniaofficinarumHance的干燥根莖，具有散寒止痛、溫中止嘔的功效[1]。萜類是高良姜發(fā)揮藥效和產(chǎn)生芳香氣味的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。高良姜萜類成分復(fù)雜、種類繁多，包括單萜、倍半萜、二萜等多種化合物[2]。目前已從高良姜中分離出多種倍半萜成分[3-5]，但高良姜倍半萜生物合成的分子研究還鮮有報道。開展高良姜倍半萜合成酶（sesquiterpene synthase,SES）的研究可為高良姜倍半萜生物合成的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，以期能通過基于倍半萜生物合成的基因工程手段來提高高良姜品質(zhì)，進(jìn)而緩解高良姜面臨的資源逐年減少的困境[6-7]。

本研究在前期高良姜轉(zhuǎn)錄組分析[8]的基礎(chǔ)上，挖掘和鑒定SES的編碼基因，通過生物信息學(xué)分析基因及其編碼蛋白的序列特征和功能，并分析SES基因在高良姜不同組織中的表達(dá)差異，以期為利用基于SES基因的基因工程途徑調(diào)控高良姜倍半萜成分的生物合成與含量積累奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 基因序列來源

在轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)[8]基礎(chǔ)上，以錯誤值（Evalue）小于10為篩選條件，檢索注釋為“sesquiterpene synthase”、含有完整編碼區(qū)的非重復(fù)序列基因。此外，在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中搜索微管蛋白β-Tubulin的編碼基因，用于后續(xù)實時熒光定量PCR（qPCR）檢測的內(nèi)參基因及其引物設(shè)計。

1.2 試劑與儀器

RNAprep Pure Plant Kit試劑盒、ddH2O，天根生化科技（北京）有限公司；GoScript Reverse Transcription System、GoTaq qPCR Master Mix試劑盒，美國普洛麥格生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為化學(xué)純。

Stepone Plus熒光定量PCR儀，美國Applied Biosystem公司；TGL-16MS型離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器公司；JS-power 300型核酸電泳儀、JS-8600B型凝膠成像分析儀，上海培清公司。

1.3 基因序列分析

采用Omiga 2.0對高良姜SES基因序列進(jìn)行編碼區(qū)檢索，并將其翻譯成編碼蛋白的氨基酸序列。利用Protparam和Protscale軟件分析編碼蛋白的基本理化特征。使用CD-search在線工具分析編碼蛋白的保守功能域，利用Target1.1和TMHMM在線軟件完成編碼蛋白的亞細(xì)胞定位分析。分別采用SOPMA、Swiss-prot在線軟件分析編碼蛋白的高級結(jié)構(gòu)。運(yùn)用ClustalX和MEGA軟件完成編碼蛋白的多重序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.4 基因表達(dá)分析

采用qPCR檢測高良姜SES在不同組織樣品中的表達(dá)模式。參照說明書，使用RNA prep Pure Plant Kit分別提取高良姜根莖、莖和葉片總RNA，再用GoScript Reverse Transcription System反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

目的基因和內(nèi)參基因用于qPCR的特異性引物如表1所示。參照GoTaq qPCR Master Mix試劑盒說明書，qPCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，其中2×qPCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L上下游引物各0.3 μL，cDNA模板適量，并用滅菌蒸餾水補(bǔ)足體積。qPCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt計算高良姜SES基因的相對表達(dá)量。

表1 高良姜SES基因qPCR分析所用的引物Table 1 Primers for qPCR analysis of SES gene in A.officinarum

2 結(jié)果與分析

2.1 基因序列特征

經(jīng)過在高良姜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中檢索，共獲得2條編碼SES基因及其cDNA序列。根據(jù)高良姜的拉丁學(xué)名及這些基因在轉(zhuǎn)錄組中的注釋，將它們分別命名為AoSES3和AoSES6。AoSES3和AoSES6的cDNA序列長度分別為1 818 bp和2 257 bp，各自含有1個長度為1 653bp和1 647 bp的開放閱讀框（open reading frame，ORF），分別編碼含有550和548個氨基酸的蛋白質(zhì)。

編碼蛋白的理化和結(jié)構(gòu)特征如表2所示。AoSES3和AoSES6的等電點均小于7，皆為酸性蛋白質(zhì)。AoSES3的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)大于40，屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，而AoSES6則為穩(wěn)定性蛋白質(zhì)。AoSES3和AoSES6的多肽鏈整體表現(xiàn)為親水性，為水溶性蛋白質(zhì)。AoSES3和AoSES6均不含有跨膜結(jié)構(gòu)域，也不具有信號肽、轉(zhuǎn)運(yùn)肽和靶向肽等結(jié)構(gòu)。AoSES3和AoSES6均含有倍半萜合成酶來家族典型的保守序列——天冬氨酸富集基序（DDXYD），推測其為高良姜倍半萜類合成酶蛋白。

表2 高良姜SES理化及結(jié)構(gòu)特征Table 2 Physicochemical and structural characteristics of SES in A.officinarum

2.2 編碼蛋白的保守功能域分析

為了進(jìn)一步明確高良姜SES的功能和分類，對其編碼蛋白質(zhì)的保守功能域進(jìn)行分析。如圖1所示，AoSES3和AoSES6均具有多個底物結(jié)合位點和天冬氨酸富集區(qū)域，包含有植物萜類環(huán)化酶和萜類合成酶等特異性功能域，歸屬類異戊二烯合成酶生物合成酶超級家族。因此，AoSES3和AoSES6均為高良姜萜類生物合成酶基因。

圖1 高良姜SES的保守功能域分析Figure 1 Conservative functional domain analysis of SES in A.officinarum

2.3 編碼蛋白的聚類分析

基于20種植物萜類合成酶構(gòu)建的聚類樹如圖2所示，AoSES3和AoSES6與其他SES聚成一支，而其他萜類合成酶則聚成另外一支。SES分支又分為2個小分支，其中AoSES3和AoSES6與單子葉植物來源的SES聚集在一起，而雙子葉植物SES則聚集在一起，說明AoSES與單子葉植物SES有更高的同源性，與其來源植物的親緣關(guān)系相符。

圖2 20種植物萜類合成酶蛋白的聚類樹Figure 2 Cluster tree of 20 plant terpenoid synthase proteins

2.4 編碼蛋白高級結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖3所示，AoSES3和AoSES6均由α-螺旋，延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和隨意卷曲等4種元件構(gòu)成，各元件的數(shù)量分別是379（68.91）和384（70.07%）、26（4.73%）和23（4.20%）、16（2.91%）和15（2.74%）、129（23.45%）和126（22.99%），表明兩者均為混合型結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，并且在元件組成及比例上較為相似。

圖3 高良姜SES的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Figure 3 Secondary structure prediction of SES in A.officinarum

AoSES3和AoSES6的空間結(jié)構(gòu)如圖4所示，它們的三級結(jié)構(gòu)元件組成與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測較為一致，均以α-螺旋為主，隨意卷曲次之，其他兩種元件則較少。AoSES3和AoSES6的空間排列也較為相似，提示它們的序列具有較高的保守性。

圖4 高良姜SES的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Figure 4 Prediction for tertiary structure of AoSES proteins

2.5 基因表達(dá)趨勢

通過qPCR測定AoSES3、AoSES6在高良姜不同組織中的表達(dá)水平，結(jié)果如圖5所示，AoSES3和AoSES6在高良姜葉、莖和根莖中均有表達(dá)，但表達(dá)趨勢不盡相同。兩者在莖中的表達(dá)均為最低，AoSES3在葉中的表達(dá)最高，根莖則次之；而AoSES6在根莖中的表達(dá)顯著高于其他2個組織。

圖5 SES基因在高良姜不同組織中的表達(dá)差異Figure 5 Expression analysis of AoSESs in different tissues of A.officinarum

3 討論

本研究從高良姜轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中鑒定獲得萜類合成途徑下游關(guān)鍵酶萜類合成酶（terpene synthase，TPS）的家族成員——倍半萜合成酶的2條編碼基因AoSES3和AoSES6，它們分別編碼550和548個氨基酸。AoSES3和AoSES6包含有倍半萜合成酶家族典型的保守序列DDXXD，并含有植物萜類環(huán)化酶和萜類合成酶等特異性功能域。聚類分析結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，AoSES3和AoSES6與其他植物來源的倍半萜合成酶聚集在一起，具有較高的同源性。前人研究[9-10]認(rèn)為倍半萜合成酶沒有信號肽，定位于細(xì)胞質(zhì)中，本研究對于AoSES3和AoSES6的分析也得到一致的結(jié)果。這些結(jié)果表明，AoSES3和AoSES6很可能具有植物倍半萜合成酶的功能。

組織表達(dá)特異性分析發(fā)現(xiàn)，AoSES3和AoSES6在高良姜的不同組織中均有表達(dá)，但表達(dá)豐度存在差異。AoSES3傾向在葉片中表達(dá)，而AoSES6則主要在根莖中表達(dá)，推測高良姜不同組織中的倍半萜生物合成可能是由不同倍半萜合成酶來實現(xiàn)的。

本研究通過轉(zhuǎn)錄組分析挖掘和鑒定出2條編碼SES的基因，分析了其編碼蛋白的序列特點和功能，生物信息學(xué)分析表明這些基因具有SES必需的功能域，并明確了這些基因在高良姜中的表達(dá)模式，為后續(xù)AoSES基因的功能鑒定和調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。