響應(yīng)面法優(yōu)化地黃多糖的提取工藝及抗氧化活性分析

周加林，張涵，岳義民，梁藍(lán)元，李傳球，舒尊鵬，王毅

（1.北京市第六醫(yī)院中藥房，北京 100007；2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；3.佳木斯藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007）

地黃為玄參科植物地黃（RehmanniaglutinosaLibosch.）的新鮮或干燥塊根，又名地髓，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品[1]。作為傳統(tǒng)的清熱涼血、養(yǎng)陰生津中藥材，地黃具有促進(jìn)機(jī)體造血、抗衰老和降血糖等廣泛作用[2-3]。多糖是地黃的主要活性成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和抗腫瘤等活性[4-6]。

目前，關(guān)于地黃多糖活性的相關(guān)報(bào)道較多，但對(duì)其提取工藝研究甚少，且主要集中于正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。影響多糖提取率的因素較多且復(fù)雜，各個(gè)因素之間往往存在不同程度的交互作用，正交試驗(yàn)無(wú)法直觀反映出各因素之間影響程度。響應(yīng)面分析法在工藝優(yōu)化方面作為一種常用的有效方法，可以連續(xù)地對(duì)實(shí)驗(yàn)的各個(gè)水平進(jìn)行分析，所得結(jié)果更加合理、可靠[7]。

因此，本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化地黃多糖的提取工藝，比較Sevage法與三氯乙酸法對(duì)地黃多糖脫蛋白的影響，并在此基礎(chǔ)上對(duì)地黃多糖的抗氧化活性進(jìn)行考察，為地黃進(jìn)一步的開發(fā)利用提供理論支持。

1 材料與儀器

L3S/L3紫外可見分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；FDU-1200冷凍式干燥機(jī)（上海愛郎儀器有限公司）；TE-3數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋（上海越辛儀器制造廠）；TDL-5低速多管架離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；GL124-ISCN萬(wàn)分之一電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

地黃購(gòu)于佳木斯市民生藥行，經(jīng)佳木斯大學(xué)藥學(xué)院張宇教授鑒定為玄參科植物地黃（Rehmannia glutinosaLibosch.）的干燥塊根；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，Lot：C13168724）、抗壞血酸（Vc，Lot：F0221A）、牛血清白蛋白（Lot：C13449135）、葡萄糖（Lot：N1128A）與考馬斯亮藍(lán) G-250（Lot：C13592318）購(gòu)于上海金穗科技生物有限公司（以上試劑均為分析純）；無(wú)水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、三氯乙酸、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、鐵氰化鉀、苯酚、濃硫酸與FeCl3等試劑購(gòu)于廣州化工試劑廠（以上試劑均為分析純）。

2 方法

2.1 地黃的預(yù)處理

稱取地黃10.0 g，置500 mL圓底燒瓶中，加95%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇200 mL水浴加熱回流1.5 h，濾去殘?jiān)?，重?fù)3次；取殘?jiān)?0℃下真空干燥，得到預(yù)處理后地黃。

2.2 地黃多糖的制備

稱取預(yù)處理后地黃5.0 g，置圓底燒瓶中，按照設(shè)定的提取時(shí)間、料液比、提取溫度，以熱水進(jìn)行提取，重復(fù)3次，冷卻，濾過，合并3次濾液，濃縮至原體積1/20，向濃縮液中加入無(wú)水乙醇調(diào)至溶液最終醇體積分?jǐn)?shù)為80%，靜置24 h，離心（4 000 r/min，20 min），收集沉淀，復(fù)溶，濃縮，凍干，得地黃多糖凍干樣，按以下公式計(jì)算地黃多糖脫蛋白前提取率：

2.3 單因素試驗(yàn)

每次稱取5 g經(jīng)預(yù)處理的地黃，進(jìn)行單因素試驗(yàn)[8]：固定料液比（g∶mL，下同）為1∶50、提取溫度為60 ℃，分別考察提取時(shí)間60、80、100、120、140 min對(duì)地黃多糖提取率的影響；固定提取時(shí)間為100 min、提取溫度為60 ℃，分別考察料液比1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70對(duì)地黃多糖提取率的影響；固定提取時(shí)間100 min、料液比1∶60，分別考察提取溫度40、50、60、70、80℃對(duì)地黃多糖提取率的影響。

2.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，使用Design-Expert 12.0軟件中的Box-Behnken進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用3因素3水平為自變量的設(shè)計(jì)，以地黃多糖提取率為響應(yīng)值，考察提取時(shí)間（A）、料液比（B）和提取溫度（C）對(duì)地黃多糖提取率的影響，以此確定地黃多糖最佳提取條件。響應(yīng)面分析因素水平見表1。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面法因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken response surface method

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法預(yù)測(cè)的精準(zhǔn)性和確定性，采用響應(yīng)面優(yōu)化后的自變量條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，計(jì)算平均多糖提取率。

2.6 多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)[9]：取1 mL脫蛋白前的1 mg/mL多糖溶液，依次加入6%苯酚溶液1 mL與濃硫酸5 mL后充分搖勻，靜置10 min，沸水浴反應(yīng)15 min后取出，冷卻至室溫，于490 nm處測(cè)定吸光度。同時(shí)，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算脫蛋白前地黃多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.7 地黃多糖脫蛋白實(shí)驗(yàn)

2.7.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考文獻(xiàn)[10]并稍作修改：分別配制0.1 mg/mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液100 mL，10.0 mg/mL考馬斯亮藍(lán)溶液100 mL，置于4℃冰箱中保存。取7支具塞試管，各加入標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液0.2、0.4、0.6、0.8、0.1、0.12 mL，加入相應(yīng)體積的蒸餾水使體積達(dá)到1.0 mL，并加入現(xiàn)配的考馬斯亮藍(lán)G-250溶液5 mL，靜置反應(yīng)5 min后，在595 nm下測(cè)定波長(zhǎng)，以牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.7.2 Sevage法脫蛋白 取50 mg地黃多糖凍干粉，加50 mL水使其溶解，制成1 mg/mL的地黃多糖溶液。按照三氯甲烷∶正丁醇=4∶1（體積比）配制成Sevage溶液50 mL（三氯甲烷40 mL，正丁醇10 mL），地黃多糖溶液與Sevage溶液按照3∶1的體積比進(jìn)行混合，放置于分液漏斗中，充分振搖 10 min，然后靜置20 min，離心（4 000 r/min，15 min）后，除去上清液與有機(jī)層交界處的變性蛋白質(zhì)，重復(fù)上述操作3次，直到上清液與有機(jī)層交界處沒有變性蛋白質(zhì)后，取上清液，用3 500 u透析袋流水透析48 h，濃縮，冷凍干燥得脫蛋白后的地黃多糖。

2.7.3 三氯乙酸法脫蛋白 同法配制50mL的1mg/mL地黃多糖溶液。取5 mL三氯乙酸溶液溶于45 mL水中配置成5%的三氯乙酸溶液。地黃多糖溶液與5%三氯乙酸溶液按照4∶1體積比進(jìn)行混合，靜置12 h后，離心（4 000 r/min，15 min），棄去沉淀，取上清液，用3 500 u透析袋流水透析48 h，濃縮，冷凍干燥得脫蛋白后的地黃多糖。

2.7.4 蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率的測(cè)定 取脫蛋白前后各5 mg地黃多糖凍干粉，同法配置為1 mg/mL的地黃多糖溶液5 mL。分別精密吸取1 mL多糖溶液于試管中，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250染色液，渦旋混勻，室溫放置8 min，在紫外分光光度計(jì)595 nm處進(jìn)行波長(zhǎng)測(cè)定，重復(fù)3次，參照蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出脫蛋白前后地黃多糖溶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。同“2.6”項(xiàng)方法，計(jì)算出脫蛋白后地黃多糖溶液中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。按照以下公式計(jì)算蛋白質(zhì)脫除率及多糖損失率：

式中：A0為脫蛋白前的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)；A1為脫蛋白后的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)；B0為脫蛋白前的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)；B1為脫蛋白后的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.8 多糖純度鑒定

參考文獻(xiàn)[11]并稍作修改：將脫蛋白后地黃多糖配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的多糖溶液，以純水作為空白對(duì)照，在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，檢測(cè)多糖組分中是否有蛋白質(zhì)及核酸殘留。

2.9 多糖抗氧化活性試驗(yàn)

2.9.1 DPPH清除率測(cè)定 分別配制質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的脫蛋白后地黃多糖樣品溶液。試管中加入1 mL樣品溶液與2 mL 0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液，充分振蕩后，將混合物于室溫下避光反應(yīng)30 min，于517 nm處測(cè)定其吸光度值，Vc為陽(yáng)性對(duì)照，蒸餾水為空白，按下式計(jì)算DPPH清除率[12]：

式中：A1為反應(yīng)液的吸光度值；A2為不加DPPH時(shí)多糖液自身的吸光度值；A0為空白對(duì)照DPPH溶液加蒸餾水。

2.9.2 羥基自由基清除率測(cè)定 分別在試管中加入不同質(zhì)量濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的脫蛋白后地黃多糖樣品溶液1 mL，依次加入9 mmol/L硫酸亞鐵溶液及9 mmol/L雙氧水溶液各1 mL，充分振蕩，靜置10 min，加入9 mmol/L水楊酸溶液1 mL，35℃水浴30 min，510 nm處測(cè)其吸光度值，Vc為陽(yáng)性對(duì)照，蒸餾水為空白，按下式計(jì)算羥基自由基清除率[13]：

式中：A1為樣品液的吸光度；A2為不加顯色劑H2O2樣品的吸光度；A0為空白對(duì)照液的吸光度。

2.9.3 還原能力試驗(yàn) 分別配制質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的脫蛋白后地黃多糖樣品溶液。取1 mL樣品溶液，加入2.5 mL的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和1 mL的10 g/L鐵氰化鉀溶液，混勻后于50℃水浴20 min。冷卻至室溫后，加入2 mL的100 g/L三氯乙酸和1.2 mL的1 g/L三氯化鐵溶液，于700 nm處測(cè)定吸光度，吸光度值越大表明還原能力越強(qiáng)[14]。

2.10 數(shù)據(jù)處理

重復(fù)3次試驗(yàn)，采用Design-Expert 12.0軟件和Origin 2019作圖軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)和圖形進(jìn)行分析處理。

3 結(jié)果與分析

3.1 原料的預(yù)處理

通過對(duì)藥材進(jìn)行95%乙醇浸泡脫脂的預(yù)處理方法，可以去除一些脂溶性小分子、色素等物質(zhì)，減少多糖提取過程中的雜質(zhì)。地黃預(yù)處理前，表面粗糙、質(zhì)地較硬、色澤略黑（圖1A）；地黃預(yù)處理后，地黃表面潤(rùn)澤、質(zhì)地比之前略軟、色澤明顯變?yōu)闉鹾冢▓D1B）。

圖1 預(yù)處理前（A）、預(yù)處理后（B）地黃對(duì)比圖Figure 1 The comparison charts of R.glutinos before pretreatment（A）and after pretreatment（B）

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 提取時(shí)間對(duì)地黃多糖提取率的影響 由圖2可見：隨著提取時(shí)間的增加，地黃多糖提取率逐漸增加，在時(shí)間升至100 min時(shí)，多糖的提取率達(dá)到最大；超過100 min后，多糖的提取率略微降低。原因可能與提取時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致地黃中分子質(zhì)量高的多糖氧化分解，致使多糖提取率出現(xiàn)下降有關(guān)[15]。綜合以上結(jié)果，選取提取時(shí)間80、100、120 min為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)的3個(gè)水平。

圖2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Figure 2 Effects of extraction time on the extraction rate of polysaccharides(n=3)

3.2.2 料液比對(duì)地黃多糖提取率的影響 由圖3可見：隨著提取液的比例增加，地黃多糖提取率逐漸增加，在料液比達(dá)到1∶60時(shí)，多糖的提取率達(dá)到最大；當(dāng)提取液比例進(jìn)一步加大時(shí)，多糖的提取率開始下降。原因可能是當(dāng)提取液用量繼續(xù)增大時(shí)，其他雜質(zhì)成分也被提取出來，從而影響多糖提取率。綜合以上結(jié)果，選取料液比1∶50、1∶60、1∶70為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)的3個(gè)水平。

圖3 液料比對(duì)多糖提取率的影響Figure 3 Effects of liquid-material ratio on the extraction rate of polysaccharides（n=3）

3.2.3 提取溫度對(duì)地黃多糖提取率的影響 由圖4可見：隨著溫度的增加，地黃多糖提取率逐漸增加，在溫度升至70℃時(shí)，多糖的提取率達(dá)到最大；隨著提取溫度進(jìn)一步加大，多糖的提取率開始下降。原因可能是由于溫度過高導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)被破壞，致使多糖提取率出現(xiàn)下降[16]。綜合以上結(jié)果，選取提取溫度60、70、80℃為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)的3個(gè)水平。

圖4 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響Figure 4 Effects of extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides(n=3)

3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果分析

3.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以提取時(shí)間、料液比、提取溫度3個(gè)因素為自變量，地黃多糖提取率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法進(jìn)行3因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共包括17組試驗(yàn)方案，每組試驗(yàn)平行3次。試驗(yàn)方案與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface method

3.3.2 回歸模型的建立及顯著性分析 利用Design-Expert軟件對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次項(xiàng)回歸方程：y=7.12+0.011 A+0.18 B+0.17 C+0.007 5 AB+0.020 AC-0.11 BC-0.044 A2-0.45 B2-0.80 C2。

由表3可知：回歸模型的P＜0.000 1，回歸模型極顯著；失擬項(xiàng)的P=0.125 5＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，表明回歸方程模擬擬合良好，可用于地黃多糖提取工藝優(yōu)化；B、C、B2、C2的P值均小于0.01，呈極顯著水平；A、A2、AB、AC、BC不顯著（P＞0.05）；各因素對(duì)多糖提取率的影響依次為液料比＞提取溫度＞提取時(shí)間。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results of regression model

3.3.3 響應(yīng)面分析 回歸優(yōu)化響應(yīng)面分析圖見圖5。通過綜合對(duì)比3組等高線圖與曲面圖，可見AB（料液比與提取時(shí)間）之間、AC（提取時(shí)間與提取溫度）之間、BC（提取溫度與料液比）之間均有一定的交互作用，而提取溫度與液料比的交互作用對(duì)地黃多糖提取率為最顯著。表現(xiàn)為響應(yīng)面曲面，故提取溫度與料液比的調(diào)整對(duì)地黃多糖提取率的影響較大。

圖5 各因素交互作用的曲面圖與等高線圖Figure 5 Curved surface and contour maps of interaction effects of various factors on total polysaccharides content

3.3.4 地黃多糖提取工藝的驗(yàn)證試驗(yàn) 通過Design-Expert 12.0軟件分析得出地黃多糖最佳提取工藝為：提取時(shí)間為103.33 min，料液比為1∶61.94，提取溫度為70.97℃，地黃多糖提取率為7.15%。考慮到工藝的可操作性，將模型預(yù)測(cè)得到的工藝條件調(diào)整為：提取時(shí)間為100 min，料液比為1∶60，提取溫度為70℃。在此條件下，做3次平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，得到地黃多糖的平均提取率為7.09%，相對(duì)誤差為0.29%，偏差較小，理論值與實(shí)際值之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明該模型的預(yù)測(cè)條件與實(shí)際情況相吻合，模型建立成功，故方案可行。

3.4 地黃多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程y=0.436 37x+0.022 67，R2=0.993 4，葡萄糖質(zhì)量濃度在 0.2～1.2 mg/mL范圍線性良好，計(jì)算得到脫蛋白前地黃多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80.13%。

3.5 脫蛋白試驗(yàn)結(jié)果

3.5.1 脫蛋白前后地黃多糖比較 植物多糖常常混有較多蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)不僅可能影響多糖的生理活性和結(jié)構(gòu)，而且可能導(dǎo)致多糖藥理作用的降低。由圖6可知，脫蛋白前地黃多糖色澤暗淡、顏色偏棕（圖6A），脫蛋白后地黃多糖色澤光亮、顏色偏黑且質(zhì)量減輕（圖6B）。

圖6 脫蛋白前（A）、脫蛋白后（B）地黃對(duì)比圖Figure 6 Comparison of R.glutinosa before（A）and after（B）deproteinization

3.5.2 蛋白脫除率和多糖損失率的測(cè)定 以牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=4.412x+0.054 36，R2=0.996 9，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度在0.02～0.12 mg/mL范圍線性良好。從表4可見，Sevage法脫蛋白率為41.40%，且多糖損失較大；三氯乙酸法脫蛋白率為63.57%，多糖損失較小。對(duì)比以上兩種方法，采用三氯乙酸法進(jìn)行脫蛋白。

表4 2種地黃多糖脫蛋白方法的比較Table 4 Comparison of two methods for deproteinization of R.glutinosa polysaccharides(n=3)

3.6 地黃多糖純度鑒定

地黃多糖的紫外光譜圖見圖7所示，在波長(zhǎng)260 nm與280 nm處均未見明顯吸收峰，說明地黃多糖中幾乎不含核酸和蛋白質(zhì)，純度較高。

圖7 地黃多糖紫外光譜圖Figure 7 UV spectrum of R.glutinosa polysaccharides

3.7 地黃多糖體外抗氧化能力分析

3.7.1 地黃多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力 DPPH是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，被廣泛應(yīng)用于測(cè)定天然產(chǎn)物的抗氧化能力。一般情況下，對(duì)DPPH自由基清除率越強(qiáng)，其抗氧化能力越強(qiáng)[17]。由圖8可見，當(dāng)?shù)攸S多糖質(zhì)量濃度升高時(shí)，多糖對(duì)DPPH自由基的清除率也隨之升高，在多糖質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，DPPH自由基的清除率為72.44%，表明地黃多糖對(duì)DPPH自由基有消除效果。

圖8 多糖對(duì)DPPH自由基的清除力Figure 8 The scavenging ability of polysaccharides to DPPH free radical(n=3)

3.7.2 地黃多糖對(duì)羥基自由基的清除能力 羥基自由基是一類非常活躍的自由基，它能造成糖類、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的氧化性損傷，若待測(cè)物能清除羥自由基，則表示其具有抗體內(nèi)物質(zhì)氧化的能力[18]。由圖9可見，當(dāng)?shù)攸S多糖質(zhì)量濃度升高時(shí)，多糖對(duì)羥基自由基的清除率也隨之升高，在多糖質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，羥基自由基的清除率為72.97%，表明地黃多糖對(duì)羥基自由基有消除作用。

圖9 多糖對(duì)羥基自由基的清除力Figure 9 The scavenging ability of polysaccharides to hydroxyl radical(n=3)

3.7.3 地黃多糖Fe3+還原力 鐵離子還原能力的主要是基于氧化還原反應(yīng)，在反應(yīng)過程中，多糖溶液中的活性成分將Fe3+還原成為Fe2+，吸光度值越大表明還原能力越強(qiáng)，其還原能力越強(qiáng)表明該地黃多糖抗氧化能力越好[19]。由圖10可知，地黃多糖具有一定的還原能力，隨著質(zhì)量濃度的增加，還原能力呈上升趨勢(shì)，當(dāng)質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，地黃多糖的還原能力達(dá)到最大，吸光度值為0.590 4，表明地黃多糖的鐵還原力較強(qiáng)。

圖10 多糖對(duì)Fe3+的還原能力Figure 10 The reducing ability of polysaccharides to Fe3+(n=3)

祁小妮等[20]對(duì)工藝優(yōu)化后地黃多糖的抗氧化活性進(jìn)行探究，結(jié)果表明在地黃多糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，其對(duì)羥基自由基的清除率在40%左右；劉沖英等[21]對(duì)純化后的地黃多糖進(jìn)行了抗氧化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示在地黃多糖濃度為1 mg/mL時(shí)，其對(duì)羥基自由基的清除率在23%左右，對(duì)DPPH自由基的清除率在20%左右。本研究中地黃多糖的抗氧化能力與上述文獻(xiàn)相比較強(qiáng)，這可能與提取方法及純化方式的不同有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化地黃多糖的提取工藝，結(jié)果顯示影響地黃多糖提取率的因素次序?yàn)橐毫媳龋咎崛囟龋咎崛r(shí)間，最佳提取工藝為：提取時(shí)間為100 min，料液比為1∶60，提取溫度為70℃；該條件下，地黃多糖的提取率為7.09%，相對(duì)誤差為0.29%，所確定的最佳提取工藝為地黃的后續(xù)拓展研究提供了理論基礎(chǔ)。對(duì)比Sevage法與三氯乙酸法對(duì)地黃多糖脫蛋白的效果，其中，三氯乙酸法較優(yōu)，蛋白質(zhì)脫除率與多糖損失率分別為63.57%、9.26%。體外抗氧化研究結(jié)果表明在多糖質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，DPPH自由基、羥基自由基的最大清除率分別為72.44%、72.97%，鐵還原能力評(píng)估的吸光度為0.590 4，表明地黃多糖具有較好的體外抗氧化活性，可以作為一種較為安全的天然抗氧化物來源。