黃芩苷通過上調(diào)miR-1272表達(dá)影響肺癌A549細(xì)胞惡性生物學(xué)行為

潘慶芳，劉貴敏，田瑞，劉藝

（中國人民解放軍陸軍第82集團(tuán)軍醫(yī)院1.血液內(nèi)分泌科；2.檢驗病理科，河北 保定 071000）

肺癌是全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]。在我國，隨著工業(yè)發(fā)展的加快和生活方式的改變，肺癌發(fā)病率、死亡率呈逐年增加趨勢，已成為一種嚴(yán)重的健康負(fù)擔(dān)[2]。雖然手術(shù)切除對早期肺癌患者有效，但由于癌細(xì)胞的異常侵襲轉(zhuǎn)移，術(shù)后復(fù)發(fā)率較高。另外，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，放化療、靶向治療后預(yù)后仍然很差，死亡率高[2]。因此，亟需尋找新的有效的肺癌治療策略。傳統(tǒng)中草藥用于癌癥輔助治療已有悠久歷史。黃芩苷是從中藥黃芩根中分離的一種黃酮類化合物，具有抑菌、抗炎等作用[3]。最近研究表明，黃芩苷還發(fā)揮抗腫瘤作用，例如，黃芩苷通過誘導(dǎo)鐵蛋白重鏈1（FTH1）依賴性鐵死亡發(fā)揮抗膀胱癌活性，有望成為治療膀胱癌的新型藥物[4]；黃芩苷可有效抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗結(jié)直腸癌作用[5]。此外，研究顯示，黃芩苷抑制體外肺癌細(xì)胞惡性行為，發(fā)揮抗肺癌作用[6]。但黃芩苷在肺癌中的抗癌作用機制仍不清楚。微小RNA（miRNA）是一類長度僅為18～25 bp的非編碼RNA，其參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化和腫瘤發(fā)生等多種生物學(xué)過程，在肺癌防治中具有潛在靶點作用[7-8]。miR-1272位于15q22.31，已有研究證實，前列腺癌中miR-1272表達(dá)降低，過表達(dá)miR-1272可顯著降低前列腺癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲能力，并提高其放療敏感性[9]。Lu等[10]通過微列陣分析證實肺癌組織中miR-1272表達(dá)降低，但miR-1272在肺癌中的作用、黃芩苷是否通過調(diào)控miR-1272表達(dá)發(fā)揮作用仍需探討。本研究分析了黃芩苷對肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并探討了miR-1272是否介導(dǎo)黃芩苷的抗腫瘤作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人肺癌細(xì)胞A549、人支氣管上皮細(xì)胞HBE，中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；黃芩苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），上海源葉；miRNA 模擬物（mimics）、抑制物（antimiRNA）及其相應(yīng)對照（miR-NC、anti-miR-NC），上海吉瑪制藥公司；細(xì)胞計數(shù)試劑盒（CCK-8），武漢金開瑞；Transwell小室，美國密理博公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒，上海貝博；兔抗人細(xì)胞周期素D1（CyclinD1）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9、B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl相關(guān)X蛋白（Bax）、p21一抗以及山羊抗兔IgG二抗，上海艾博抗公司；miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、通用PCR Master Mix購于美國Thermo Fisher公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和實驗分組

用含10%（φ）胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A549細(xì)胞。用黃芩苷終濃度分別為0、20、40、80 μmol/L的培養(yǎng)液孵育A549細(xì)胞24 h，依次記為對照組、黃芩苷低、中、高劑量組，實時定量PCR（RT-qPCR）檢測miR-1272表達(dá)水平。利用Lipofectamine 2000將miR-NC、miR-1272分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，記為miR-NC組、miR-1272組。用黃芩苷終濃度為80 μmol/L的培養(yǎng)液孵育轉(zhuǎn)染antimiR-NC、anti-miR-1272的A549細(xì)胞24 h，記為高劑量+anti-miR-NC組、高劑量+anti-miR-1272組。

1.3 CCK-8實驗檢測細(xì)胞活力

96孔板中接種轉(zhuǎn)染、未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞（2.5×103個/孔），分組處理后，每孔中加入10 μL的CCK-8試劑。酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度值（A）表示細(xì)胞活力。

1.4 Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲

Transwell實驗用于檢測A549細(xì)胞的遷移（上腔室未包被基質(zhì)膠）和侵襲（上腔室包被基質(zhì)膠）能力。每組取200 μL無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋的細(xì)胞懸液（細(xì)胞數(shù)約為5×103）接種Transwell上腔室，下腔室加入600 μL含10%FBS的完全培養(yǎng)基。在37°C下孵育24 h后，用棉簽擦去未穿膜的細(xì)胞。甲醇固定膜下表面細(xì)胞，并用0.1%的結(jié)晶紫染色。顯微鏡（200×）觀察并計數(shù)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

收集各組細(xì)胞，用500 μL結(jié)合緩沖液重懸，依次加 5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI，室溫避光染色15 min。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.6 Western blot檢測蛋白表達(dá)

RIPA裂解法對細(xì)胞中總蛋白進(jìn)行提取，經(jīng)分離、轉(zhuǎn)膜、封閉后，與兔源一抗4℃孵育12 h。洗膜后，與抗兔IgG二抗室溫孵育1 h。顯影，曝光，以GAPDH為內(nèi)參，Image J軟件分析目的蛋白相對表達(dá)量。

1.7 RT-qPCR檢測miR-1272表達(dá)

miRNeasy Mini試劑盒從各組細(xì)胞中分離總RNA，miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用通用PCR Master Mix檢測miR-1272表達(dá)水平，2-ΔΔCt法分析miR-1272相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-1272在肺癌A549細(xì)胞中的表達(dá)

肺癌細(xì)胞A549中miR-1272表達(dá)水平為0.57±0.03，較人支氣管上皮細(xì)胞HBE中miR-1272表達(dá)水平（1.03±0.03）顯著降低（P＜0.05）。

2.2 黃芩苷對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響

與對照組比較，黃芩苷低、中、高劑量組A549細(xì)胞活力、遷移和侵襲細(xì)胞個數(shù)顯著降低，凋亡率顯著升高，（CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2）蛋白表達(dá)降低，（p21、Bax）蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。且不同濃度組間各項指標(biāo)比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、表2、圖1和圖2。

圖1 黃芩苷對肺癌A549細(xì)胞遷移侵襲和凋亡的影響Figure 1 Effects of baicalin on the migration，invasion and apoptosis of lung cancer A549 cells

圖2 黃芩苷對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 2 Effects of baicalin on the expression of proliferation,migration,invasion and apoptosis-related proteins in lung cancer A549 cells

表1 黃芩苷對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響Table 1 Effects of baicalin on the proliferation，migration，invasion and apoptosis of lung cancer A549 cells（±s，n=9）

表1 黃芩苷對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響Table 1 Effects of baicalin on the proliferation，migration，invasion and apoptosis of lung cancer A549 cells（±s，n=9）

與對照組比較：*P＜0.05；與低劑量組比較：#P＜0.05；與中劑量組比較：&P＜0.05。

組別對照組黃芩苷低劑量組中劑量組高劑量組A值1.53±0.05 1.35±0.03*0.94±0.03*#0.49±0.02*#&遷移細(xì)胞數(shù)/個140.52±9.04 111.21±4.42*93.83±4.26*#62.92±3.52*#&侵襲細(xì)胞數(shù)/個87.46±3.76 71.95±3.09*52.26±2.52*#30.62±1.81*#&凋亡率/%3.72±0.25 9.91±0.47*19.47±1.21*#31.85±1.84*#&

表2 黃芩苷對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡相關(guān)蛋白的影響Table 2 Effects of baicalin on the expression of proliferation,migration,invasion and apoptosis-related proteins in lung cancer A549 cells (±s,n=9)

表2 黃芩苷對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡相關(guān)蛋白的影響Table 2 Effects of baicalin on the expression of proliferation,migration,invasion and apoptosis-related proteins in lung cancer A549 cells (±s,n=9)

與對照組比較：*P＜0.05；與低劑量組比較：#P＜0.05；與中劑量組比較：&P＜0.05。

組別對照組黃芩苷低劑量組中劑量組高劑量組CyclinD1蛋白0.85±0.04 0.61±0.03*0.46±0.03*#0.28±0.02*#&p21 0.31±0.02 0.45±0.03*0.63±0.04*#0.79±0.04*#&MMP-2蛋白0.81±0.04 0.65±0.03*0.49±0.03*#0.35±0.02*#&MMP-9蛋白0.69±0.04 0.54±0.03*0.43±0.02*#0.28±0.01*#&Bcl-2蛋白0.74±0.04 0.60±0.03*0.48±0.02*#0.33±0.03*#&Bax蛋白0.23±0.01 0.42±0.03*0.55±0.03*#0.71±0.04*#&

2.3 黃芩苷對肺癌A549細(xì)胞中miR-1272的影響

對照組、黃芩苷低、中、高劑量組A549細(xì)胞中miR-1272表達(dá)水平分別為 1.01±0.03、1.27±0.06、1.87±0.12、2.93±0.19。與對照組比較，低、中、高劑量組A549細(xì)胞中miR-1272表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），且不同濃度組間miR-1272表達(dá)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 過表達(dá)miR-1272對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響

與miR-NC組比較，miR-1272組A549細(xì)胞活力、遷移和侵襲細(xì)胞個數(shù)顯著降低，凋亡率顯著升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表達(dá)降低，p21、Bax蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。見表3、表4、圖3和圖4。

圖3 過表達(dá)miR-1272對肺癌A549細(xì)胞遷移侵襲和凋亡的影響Figure 3 Effects of miR-1272 overexpression on the migration，invasion and apoptosis of lung cancer A549 cells

圖4 過表達(dá)miR-1272對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 4 Effects of miR-1272 overexpressionon the expression of proliferation，migration，invasion and apoptosis-related proteins in lung cancer A549 cells

表3 過表達(dá)miR-1272對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響Table 3 Effects of miR-1272 overexpression on the proliferation,migration,invasion and apoptosis of lung cancerA549 cells(±s,n=9)

表3 過表達(dá)miR-1272對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響Table 3 Effects of miR-1272 overexpression on the proliferation,migration,invasion and apoptosis of lung cancerA549 cells(±s,n=9)

與miR-NC組比較：*P＜0.05。

組別miR-NC miR-1272 A 1.51±0.08 0.41±0.03*遷移細(xì)胞數(shù)/個136.71±6.13 58.15±1.81*侵襲細(xì)胞數(shù)/個89.11±3.41 21.22±0.77*凋亡率/%4.25±0.19 34.59±1.73*

表4 過表達(dá)miR-1272對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡相關(guān)蛋白的影響Table 4 Effects of miR-1272 overexpression on the expression of proliferation,migration,invasion and apoptosis-related proteins in lung cancer A549 cells(±s,n=9)

表4 過表達(dá)miR-1272對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡相關(guān)蛋白的影響Table 4 Effects of miR-1272 overexpression on the expression of proliferation,migration,invasion and apoptosis-related proteins in lung cancer A549 cells(±s,n=9)

與miR-NC組比較：*P＜0.05。

組別miR-NC miR-1272 CyclinD1蛋白0.81±0.05 0.19±0.02*p21 0.34±0.01 0.82±0.04*MMP-2蛋白0.79±0.04 0.31±0.01*MMP-9蛋白0.67±0.04 0.22±0.01*Bcl-2蛋白0.75±0.03 0.28±0.01*Bax蛋白0.23±0.01 0.76±0.05*

2.5 抑制miR-1272表達(dá)能逆轉(zhuǎn)黃芩苷對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響

與高劑量+anti-miR-NC組比較，高劑量+anti-miR-1272組A549細(xì)胞活力、遷移和侵襲細(xì)胞個數(shù)顯著升高，凋亡率顯著降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表達(dá)升高，p21和Bax蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。見表5、表6、圖5和圖6。

圖5 抑制miR-1272表達(dá)能逆轉(zhuǎn)黃芩苷對肺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲和凋亡的作用Figure 5 Effects of baicalin on the migration，invasion and apoptosis of A549 cells reversed by inhibition of miR-1272 expression

圖6 抑制miR-1272表達(dá)能逆轉(zhuǎn)黃芩苷對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的作用Figure 6 Effects of baicalin on the expression of proliferation,migration,invasion and apoptosis-related proteins in A549 cells reversed by inhibition of miR-1272

表5 抑制miR-1272表達(dá)逆轉(zhuǎn)黃芩苷對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響Table 5 Effects of baicalin on the proliferation,migration,invasion and apoptosis of A549 cells reversed by inhibition of miR-1272(±s,n=9)

表5 抑制miR-1272表達(dá)逆轉(zhuǎn)黃芩苷對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響Table 5 Effects of baicalin on the proliferation,migration,invasion and apoptosis of A549 cells reversed by inhibition of miR-1272(±s,n=9)

與高劑量+anti-miR-NC組比較：*P＜0.05。

組別高劑量+anti-miR-NC高劑量+anti-miR-1272 A450 nm 0.48±0.03 1.43±0.05*遷移細(xì)胞數(shù)/個62.98±1.47 121.15±4.72*侵襲細(xì)胞數(shù)/個29.85±0.87 79.62±3.41*凋亡率/%29.25±1.72 7.18±0.50*

表6 抑制miR-1272表達(dá)能逆轉(zhuǎn)黃芩苷對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移/侵襲和凋亡相關(guān)蛋白的影響Table 6 Effects of baicalin on the expression of proliferation,migration,invasion and apoptosis-related proteins in A549 cells reversed by inhibition of miR-1272 (±s,n=9)

表6 抑制miR-1272表達(dá)能逆轉(zhuǎn)黃芩苷對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移/侵襲和凋亡相關(guān)蛋白的影響Table 6 Effects of baicalin on the expression of proliferation,migration,invasion and apoptosis-related proteins in A549 cells reversed by inhibition of miR-1272 (±s,n=9)

與高劑量+anti-miR-NC組比較：*P＜0.05。

Bax蛋白0.72±0.03 0.31±0.01*組別高劑量+anti-miR-NC高劑量+anti-miR-1272 CyclinD1蛋白0.27±0.01 0.75±0.03*p21 0.78±0.03 0.39±0.01*MMP-2蛋白0.34±0.01 0.73±0.03*MMP-9蛋白0.26±0.01 0.61±0.02*Bcl-2蛋白0.30±0.01 0.68±0.03*

3 討論

大量研究表明，黃芩苷通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡和耐藥在多種人類癌癥中具顯著的抗腫瘤作用。Huang等[11]研究指出，黃芩苷通過調(diào)控JNK/Foxo1/BIM信號通路可抑制胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Gao等[12]研究表明，黃芩苷可阻斷核因子-κB（NF-κB）途徑誘導(dǎo)G1/S期周期阻滯，抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。此外，Xu等[13]研究證實，黃芩苷通過抑制微管親和力調(diào)節(jié)激酶2（MARK2）和蛋白激酶（AKT）活化降低肺癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性。與上述抗腫瘤作用一致，本研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷以劑量依賴方式抑制肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。CyclinD1是促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵蛋白，其過表達(dá)可引起細(xì)胞異常增殖，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，而p21則抑制細(xì)胞周期進(jìn)程、DNA復(fù)制和修復(fù)，具有抗增殖作用[14]。MMPs對腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移起促進(jìn)作用，這與其降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜有關(guān)。已有研究證實黃芩苷可顯著下調(diào)宮頸癌細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平，抑制宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲[15]。Bax和Bcl-2在線粒體依賴性細(xì)胞凋亡中具有重要作用，Bax表達(dá)增加導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放量增加，激活下游半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）途徑具有促凋亡作用，而Bcl-2通過抑制Bax移位至線粒體發(fā)揮抗凋亡作用[16]。本研究中，黃芩苷顯著降低A549細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9和Bcl-2表達(dá)水平，升高p21和Bax表達(dá)水平，與功能分析結(jié)果相吻合，這表明黃芩苷可抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在肺癌中具有抗腫瘤作用。

近年來，多項研究證實黃芩苷通過調(diào)控miR表達(dá)在多種類型的癌癥中發(fā)揮抗癌作用。如黃芩苷通 過 抑 制 miR-217、miR-10a、miR-23a、miR-30c、miR-31等致癌miRNAs表達(dá)可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤生長[17-18]。黃芩苷通過上調(diào)miR-485-5p的表達(dá)抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖[19]。此外，黃芩苷在乳腺癌中的抗增殖、抗侵襲轉(zhuǎn)移功能也與調(diào)控miR-338-3p表達(dá)有關(guān)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞A549中miR-1272表達(dá)水平顯著降低，轉(zhuǎn)染miR-1272 mimics過表達(dá)miR-1272顯著抑制A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，與Rotundo等[9]研究結(jié)論一致。此外，黃芩苷處理可顯著提高miR-1272表達(dá)水平，轉(zhuǎn)染anti-miR-1272抑制miR-1272表達(dá)導(dǎo)致黃芩苷對A549細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響降低，提示黃芩苷可能通過上調(diào)miR-1272表達(dá)在肺癌中發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上所述，黃芩苷對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲具有顯著抑制作用，而對其凋亡起促進(jìn)作用，可能與其上調(diào)了miR-1272表達(dá)有關(guān)，其豐富了中藥化合物和miRNA之間調(diào)控關(guān)系，為黃芩苷用于治療肺癌提供了理論依據(jù)。