桂枝抗腎病綜合征作用機制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

何丹李強孫繼佳陳少麗宋哲平都廣禮

（上海中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海201203）

腎病綜合征是一種由多種病因引起的常見腎小球疾病，是僅次于急性腎小球腎炎的第二大腎臟疾病，其臨床表現(xiàn)主要為“三高一低”，即大量蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥以及水腫［1-2］。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，腎病綜合征發(fā)病率為2／100 000～10／100 000，且好發(fā)于男性兒童［3］，該病并發(fā)癥多、療效差、復(fù)發(fā)率高，給人們的生活和健康帶來巨大壓力［4］。因此，探討腎病綜合征發(fā)病機制，尋找安全有效的治療藥物是一個亟待解決的問題［5］。

桂枝味辛、甘，性溫，歸肺、心、膀胱經(jīng)，功能發(fā)汗解肌、溫通經(jīng)脈、通陽化氣。研究表明桂枝可提高腎病綜合征的臨床療效［6］，且本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，桂枝對阿霉素腎病大鼠具有腎功能保護作用［7］。目前，關(guān)于桂枝的藥理作用研究報道較多，但不夠全面系統(tǒng)，尚不能明確闡述桂枝通陽化氣利水方面的作用機制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為中藥研究的一種新思路，其多成分-多靶點-多通路的整體調(diào)控思維方法已被廣泛應(yīng)用于預(yù)測中藥主要活性成分、闡明中藥作用機制［8-9］，在新的層面為中藥賦予新的科學(xué)內(nèi)涵。本研究嘗試運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法進行桂枝對腎病綜合征影響的作用機制研究，對其機制進行預(yù)測分析，以期為腎病綜合征的后續(xù)臨床治療提供理論支撐及科學(xué)參考。

1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.1 軟件與數(shù)據(jù)庫 TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http：／ ／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）、HitPick 數(shù)據(jù)（http：／ ／mips.helmholtz-muenchen.de／hitpick／cgi-bin／index.cgi？content ＝help.html）、SEA 數(shù)據(jù)庫（http：／ ／sea.bkslab.org／）、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù) 庫（http：／ ／swisstargetprediction.ch／）、DisGeNET 數(shù)據(jù) 庫（http：／ ／disgenet.org／home／）、GeneCards 數(shù)據(jù)庫（http：／ ／www.genecards.org／）、OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／omim.org／）、Venny軟件（https：／ ／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／）、Cytoscape 軟件（http：／ ／www.cytoscape.org／）、string 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／string-db.org／）、RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／www.rcsb.org）、Pymol軟件（https：／ ／pymol.org／2／）、PubChem 數(shù)據(jù)庫（http：／ ／pubchem.ncbi.nil.nih.gov／）、AutoDockTools軟件（http：／ ／autodock.scripps.edu／resources／adt）、Autodock Vina軟件（http：／ ／vina.scripps.edu／）、DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／david.ncifcrf.gov／）。

1.2 桂枝化合物的獲取與活性成分的篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，以“桂枝”為關(guān)鍵詞，檢索桂枝的主要化合物，并篩選其中口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18、細胞滲透性（Caco-2）≥-0.4 的主要活性成分。

1.3 藥物靶點的獲取 利用Hitpick、SEA、SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫的藥物靶點預(yù)測功能，收集桂枝主要活性成分的作用靶點。將“1.2”項下篩選獲得的桂枝主要活性成分分別輸入Hitpick、SEA、SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫，選擇物種為Homo sapiens，獲取對應(yīng)的藥物靶點，然后將3 個數(shù)據(jù)庫所預(yù)測靶點合并后刪除重復(fù)項即所需藥物靶點。

1.4 腎病綜合征相關(guān)靶點的篩選 以 “nephrotic syndrome”“ adriamycin nephropathy”為關(guān)鍵詞，利用DisGeNET、GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫預(yù)測腎病綜合征相關(guān)疾病基因，去重后利用Venny2.1.0 與桂枝主要活性成分的作用靶點取交集，得到桂枝治療腎病綜合征相關(guān)疾病的潛在作用靶點。

1.5 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將活性成分以及藥物與疾病的交集靶點輸入Cytoscape 軟件構(gòu)建化學(xué)成分-靶點網(wǎng)絡(luò)?；钚猿煞止?jié)點大小以degree 值大小為依據(jù)，節(jié)點越大，活性成分degree 值越大。

1.6 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用String 數(shù)據(jù)庫和Cytoscape 軟件繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)，將桂枝的作用靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，設(shè)置Organism 參數(shù)為Homo Sapiens，獲取蛋白相互作用文件，將文件導(dǎo)入Cytoscape 軟件繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.7 GO 和KEGG 分析 采用DAVID 數(shù)據(jù)庫對靶點進行GO 功能富集及KEGG 通路分析，篩選P＜0.05 的GO 條目，包括生物過程（Biological Process，BP）、細胞組分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular function，MF）及KEGG 信號通路，并繪制相應(yīng)氣泡圖。

1.8 分子對接 從上述PPI 網(wǎng)絡(luò)中篩選出degree 值排名前5 位的靶點與degree 值排名前4 位的活性成分進行分子對接驗證，使用Autodock Vina 進行分子對接，結(jié)合能（affinity）越小，說明靶蛋白與活性成分之間的相互作用越穩(wěn)定。

2 細胞實驗

2.1 細胞 人腎小管上皮細胞（HK-2）購自中國科學(xué)院上海細胞庫（目錄號SCSP-511），接種于含10%胎牛血清的DMEM／F12 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，貼壁生長，當(dāng)細胞生長到80%左右時進行實驗。

2.2 藥物 鹽酸阿霉素購自上海沃凱化學(xué)試劑有限公司（貨號25316-40-9）；桂皮醛購自上海源葉生物科技有限公司（貨號104-55-2）。

2.3 細胞活力檢測 MTT 法檢測阿霉素、桂皮醛對HK-2的細胞毒性和細胞增殖能力，確定阿霉素的IC50及桂皮醛的無細胞毒性范圍。HK-2 細胞以5×103／mL 密度接種于96孔板，培養(yǎng)過夜后，用不同質(zhì)量濃度的桂皮醛（0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10 μg／mL）預(yù)處理2 h，再用16 μg／mL阿霉素孵育24 h。每孔加入20 μL MTT 溶液，4 h后去上清，加入150 μL DMSO，用酶標儀在570 nm 波長處測定光密度（OD）值。實驗每組5 個復(fù)孔，重復(fù)3 次。

2.4 ROS 水平的檢測 HK-2 細胞以3.5×104／mL 密度接種于6 孔板，培養(yǎng)過夜后，分別用低、中、高劑量（1.25、2.5、5 μg／mL）桂皮醛預(yù)處理2 h，再用16 μg／mL 阿霉素孵育24 h。每孔加入無血清培養(yǎng)基稀釋的終濃度為10 μmol／L的DCFH-DA 熒光素500 μL，避光孵育30 min 并不時輕輕搖晃，PBS 洗掉探針后熒光顯微鏡下觀察并拍攝圖片，并用Image J 軟件分析熒光強度。

2.5 Western blot 法檢測p38MAPK、p-p38MAPK 的蛋白表達 HK-2 細胞以3×105／mL 密度接種于6 孔板，過夜后用低、中、高劑量桂皮醛預(yù)處理2 h，再用16 μg／mL 阿霉素孵育24 h。收集各組細胞，用PBS 清洗后裂解，提取細胞全蛋白，用BCA 法進行蛋白定量。常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜，孵育一抗、二抗，曝光、顯影，得到蛋白條帶圖，并用Image J軟件分析灰度值。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 通過GraphPad Prism 8.0.1 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差（One-way ANOVA）分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 桂枝活性成分 TCMSP 數(shù)據(jù)庫共收錄桂枝化合物220種，其中OB≥30%、DL≥0.18、Caco-2≥-0.4 的主要活性成分共7 種。桂皮醛（cinnamaldehyde）OB ＝31.99%、DL＝0.02、Caco-2＝1.35，不在主要活性成分篩選結(jié)果內(nèi)，但本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，桂皮醛可能是桂枝的重要活性成分［7］。因此，本研究將桂皮醛納入候選活性成分，見表1。

表1 桂枝的主要活性成分

3.2 桂枝藥物靶點 將桂枝的8 個主要活性成分輸入Hitpick、SEA、SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫，分別收集到7、89、261 個作用靶點，合并之后刪除重復(fù)項，共篩選出317個潛在作用靶點。

3.3 腎病綜合征相關(guān)疾病靶點 在DisGeNET、GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫中輸入關(guān)鍵詞 “ nephrotic syndrome”“adriamycin nephropathy”，共有 2 125 個靶點。利 用Venny2.1.0 與桂枝藥物靶點取交集（圖1），最終得到93個桂枝可能作用于腎病綜合征相關(guān)疾病的潛在作用靶點，見表2。

圖1 桂枝與腎病綜合征的韋恩圖

表2 桂枝與腎病綜合征的交集靶點

3.4 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將93 個交集靶點輸入Cytoscape 軟件中構(gòu)建活性成分-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖2），共有101 個節(jié)點，169 個邊。其中橙色圓形節(jié)點表示活性成分，黃色倒三角形表示作用靶點。不同活性成分對應(yīng)不同作用靶點，體現(xiàn)了桂枝多成分-多靶點的特點。其中，beta-sitosterol、sitosterol、cinnamaldehyde、peroxyergosterol的degree 值分別為37、37、36、29，可能為該網(wǎng)絡(luò)中較為重要的活性成分，見表3。

圖2 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

表3 桂枝主要活性成分degree值

3.5 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將93 個交集靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，把所得信息導(dǎo)入Cytoscape 軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖3A），圖中共涉及節(jié)點93個，邊1 478條，其中節(jié)點代表蛋白，邊代表蛋白之間的相互作用關(guān)系，節(jié)點的大小和顏色反映degree 值的大小，節(jié)點越大，顏色由黃變紫表示degree 值越大，邊的粗細反映combine score 的大小，邊越粗代表combine score 值越大。根據(jù)degree 值大小繪制了排名前10 的靶蛋白條形圖（圖3B）。其中，VEGFA、MAPK3、SRC、PTGS2、MAPK8 的degree 值分別為58、52、49、43、42，是該網(wǎng)絡(luò)圖的核心節(jié)點，提示可能在桂枝對腎病綜合征保護作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（A）與靶蛋白條形圖（B）

3.6 GO 和KEGG 分析 將93 個交集靶點導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫，篩選P＜0.05 的GO 條目及KEGG 信號通路。通過GO 功能富集分析發(fā)現(xiàn)，BP 相關(guān)的條目共524個，主要涉及刺激反應(yīng)、細胞增殖、凋亡及代謝等；CC 相關(guān)的條目共45個，主要涉及細胞表面、質(zhì)膜部分及微粒體等；MF 相關(guān)的條目共76個，主要涉及類固醇結(jié)合、血紅素結(jié)合、鐵離子結(jié)合及酶結(jié)合等。說明腎病綜合征作為一種復(fù)雜的疾病涉及多種生物過程，桂枝可以通過調(diào)節(jié)這些生物過程來發(fā)揮對腎病綜合征的保護作用。通過KEGG 信號通路分析發(fā)現(xiàn)，交集靶點映射出42 條信號通路，主要涉及MAPK 等信號通路，表明桂枝可能主要通過MAPK 信號通路來發(fā)揮對腎病綜合征的保護作用。根據(jù)P值分別選取BP、CC、MF 排名前10 的條目繪制GO 富集分析氣泡圖（圖4）。根據(jù)P值選取KEGG 排名前30 的信號通路繪制KEGG 富集分析氣泡圖（圖5）。

圖4 GO 富集分析氣泡圖

圖5 KEGG 富集分析氣泡圖

3.7 分子對接 對PPI 網(wǎng)絡(luò)中degree 值排名前5 的重要靶點（表4）進行分子對接驗證，發(fā)現(xiàn)這5 個重要靶點與桂枝活性成分均具有較好結(jié)合活性見表5。

表4 PPI 網(wǎng)絡(luò)中degree 值排名前5 的靶點

表5 靶點與活性成分的分子對接結(jié)果

3.8 桂皮醛對細胞活力的影響 如圖6A 所示，阿霉素的IC50為16 μg／mL，故選擇16 μg／mL 作為HK-2 造模劑量。如圖6B 所示，與空白組比較，桂皮醛質(zhì)量濃度小于10 μg／mL時對細胞沒有抑制作用（P＞0.05），可認定為對HK-2 無細胞毒性，當(dāng)桂皮醛質(zhì)量濃度增加到20 μg／mL時，細胞活力下降至50%左右，具有細胞毒性（P＜0.01）。如圖6C 所示，與模型組比較，桂皮醛在5 μg／mL 時有細胞增殖作用（P＜0.05），因此，在后續(xù)實驗中，桂皮醛劑量限制在5 μg／mL 以下。

圖6 阿霉素、桂皮醛對HK-2 細胞毒性及桂皮醛對阿霉素誘導(dǎo)HK-2 細胞的增殖作用（， n＝3）

3.9 桂皮醛對細胞ROS 水平的影響 如圖7 所示，與空白組比較，模型組HK-2 細胞ROS 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，桂皮醛中、高劑量組降低了HK-2 細胞ROS 水平（P＜0.05，P＜0.01）。

圖7 桂皮醛對HK-2 細胞ROS 水平的影響（， n＝3）

3.10 桂皮醛對HK-2 細胞MAPK 信號通路的影響 如圖8所示，與空白組比較，模型組HK-2 細胞p-p38 MAPK 蛋白表達升高（P＜0.05）；與模型組比較，桂皮醛處理降低了p-p38 MAPK 的蛋白表達（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

圖8 桂皮醛對HK-2 細胞MAPK 信號通路的影響（， n＝3）

4 討論

腎病綜合征總屬本虛標實，虛實錯雜之證［10］?！毒霸廊珪つ[脹》中指出“凡水腫等證，乃肺脾腎三臟相干之病”，故肺失通調(diào)、脾失健運、腎失開合，最終致膀胱氣化無權(quán)，三焦水道失暢，發(fā)而為水腫?！吨T病源候論》 言“水病者，由腎脾俱虛故也，腎虛不能宣通水氣，脾虛又不能制水，故水氣盈溢，滲水皮膚，流遍四肢，所以遍身腫也”。裘沛然教授認為，腎病綜合征的治療主要以補肺健脾益腎，行氣利水祛濕為主［11］。桂枝具有發(fā)汗解表、散寒止痛、通陽化氣之功效，可使停蓄之水經(jīng)由肌表、小便分消，水濕盡去。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討了桂枝對腎病綜合征影響的作用機制。從活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖中發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇、谷甾醇、桂皮醛、過氧麥角甾醇為該網(wǎng)絡(luò)中較為重要的活性成分。其中，桂皮醛是烯醛類有機化合物，是桂枝發(fā)揮利尿作用的主要成分，具有抗炎［12］、抗腫瘤［13］、降壓［14］、降脂［15］、降糖［16］、保護血管內(nèi)皮功能［17］等多種藥理活性，可從多方面發(fā)揮對腎臟的保護作用。分子對接結(jié)果顯示，桂皮醛與關(guān)鍵靶點具有較好的結(jié)合性能。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，桂皮醛是桂枝的主要活性成分，對阿霉素腎病大鼠具有保護作用［7］。因此，后續(xù)細胞實驗中選取桂皮醛進行實驗驗證。

KEGG 分析結(jié)果表明，關(guān)鍵靶點主要富集在MAPK 等信號通路上，且與腎臟疾病密切相關(guān)。MAPK 信號通路可通過氧化應(yīng)激、觸發(fā)炎癥因子及活化炎癥途徑等過程，參與腎臟功能及器質(zhì)改變，引起蛋白尿和腎小球硬化［18］。Munkonda等［19］發(fā)現(xiàn)，MAPK 還可促進近端小管病變，進而介導(dǎo)腎臟疾病的發(fā)展。Zhang等［20］用HK-2 細胞模擬體外腎損傷，發(fā)現(xiàn)三乙酰曲霉蛋白過表達可降低阿霉素引起的不良后果，從而預(yù)防腎損傷。

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)，能制造過氧化物與自由基而產(chǎn)生毒性作用，損害細胞的蛋白質(zhì)、脂類和核酸［21-22］。研究報道，阿霉素可造成腎小管細胞的氧化應(yīng)激損傷［23-24］。ROS 是氧化應(yīng)激的重要指標，Hermle等［25］研究發(fā)現(xiàn)，ROS 的形成可能是腎病的潛在發(fā)病機制。

本研究采用阿霉素誘導(dǎo)HK-2 細胞模擬體外腎損傷，結(jié)果顯示，阿霉素處理升高了HK-2 細胞ROS 水平，桂皮醛干預(yù)后ROS 水平下降，說明桂皮醛可以減輕阿霉素誘導(dǎo)的HK-2 細胞氧化損傷。此外，在阿霉素的刺激下，MAPK 信號通路中的p38 MAPK 被激活，而桂皮醛干預(yù)后可減輕p38 MAPK 磷酸化水平。因此，可以推測桂皮醛可能通過抗氧化應(yīng)激作用抑制MAPK 通路的激活從而減輕腎損傷。

綜上所述，桂皮醛是桂枝的主要活性成分，桂枝可能通過抑制氧化應(yīng)激以及對MAPK 信號通路的干預(yù)，來達到對腎臟的保護作用。