α-番茄堿對人肝癌細(xì)胞HuH-7 增殖、遷移及糖酵解活性的影響

何志龍 林瑩鄧有麟蔣利和 *

［1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧530004； 2.廣西農(nóng)產(chǎn)資源化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（玉林師范學(xué)院），廣西 玉林537000； 3.右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、 藥學(xué)院，廣西 百色533000］

據(jù)報(bào)道，全世界每年約有841 000 例新增肝細(xì)胞癌病例，其中約有781 000 例患者死于此?。?］。腫瘤細(xì)胞即使在供氧充足的情況下，仍然高度依賴葡萄糖進(jìn)行糖酵解作為產(chǎn)生能量的主要方式，產(chǎn)生大量乳酸，這種現(xiàn)象被稱為Warburg 效應(yīng)［2-3］。盡管尚不完全清楚這種代謝行為在腫瘤細(xì)胞中的機(jī)制，但干擾糖酵解已成為一種治療癌癥的策略［4-5］。

α-番茄堿是番茄中天然存在的甾體類生物堿，抑制許多類型的癌細(xì)胞的生長，例如結(jié)腸癌、乳腺癌、白血病、肺癌和肝癌等［6-11］。研究證明α-番茄堿與血管生成有關(guān)，可以抑制腫瘤細(xì)胞促血管生成因子VEGF 釋放［12］。而缺氧與缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）水平升高和隨之而來的VEGF表達(dá)升高有關(guān)［13］。另外，單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（MCT4）在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)可以防止乳酸鹽誘導(dǎo)的質(zhì)子應(yīng)激的積累，并將細(xì)胞內(nèi)pH 維持在一個(gè)堿性水平［14］，同時(shí)也可以酸化細(xì)胞外環(huán)境，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲［15］。MCT4介導(dǎo)的乳酸外排和產(chǎn)生的pH 穩(wěn)態(tài)可能是抑制腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)。

本研究為了探討α-番茄堿對肝細(xì)胞癌的抑制作用和可能的機(jī)制，檢測了α-番茄堿對人肝癌細(xì)胞增殖、凋亡及遷移等表型變化，初步分析α-番茄堿對糖酵解的生化指標(biāo)和相關(guān)蛋白的變化，為α-番茄堿抑制肝細(xì)胞癌提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 HH-ZK600 恒溫水浴鍋購自英峪高科儀器廠；TriStar LB94 多功能酶標(biāo)儀購自德國Berthold Technologies 公司；UV-1750 紫外可見光光度計(jì)購自蘇州島津儀器有限公司；DMIL-FL 熒光倒置生物顯微鏡購自德國Leica 公司；Tanon-5200Multi 全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司。

1.2 試劑與藥物 α-番茄堿（成都普瑞法生物科技有限公司，純度95%，貨號BP1726）。CCK-8 試劑盒（美 國MedChemExpress 公司，貨號HY-K0301）；葡萄糖試劑盒（貨號A154-1-1）、乳酸檢測試劑盒（貨號A019-2-1）購自南京建成生物工程研究所有限公司；ATP 檢測試劑盒（貨號S0026）、BCA 蛋白濃度檢測試劑盒（貨號P0010）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；MCT4 抗體（貨號20889-1-AP）、HIF-1α 抗體（貨號20960-1-AP）、乳酸脫氫酶A（LDHA）抗體（貨號19987-1-AP）、GAPDH 抗體（貨號60004-1-Ig）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌HuH-7 細(xì)胞（中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所）培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和1×青鏈霉素混合液的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。

2.2 細(xì)胞增殖檢測 取對數(shù)生長期的HuH-7 細(xì)胞，每孔3×103個(gè)接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h 后待細(xì)胞貼壁，分別加入不同濃度α-番茄堿處理12、24、48 h，加入CCK-8 試劑，37 ℃下孵育1 h，在450 nm 波長處檢測各孔吸光度值。

2.3 平板克隆實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的HuH-7 細(xì)胞，每孔1×103個(gè)接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后待細(xì)胞貼壁，分別加入0、1.5、2、2.5 μmol／L α-番茄堿進(jìn)行干預(yù)，7 d 后棄培養(yǎng)基，PBS 清洗3次，加入固定液固定15 min，結(jié)晶紫染色10 min，PBS 清洗，靜置晾干，顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 糖酵解實(shí)驗(yàn)

2.4.1 葡萄糖消耗檢測 取對數(shù)生長期的HuH-7 細(xì)胞，每孔3×105個(gè)接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后待細(xì)胞貼壁，分別加入0、1.5、2、2.5 μmol／L α-番茄堿干預(yù)24 h。根據(jù)葡萄糖檢測試劑盒說明書檢測葡萄糖消耗，使用多功能酶標(biāo)儀在505 nm 波長處檢測各孔吸光度值。

2.4.2 乳酸水平檢測 HuH-7 細(xì)胞按“2.4.1”項(xiàng)下方法處理，根據(jù)乳酸檢測試劑盒說明書操作步驟檢測乳酸水平，使用多功能酶標(biāo)儀在530 nm 波長處檢測各孔吸光度值。

2.4.3 ATP 水平檢測 HuH-7 細(xì)胞按“2.4.1”項(xiàng)下方法處理，根據(jù)ATP 檢測試劑盒說明書操作步驟檢測ATP 水平，使用多功能酶標(biāo)儀在562 nm 波長處檢測各孔吸光度值。

2.5 劃痕實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)期HuH-7 細(xì)胞，每孔6×105個(gè)接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后待細(xì)胞貼壁，用200 μL 槍頭垂直畫線，用PBS 清洗2次，鏡下觀察并拍照，再分別加入含有不同濃度α-番茄堿的無血清培養(yǎng)基，干預(yù)48 h 后顯微鏡下觀察并拍照。傷口面積越小，表明細(xì)胞遷移能力越低。

2.6 Transwell 實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)期HuH-7 細(xì)胞，每孔2×104個(gè)接種于不含血清培養(yǎng)基的Transwell 上室，加入不同濃度α-番茄堿進(jìn)行干預(yù)，Transwell 下室放入完全培養(yǎng)基，孵育24 h后取出小室，用棉簽擦去濾膜上室的細(xì)胞，固定液固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS 清洗2次，倒扣于濾紙上風(fēng)干，顯微鏡下觀察并拍照。穿過小室基底膜細(xì)胞數(shù)越少，表明細(xì)胞遷移能力越低。

2.7 Autodock-1.5.6 進(jìn)行α-番茄堿與HIF-1α 蛋白的分子對接從 NCBI（https：／ ／www.ncbi.nlm.nih.gov／pccompound／？term＝）獲取α-番茄堿結(jié)構(gòu)，從Protein Data Bank（https：／ ／www.rcsb.org／）獲取HIF-1α 蛋白結(jié)構(gòu)，分別對候選靶點(diǎn)利用Autodock-1.5.6 進(jìn)行分子對接。

2.8 生物信息學(xué)分析MCT4（SLC16A3）在肝細(xì)胞癌中的表達(dá) 利用Ualcan 數(shù)據(jù)庫研究MCT4 在肝細(xì)胞癌和肝細(xì)胞正常組織中的表達(dá)情況分析和MCT4 在肝細(xì)胞癌中的預(yù)后分析，采用人類蛋白組圖譜（the human protein atlas，THPA）初步探討MCT4 在人體的分布以及表達(dá)，分析MCT4 蛋白表達(dá)變化，通過在線分析工具STRING 分析MCT4 的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

2.9 Western blot 檢測蛋白表達(dá) HuH-7 細(xì)胞按“2.4.1”項(xiàng)下方法處理，24 h 后加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，根據(jù)BCA 試劑盒說明書檢測蛋白濃度，凝膠電泳后，濕轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，3%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜，室溫孵育二抗2 h，TBST 洗膜，滴加ECL 發(fā)光液，使用發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行成像并拍照，以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算蛋白相對表達(dá)。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過GraphPad Prism 7 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較用單因素方差分析（Oneway ANOVA）。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 α-番茄堿對人肝細(xì)胞癌HuH-7 生長的影響

3.1.1 α-番茄堿對HuH-7 細(xì)胞增殖的抑制作用 如圖1 所示，α-番茄堿對HuH-7 細(xì)胞的增殖能力具抑制作用，且呈劑量和時(shí)間依賴性，24 h 的IC50值為（1.83±0.31）μmol／L。

圖1 α-番茄堿對HuH-7 細(xì)胞增殖抑制率的影響（， n＝4）

3.1.2 α-番茄堿對HuH-7 細(xì)胞克隆形成能力的抑制作用 與0 μmol／L α-番茄堿組比較，不同濃度α-番茄堿處理后，HuH-7 細(xì)胞集落形成數(shù)量減少（P＜0.05，P＜0.01），說明α-番茄堿能抑制HuH-7 細(xì)胞的克隆形成能力，見圖2。

圖2 α-番茄堿對HuH-7 細(xì)胞克隆形成能力的影響（， n＝3）

3.2 α-番茄堿對HuH-7 細(xì)胞葡萄糖消耗的影響 與0 μmol／L α-番茄堿組比較，2、2.5 μmol／L 番茄堿組HuH-7細(xì)胞葡萄糖消耗水平降低（P＜0.01），1.5 μmol／L 番茄堿組HuH-7 細(xì)胞葡萄糖消耗水平無明顯變化（P＞0.05），見表1。

表1 α-番茄堿對HuH-7 細(xì)胞葡萄糖攝取的影響（，n＝3）

表1 α-番茄堿對HuH-7 細(xì)胞葡萄糖攝取的影響（，n＝3）

注：與0 μmol／L α-番茄堿組比較，**P＜0.01。

3.3 α-番茄堿對HuH-7 細(xì)胞乳酸生成的影響 與0 μmol／L α-番茄堿組比較，不同濃度α-番茄堿均能降低HuH-7 細(xì)胞乳酸的生成（P＜0.05，P＜0.01），見表2。

表2 α-番茄堿對HuH-7 細(xì)胞乳酸生成的影響（， n＝3）

表2 α-番茄堿對HuH-7 細(xì)胞乳酸生成的影響（， n＝3）

注：與0 μmol／L α-番茄堿組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.4 α-番茄堿對HuH-7 細(xì)胞ATP 水平的影響 與0 μmol／L α-番茄堿組比較，不同濃度α-番茄堿干預(yù)后HuH-7 細(xì)胞內(nèi)ATP 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），見表3。

表3 α-番茄堿對HuH-7 細(xì)胞ATP 水平的影響（， n＝3）

表3 α-番茄堿對HuH-7 細(xì)胞ATP 水平的影響（， n＝3）

注：與0 μmol／L α-番茄堿組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.5 α-番茄堿對HuH-7 細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響 如圖3 所示，與0 μmol／L α-番茄堿組比較，不同濃度α-番茄堿干預(yù)后HuH-7 細(xì)胞遷移距離縮短，遷移面積減少（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 α-番茄堿對HuH-7 細(xì)胞遷移能力的影響（， n＝3）

3.6 分子對接 當(dāng)結(jié)合能小于-4.25 kcal／mol，說明該分子與靶蛋白可能結(jié)合。如圖4 所示，α-番茄堿與HIF-1α 蛋白中的GLN-387 之間具有氫鍵作用，結(jié)合能為-4.41 kcal／mol，說明α-番茄堿與HIF-1α 蛋白具有結(jié)合能力。

圖4 α-番茄堿與HIF-1α 蛋白對接

3.7 MCT4 在肝細(xì)胞癌中高表達(dá) 由圖5A 可知，MCT4 在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)，在正常組織中低表達(dá)。圖5B 是MCT4在肝細(xì)胞癌中的生存曲線，從圖中可知高表達(dá)組的病人比低表達(dá)組的病人生存時(shí)間短，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MCT4 蛋白的免疫組化結(jié)果見圖5C，在正常組織中MCT4 主要呈低表達(dá)，而在腫瘤組織中MCT4 主要呈高表達(dá)；MCT4 蛋白在肝細(xì)胞癌中表達(dá)高于正常肝細(xì)胞組織（P＜0.01）。最后通過String 數(shù)據(jù)庫找到了MCT4 的共表達(dá)基因LDHA，為肝細(xì)胞癌的治療提供了新線索，見圖5D。

圖5 MCT4 在腫瘤里的表達(dá)情況和生存曲線

3.8 α-番茄堿對HuH-7 細(xì)胞糖酵解相關(guān)蛋白的影響 如圖6 所示，與0 μmol／L α-番茄堿組比較，不同濃度α-番茄堿均能降低HuH-7 細(xì)胞中HIF-1α 蛋白、糖酵解關(guān)鍵酶LDHA及相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MCT4 表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01）。

圖6 α-番茄堿對HuH-7 細(xì)胞糖酵解相關(guān)蛋白的影響

4 討論

目前，雖然已經(jīng)有很多的化學(xué)合成類抗腫瘤藥物問世并進(jìn)入臨床，但這類藥物副作用較強(qiáng)，限制了抗腫瘤藥物的應(yīng)用范圍。α-番茄堿在體外可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［9，16］，是易獲得、療效穩(wěn)定、毒副作用低，具有抗腫瘤等多種生物活性的天然產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示α-番茄堿對HuH-7 細(xì)胞的增殖抑制作用，且能有效抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

腫瘤代謝過程的抑制已在一些實(shí)體瘤的臨床前研究中顯示出一定的效果。糖酵解作為腫瘤細(xì)胞重要的能量來源，即使在氧氣存在的情況下也通過糖酵解快速生成ATP［17］。ATP 作為能量的最直接載體，是生物體內(nèi)能量轉(zhuǎn)換最基本的載體，與各器官的能量代謝水平密切相關(guān)，參與生物體內(nèi)的多種代謝過程。瓦伯格（Warburg）效應(yīng)在腫瘤細(xì)胞中主要表現(xiàn)在葡萄糖的消耗，乳酸以及ATP 的生成，因此，通過檢測細(xì)胞消耗的葡萄糖水平，生成的乳酸及細(xì)胞內(nèi)ATP 水平，可以判斷藥物是否對糖酵解過程產(chǎn)生影響。本研究結(jié)果顯示，α-番茄堿能降低HuH-7 細(xì)胞葡萄糖的攝取，降低乳酸的生成，降低細(xì)胞內(nèi)ATP 水平，提示α-番茄堿能抑制HuH-7 細(xì)胞糖酵解水平。

HIF-1α 在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤中表達(dá)量升高，是腫瘤細(xì)胞糖酵解的過程中重要調(diào)控因子，且在腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移方面起著重要作用［18］。HIF-1α 的激活參與癌細(xì)胞中關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄，包括血管生成、細(xì)胞存活、葡萄糖代謝和細(xì)胞侵襲等［19］。MCT4 對于適應(yīng)腫瘤特異性代謝過程至關(guān)重要，并且對腫瘤生長也很重要［20］，HIF-1α 直接或間接調(diào)節(jié)MCT4 表達(dá)以增強(qiáng)癌細(xì)胞的糖酵解和能量代謝［21-22］。研究發(fā)現(xiàn)，MCT4 表達(dá)也影響腫瘤細(xì)胞中HIF-1α 活化，并且抑制MCT4 可誘導(dǎo)HIF-1α 的失活，抑制腫瘤細(xì)胞葡萄糖代謝和轉(zhuǎn)移［23］。葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞后，在LDHA 的催化下生成乳酸，并產(chǎn)生ATP 供應(yīng)腫瘤細(xì)胞增殖的過程，最后由MCT4把胞內(nèi)乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)出去。本研究發(fā)現(xiàn)，α-番茄堿處理HuH-7細(xì)胞會降低MCT4、HIF-1α、LDHA 蛋白表達(dá)，同時(shí)通過數(shù)據(jù)庫挖掘發(fā)現(xiàn)，MCT4 在肝癌組織中表達(dá)高于正常組織，并且與LDHA 表達(dá)密切相關(guān)。PI3K／Akt 信號通路是激活Warburg 效應(yīng)的機(jī)制之一，大量研究發(fā)現(xiàn)MCT4、HIF-1α 和LDHA 作為參與Warburg 效應(yīng)的蛋白，受到PI3K／Akt 信號通路的調(diào)控［24-26］。另有研究表明，α-番茄堿可以抑制PI3K／Akt 信號通路的激活［9，27-28］，提示α-番茄堿可能通過抑制細(xì)胞中PI3K／Akt信號通路或HIF-1α 蛋白，調(diào)控Warburg 效應(yīng)相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的糖酵解和能量代謝，從而抑制細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。但是，α-番茄堿對肝細(xì)胞癌的抑制機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。