茺蔚子中苷類成分及其肝細(xì)胞保護(hù)作用研究

范云秋 彭芳 何育霖彭成戴鷗周勤梅熊亮*

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，省部共建西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都611137； 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)西南特色藥材創(chuàng)新藥物成分研究所，四川 成都611137； 3.成都中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥創(chuàng)新研究院，四川 成都611137）

茺蔚子味辛、苦，性微寒，是唇形科植物益母草Leonurus japonicusHoutt.的干燥成熟果實(shí)，具有活血調(diào)經(jīng)、清肝明目的功效，臨床中常用于月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉、痛經(jīng)等癥［1］，藥用歷史悠久，早在《本草綱目》 中就有記載［2］。茺蔚子含有豐富的脂肪酸、氨基酸［3］，以及三萜、甾體、生物堿、芳香族等類型［4-6］，并且其正丁醇部位具有較好的肝細(xì)胞保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)從茺蔚子中分離得到7 個(gè)化合物，包括4 個(gè)苯乙醇苷類、3 個(gè)酚苷類，其中化合物2、4～7 為首次從該植物中分離得到，4、5 均具有顯著的肝細(xì)胞保護(hù)作用。

1 材料

1.1 儀器 Bruker-500、Bruker-600 核磁共振波譜儀（德國(guó)Bruker 公司）；Synapt G2 HDMS 型高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters 公司）；UPT-II-20T 型反滲透純水儀（成都超純科技有限公司）；RotavaporR-205 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi 公司）；Agilent 1220型半制備型高效液相色譜儀（美麗Agilent 公司）；DZKW-S-4 電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；FA2004B 電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；SW-CJ-2F 型雙人雙面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；Allegra X-12R 離心機(jī)（美 國(guó)Beckman Coulter公司）；Series ⅡWater Jacket CO2孵箱、Multiskan MK3 酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Scientific 公司）。離子交換樹(shù)脂（河北華偉樹(shù)脂廠）；D101 大孔吸附樹(shù)脂（安徽三星樹(shù)脂科技有限公司）；柱層析硅膠（200～300 目）（青島海洋硅膠干燥劑廠）；薄層層析硅膠GF254、硅膠G和硅膠H（青島海洋硅膠干燥劑廠）；高效薄層硅膠板，GF254 硅膠制備薄層（煙臺(tái)江友硅膠開(kāi)發(fā)有限公司）；HW-40F（日本TOSOH 公司）。

1.2 試劑與藥物 HL-7702 正常人肝細(xì)胞（博士德生物科技有限公司，批號(hào)CX0157）。DMEM 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司，批號(hào)8121052）；胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)910O041）；新生牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，批號(hào)20100201）；對(duì)乙酰氨基酚（成都克洛瑪生物科技有限公司，批號(hào)CHB210112）；噻唑藍(lán)（北京金泰宏達(dá)生物科技有限公司，批號(hào)EZ6789A155）；二甲基亞砜（成都科龍化工試劑廠）。乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷、甲醇為分析純（成都科龍化工試劑廠）；甲醇為色譜純（美國(guó)Sigma公司）。

1.3 藥材 茺蔚子于2016 年9 月購(gòu)自成都市荷花池藥材市場(chǎng)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李敏教授鑒定為益母草Leonurus japonicusHoutt.的成熟果實(shí)，標(biāo)本（SCWZ-0917）保存于成都中醫(yī)藥大學(xué)西南特色藥材創(chuàng)新藥物成分研究所。

2 提取與分離

取茺蔚子60 kg，加入8 倍量70%乙醇回流提取3次，每次2 h，提取液合并后減壓濃縮，得3.5 kg 醇浸膏，分散于水中，依次采用乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑，分別得到乙酸乙酯部位（900 g）、正丁醇部位（1 800 g）。將正丁醇部位經(jīng)大孔樹(shù)脂柱分離純化，依次用10%、30%、50%、70%、95%乙醇洗脫，回收溶劑后得到5 個(gè)洗脫部分F1～F5。

采用堿性硅膠柱對(duì)F2進(jìn)行分離，以二氯甲烷-甲醇（50∶1～0∶1）為流動(dòng)相梯度洗脫，洗脫液經(jīng)TLC 檢測(cè)，合并相似部分，回收溶劑，得到17個(gè)洗脫部分F2-1～F2-17。F2-14（6.5 g）經(jīng)離子交換樹(shù)脂柱，分別用純水、80%乙醇、80%氨水乙醇梯度洗脫，取80% 氨水乙醇洗脫部位，回收溶劑，經(jīng)HW-40F 凝膠柱（90%甲醇）分離，得到4 個(gè)洗脫部分F2-14-1～F2-14-4，F(xiàn)2-14-3經(jīng)硅膠柱，以二氯甲烷-甲醇-水（50∶1∶0～3∶2∶0.25）為流動(dòng)相梯度洗脫，得到6 個(gè)洗脫部分F2-14-3A～F2-14-3F，F(xiàn)2-14-3D經(jīng)反相半制備液相色譜（28% 甲醇）得化合物2（2.2 mg，tR＝49 min）。F2-15（23.0 g）經(jīng)反相中壓液相色譜，以5%～100%甲醇為流動(dòng)相梯度洗脫，得到17 個(gè)洗脫部分F2-15-1～F2-15-17，F(xiàn)2-15-2經(jīng)硅膠柱、反相半制備HPLC（30% 甲醇）得化合物3（2.0 mg，tR＝34 min）、5（2.4 mg，tR＝45 min）；F2-15-12經(jīng)硅膠柱、反相半制備HPLC 得2 個(gè)部分F2-15-12-1～F2-15-12-2，F(xiàn)2-15-12-1以37%甲醇為流動(dòng)相洗脫得化合物6（2.0 mg，tR＝74 min），F(xiàn)2-15-12-2以45%甲醇為流動(dòng)相洗脫得化合物1（2.0 mg，tR＝45 min）、7（2.0 mg，tR＝60 min）；F2-15-14經(jīng)硅膠柱、反相半制備HPLC（45% 甲醇）得化合物4（2.0 mg，tR＝47 min）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末，易溶于甲醇；TLC 檢測(cè)有強(qiáng)暗斑，碘蒸熏顯黃色，10%硫酸乙醇溶液顯色呈紫色。ESI-MSm／z307.1 ［M ＋Na］＋；1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.26（4H，m，H-2，3，5，6），7.18（1H，m，H-4），4.30（1H，d，J＝7.8 Hz，glc-1），4.09（1H，m，H-8a），3.86（1H，dd，J＝12.0，2.4 Hz，glc-6a），3.76（1H，m，H-8b），3.66（1H，dd，J＝12.0，5.4 Hz，glc-6b），3.34（1H，m，glc-3），3.23～3.29（2H，m，glc-2，4），3.19（1H，dd，J＝9.0，7.8 Hz，glc-5），2.94（1H，dd，J＝7.8，3.6 Hz，H-7a），2.93（1H，dd，J＝7.8，3.0 Hz，H-7b）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：140.1（C-1），130.0（C-3，5），129.3（C-2，6），127.2（C-4），104.4（glc-1），78.1（glc-5），78.0（glc-3），75.1（glc-2），71.7（C-8），71.7（glc-4），62.8（glc-6），37.2（C-7）。與文獻(xiàn)［7］報(bào)道的β-苯乙醇葡萄糖苷一致。

化合物2：白色粉末，易溶于甲醇；TLC 檢測(cè)有強(qiáng)暗斑，碘蒸熏顯黃色，10%硫酸乙醇溶液顯色呈紫 色。ESI-MSm／z477.2 ［M ＋H］＋；1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.82（1H，d，J＝8.4 Hz，H-5），6.73（1H，d，J＝1.8 Hz，H-2），6.68（1H，dd，J＝8.4，1.8 Hz，H-6），5.16（1H，brs，rha-1），4.30（1H，d，J＝7.8 Hz，glc-1），4.07～3.26（m，10H of glucose and rhamnose），3.82（3H，s，OCH3），2.81（2H，m，H-7），1.25（3H，d，J＝6.0 Hz，rha-6）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：147.6（C-3），147.4（C-4），133.0（C-1），121.1（C-6），117.1（C-5），112.8（C-2），104.2（glc-1），102.8（rha-1），84.5（glc-3），77.9（glc-5），75.6（glc-2），74.0（rha-4），72.4（rha-3），72.0（C-7），72.2（rha-2），70.2（glc-4），70.1（rha-5），62.7（glc-6），56.5（OMe），36.6（C-8），17.9（rha-6）。與文獻(xiàn)［8］報(bào)道的darendoside B 一致。

化合物3：白色粉末，易溶于甲醇；TLC 檢測(cè)有強(qiáng)暗斑，碘蒸熏顯黃色，10%硫酸乙醇溶液顯色呈紫色。ESI-MSm／z499.2 ［M ＋Na］＋；1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：6.85（1H，d，J＝1.5 Hz，H-2），6.70（1H，d，J＝8.0 Hz，H-5），6.67（1H，dd，J＝8.0，1.5 Hz，H-6），5.15（1H，d，J＝1.5 Hz，rha-1），4.30（1H，d，J＝8.0 Hz，glc-1），3.84（3H，s，OMe），2.84（2H，td，J＝7.0，2.0 Hz，H-7），1.25（3H，d，J＝6.5 Hz，rha-6）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：148.8（C-3），145.9（C-4），131.6（C-1），122.4（C-6），116.0（C-5），113.7（C-2），104.2（glc-1），102.8（rha-1），84.5（glc-3），77.9（glc-5），75.6（glc-2），74.0（rha-4），72.4（rha-3，C-7），72.2（rha-3，C-7），72.0（rha-2），70.3（rha-5），70.1（glc-4），62.7（glc-6），56.4（OMe），36.8（C-8），17.9（rha-6）。與文獻(xiàn)［8］報(bào)道的肉蓯蓉苷E 一致。

化合物4：白色粉末，易溶于甲醇；TLC 檢測(cè)有強(qiáng)暗斑，碘蒸熏顯黃色，10%硫酸乙醇溶液顯色呈紫色。ESI-MSm／z469.2 ［M ＋Na］＋；1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：7.06（2H，d，J＝8.5 Hz，H-2，6），6.69（2H，d，J＝8.5 Hz，H-3，5），5.15（1H，d，J＝1.5 Hz，rha-1），4.29（1H，d，J＝7.5 Hz，glc-1），2.83（2H，m，H-7），1.25（3H，d，J＝6.5 Hz，rha-6）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：156.8（C-4），130.9（C-6），130.9（C-2），130.7（C-1），116.1（C-5），116.1（C-3），104.2（glc-1），102.8（rha-1），84.5（glc-3），77.9（glc-5），75.6（glc-2），74.0（rha-4），72.4（rha-2），72.2（rha-3），72.1（C-7），70.2（rha-5），70.1（glc-4），62.7（glc-6），36.4（C-8），17.9（rha-6）。與文獻(xiàn)［8］報(bào)道的肉蓯蓉苷G 一致。

化合物5：白色粉末，易溶于甲醇；TLC 檢測(cè)有強(qiáng)暗斑，碘蒸熏顯黃色，10%硫酸乙醇溶液顯色呈橘黃色。ESI-MSm／z295.1 ［M ＋Na］＋；1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：6.98（2H，d，J＝9.0 Hz，H-2，H-6），6.71（2H，d，J＝9.0 Hz，H-3，H-5），4.75（1H，d，J＝7.0 Hz，glc-1），3.90（1H，d，J＝12.0 Hz，H-6′b），3.72（1H，dd，J＝12.5，4.0 Hz，H-6′a）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：153.8（C-1），119.4（C-2，C-6），116.6（C-3，C-5），152.5（C-4），103.7（glc-1），78.1（glc-3），78.0（glc-5），75.0（glc-2），71.5（glc-4），62.6（glc-6）。與文獻(xiàn)［9］報(bào)道的熊果苷一致。

化合物6：白色粉末，易溶于甲醇；TLC 檢測(cè)有強(qiáng)暗斑，碘蒸熏顯黃色，10%硫酸乙醇溶液顯色呈紫色。ESI-MSm／z367.1 ［M ＋Na］＋；1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：7.63（1H，dd，J＝8.5，2.0 Hz，H-4），7.61（1H，d，J＝2.0 Hz，H-6），7.22（1H，d，J＝8.5 Hz，H-3），5.02（1H，d，J＝7.5 Hz，glc-1），3.90（3H，s，OMe-5），3.89（1H，dd，J＝12.0，2.5 Hz，glc-6a），3.87（3H，s，OMe-7），3.69（1H，dd，J＝12.0，5.5 Hz，glc-6b）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：168.2（C-7），152.2（C-2），150.4（C-5），125.4（C-1），124.5（C-4），116.4（C-3），114.1（C-6），101.9（glc-1），78.3（glc-5），77.8（glc-3），74.7（glc-2），71.2（glc-4），62.4（glc-6），56.7（OMe-5），52.6（OMe-7）。與文獻(xiàn)［10］報(bào)道的2-O-β-葡萄糖基-5-甲氧基-苯甲酸甲酯一致。

化合物7：白色粉末，易溶于甲醇；TLC 檢測(cè)有強(qiáng)暗斑，碘蒸熏顯黃色，10%硫酸乙醇溶液顯色呈紫色。ESI-MSm／z415.1 ［M ＋Na］＋；1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：7.90（2H，d，J＝8.0 Hz，H-2′，6′），6.94（2H，d，J＝8.0 Hz，H-3，5），6.85（2H，m，H-3′，H-5′），6.60（2H，d，J＝8.0 Hz，H-2，6），4.73（1H，d，J＝7.0 Hz，glc-1），4.66（1H，dd，J＝11.5，2.0 Hz，glc-6b），4.34（1H，dd，J＝11.5，7.5 Hz，glc-6a）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：167.9（C-7′），163.1（C-4′），153.5（C-4），152.3（C-1），132.9（C-2′，C-6′），122.1（C-1′），119.5（C-2，C-6），116.6（C-3，C-5），116.3（C-3′，C-5′），103.6（glc-1），78.0（glc-3），75.6（glc-5），75.0（glc-2），72.1（glc-4），64.4（glc-6）。與文獻(xiàn)［11］報(bào)道的對(duì)羥基苯甲?；芄找恢?。

4 肝細(xì)胞保護(hù)活性研究

將各化合物溶于DMSO中，配成50 mmol／L 母液，采用含1%青霉素-鏈霉素、10%滅活新生牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)HL-7702 細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞懸液，按3.5×103／孔密度接種至96孔板，每孔100 μL，再將其放在37 ℃、5% CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后分為空白組、模型組、給藥組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，空白組為含1%新生牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基，模型組為30 mmol／L 對(duì)乙酰氨基酚，造模4 h；給藥組為30 mmol／L對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)損傷4 h后，加入不同濃度正丁醇提取物或各化合物。繼續(xù)孵育24 h后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞形態(tài)，每孔加入5 mg／mL MTT 20 μL，孵育4 h 后終止培養(yǎng)，移除上清液，加入150 μL DMSO，充分振蕩混勻，待紫色結(jié)晶物充分溶解后用酶標(biāo)儀在490 nm 測(cè)得光密度（OD），計(jì)算細(xì)胞增殖存活率，公式為存活率＝（給藥組平均OD值／空白對(duì)照組OD值）×100%；細(xì)胞保護(hù)率，公式為保護(hù)率＝ ［（給藥組OD值-模型組OD值）／（空白組OD值-模型組OD值）］×100%；EC50為保護(hù)率50%時(shí)化合物濃度。

圖1 顯示，30 mmol／L 對(duì)乙酰氨基酚造模4 h時(shí)，肝細(xì)胞存活率為50%～70%，表明模型較穩(wěn)定［12］；茺蔚子正丁醇提取物在25～100 μg／mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)受損HL-7702 細(xì)胞具有明顯保護(hù)作用（P＜0.05），在25 μg／mL 時(shí)可增加對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)受損肝細(xì)胞的存活率（P＜0.05）。

圖1 茺蔚子正丁醇提取物對(duì)APAP 損傷的HL-7702 細(xì)胞的保護(hù)作用Fig.1 Protective effects of n-butanol extract of Leonuri Fructus on APAP-injured HL-7702 cells

再進(jìn)行肝細(xì)胞保護(hù)作用篩選，結(jié)果見(jiàn)圖2。模型組細(xì)胞存活率低于空白組（P＜0.01）；化合物1、2、4～6 可不同程度增加對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)受損肝細(xì)胞的存活率，其中4、5 保護(hù)作用最顯著，在濃度為50 μmol／L 時(shí)存活率分別為（101.0±4.16）%、（128.7±4.74）%，EC50分別為（35.71±6.26）、（6.66±0.79）μmol／L。

圖2 化合物4、5 對(duì)APAP 損傷的HL-7702 細(xì)胞的保護(hù)作用Fig.2 Protective effects of compounds 4 and 5 on APAP-injured HL-7702 cells

5 討論

茺蔚子傳統(tǒng)用法是以水煎入藥，目前報(bào)道其水溶性成分主要為氨基酸，而對(duì)其他成分的研究較少［13-14］。本實(shí)驗(yàn)采用多種色譜分離方法和現(xiàn)代波譜學(xué)手段，從茺蔚子正丁醇部位分離鑒定了4 個(gè)苯乙醇苷類、3 個(gè)酚苷類化合物，其中化合物2、4～7 均為首次從該植物中發(fā)現(xiàn)。

茺蔚子、益母草來(lái)源于同株植物的不同入藥部位，功效有差異［15-16］，前者除具有活血調(diào)經(jīng)的功效外，臨床上還用于目赤腫痛或云翳等眼科疾?。?7］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)茺蔚子“清瀉肝熱”的傳統(tǒng)功效進(jìn)行探索，發(fā)現(xiàn)其正丁醇部位具有肝細(xì)胞保護(hù)作用，并發(fā)現(xiàn)多個(gè)對(duì)APAP 損傷的HL-7702 肝細(xì)胞具有保護(hù)作用成分，可能是該植物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。