LncRNA ZFAS1作為ceRNA吸附miR-541-3p調(diào)控胃癌侵襲轉(zhuǎn)移①

王 慧 姚振濤 白淇文 王賽琪④ 孫克然④ 陳小兵④⑤

（鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，河南省腫瘤醫(yī)院內(nèi)鏡中心，鄭州 450003）

胃癌是一種源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，在中國(guó)發(fā)病率和病死率都處于較高水平，地域環(huán)境、飲食生活習(xí)慣、幽門螺桿菌感染、遺傳等多種因素可導(dǎo)致發(fā)?。?-2］。目前的治療方法主要有手術(shù)治療、化療、靶向治療等，預(yù)后與胃癌的病理分期、部位、組織類型等多種因素有關(guān)，早期胃癌預(yù)后較好，但早期胃癌患者大多無明顯癥狀，很難被診斷出來［3-5］。因此，探究胃癌進(jìn)展的分子機(jī)制變化是十分重要的。

近些年，隨著對(duì)非編碼RNA 的研究逐漸深入，關(guān)于LncRNAs 和miRNAs 在胃癌中的作用也受到廣泛關(guān)注［6-7］。LncRNA 是一類長(zhǎng)度大于200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，能參與調(diào)控表觀遺傳、細(xì)胞分化等多種生命活動(dòng)，有大量研究報(bào)道其能作為ceRNA 在包括胃癌在內(nèi)的多種疾病中發(fā)揮作用［8-9］。鋅指蛋白反義鏈1（zinc finger-protein antisense chain 1，ZFAS1）在大腸癌、食管鱗癌等多種消化系統(tǒng)疾病中作為致癌因子發(fā)揮作用［10-11］。ZHANG 等［12］發(fā)現(xiàn)，ZFAS1 在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，并且可以通過miR-200b-3p/WNT1 軸調(diào)控胃癌的惡性進(jìn)展；XU 等［13］報(bào)道下調(diào)LncRNA ZFAS1能夠通過阻斷胃癌細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號(hào)來抑制惡性腫瘤。本研究將通過后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)ZFAS1在胃癌中的作用。

ceRNA 假說闡述了一種RNA 之間相互作用的形式，miRNAs通過mRNA影響基因的表達(dá)，而ceRNA可通過競(jìng)爭(zhēng)性吸附miRNA 對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)生影響，從而對(duì)疾病的進(jìn)展進(jìn)行調(diào)控［14］。miRNA 是長(zhǎng)度為20～24 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，能在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因的表達(dá)，從而影響生物學(xué)進(jìn)程［15］。miRNA能夠參與胃癌的進(jìn)展，且不同的miRNA 發(fā)揮的作用不同。例如，miR-876-5p 在胃癌中發(fā)揮抑瘤作用，并且能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性［16］；而miR-96-5p 則會(huì)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖［17］。miR-541-3p 被報(bào)道能夠在前列腺癌、小細(xì)胞肺癌中發(fā)揮抑癌作用，在胃癌中的作用尚未明確［18-19］。

因此，本文選取LncRNA ZFAS1 和miR-541-3p，通過一系列實(shí)驗(yàn)證明二者的靶向關(guān)系，并探討其在胃癌中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1 以及人胃癌細(xì)胞株SGC-7901、MKN45、BGC-823 均購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；RPMI1640 培養(yǎng)基（22400097）、Trizol 試劑盒（15596026）、BCA 試劑盒（23227）均購(gòu)自Thermo Fisher；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine 3000（L3000-015）購(gòu)自Invitrogen；細(xì)胞轉(zhuǎn)染序列由上海吉瑪基因公司提供；熒光原位雜交試劑盒購(gòu)自銳博生物；雙熒光素酶試劑盒（E2920）購(gòu)自Promega；TransScript ⅡGreen One-Step qRTPCR SuperMix 試劑盒（AQ311-01）購(gòu)自全式金；一抗MMP2（ab97779）、MMP9（ab38898）和二抗山羊抗兔IgG（ab150077）均購(gòu)自Abcam 公司；RIPA 裂解液（R0010）、基質(zhì)凝膠（M8370）、Annexin V-FITC/PI 試劑盒（CA1020-20T）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 儀器 酶標(biāo)儀（MultiskanTMFC）購(gòu)自Thermo Fisher；熒光定量PCR 儀（7500）購(gòu)自美國(guó)ABI 公司；顯微鏡（BX53M）購(gòu)自O(shè)LYMPUS；流式細(xì)胞儀（Cyto?FLEX）購(gòu)自貝克曼庫(kù)爾特。

1.2 方法

1.2.1 組織樣本收集 選取鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院41例胃癌患者的癌組織和癌旁組織，所有患者均行胃癌切除術(shù)且術(shù)前未接受相關(guān)手術(shù)或放化療治療。切除后立刻將樣本組織置于液氮中冷凍并置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩１狙芯拷?jīng)鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)審批同意且所有患者知情同意，患者臨床資料完整且接受隨訪。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1和胃癌細(xì)胞株SGC-7901、MKN45、BGC-823 培養(yǎng)于含胎牛血清及青霉素、鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基內(nèi)，將其置于37 ℃、5%CO2的環(huán)境中，ZFAS1 表達(dá)最高的癌細(xì)胞被用于后續(xù)試驗(yàn)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞轉(zhuǎn)染shRNA scramble、CCAT1 shRNA 及miR-541-3p inhibitor 等并分組。轉(zhuǎn)染步驟依據(jù)Lipofectamine 3000試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn) 使用lncATLAS：（http：//lncatlas.crg.eu/）網(wǎng)站對(duì)ZFAS1 進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。熒光原位雜交試劑盒對(duì)ZFAS1的亞細(xì)胞定位進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)步驟依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。RNA22 網(wǎng)站預(yù)測(cè)ZFAS1 以及miR-541-3p的互作用位點(diǎn)，之后通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證二者之間的靶向關(guān)系。將ZFAS1 的野生型（WT）以及突變型（MUT）的3'UTR 片段分別與miR-541-3p mimic 和mimic NC 共轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞，對(duì)熒光素酶活性進(jìn)行檢測(cè)，轉(zhuǎn)染以及操作步驟均依據(jù)Lipo?fectamine 3000試劑盒說明書。

1.2.4 Real-time quantitative PCR（qRT-PCR）Trizol 試劑盒用于提取細(xì)胞總RNA。利用Trans Script ⅡGreen One-Step qRT-PCR SuperMix 試劑盒一步完成RT-PCR 合成及q-PCR。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件均依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，ZFAS1 序列為（正向：5'-ACCG?GAAGGCTCACCGATCTAC-3'，反向：5'-TACCGAA?CACATGCGGCCAT-3'），miR-541-3p 序列為（正向：5'-CTACATCCCGCATCCGAA-3'，反向：5'-CATGCTTGGACAATACCGC-3'）。ZFAS1 以GAPDH 為內(nèi)參，miR-541-3p 以U6 為內(nèi)參，引物序列由華大基因合成。借助2-ΔΔCt法計(jì)算相關(guān)因子表達(dá)量。

1.2.5 Western blot RIPA 裂解液用于提取細(xì)胞總蛋白，BCA 試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。行SDSPAGE 凝膠電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。用含5%胎牛血清的TBST封閉后，將PVDF膜與一抗MMP2、MMP9 孵育。之后加入山羊抗兔IgG 作為二抗，PVDF 膜與ECL 液在室溫下反應(yīng)1 min。以GAPDH作為內(nèi)參，目標(biāo)條帶與內(nèi)參照條帶的灰度值之比作為蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)水平。采用Image J 對(duì)條帶灰度值進(jìn)行定量分析。

1.2.6 MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 將轉(zhuǎn)染后生長(zhǎng)良好的胃癌細(xì)胞接種于96 孔板上，將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于24 h、48 h、72 h 換液后在各孔中加入20μl MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄上清，在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔OD值。

1.2.7 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞使細(xì)胞密度為2×105個(gè)/ml。將含有基質(zhì)凝膠的小室加入24 孔板。于Transwell小室上室加入200μl 細(xì)胞懸液，下室加入500μl 含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。48 h時(shí)將小室取出，5%多聚甲醛固定30 min，之后用0.1%結(jié)晶紫染色15 min。在顯微鏡下對(duì)跨膜細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.8 Annexin V-FITC/PI 雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞，PBS 沖洗，離心后棄上清，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml，加入500μl結(jié)合緩沖液，之后加入5 μl Annexin-V-FITC 以及5 μl PI 染液并混勻，避光條件下孵育10 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，于530 nm 下檢測(cè)FITC，575 nm下檢測(cè)PI，對(duì)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，首先進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)符合正態(tài)分布且方差齊，則組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，組間采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用事后SNK-q檢驗(yàn)，若不符合正態(tài)性分布或方差齊性則進(jìn)行秩和檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZFAS1 在胃癌中表達(dá)增強(qiáng)而miR-541-3p 表達(dá)被抑制 檢測(cè)癌組織和癌旁組織中ZFAS1 以及miR-541-3p 的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，ZFAS1 在癌組織中表達(dá)增強(qiáng)而miR-541-3p 的表達(dá)顯著降低（均P<0.05）。此外，相對(duì)于GES-1，ZFAS1 在癌細(xì)胞中表達(dá)上升（均P<0.05），同時(shí)miR-541-3p 在癌細(xì)胞中表達(dá)被抑制。其中SGC-7901 變化最明顯，因此被用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。

圖1 ZFAS1和miR-541-3p的表達(dá)Fig.1 Expressions of ZFAS1 and miR-541-3p

2.2 ZFAS1 能夠作為ceRNA 吸附miR-541-3p 使用lncATLAS網(wǎng)站對(duì)ZFAS1進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZFAS1 在細(xì)胞核和胞漿中均有表達(dá)，且主要定位于胞漿，推測(cè)ZFAS1 能夠發(fā)揮分子海綿的作用，F(xiàn)ISH實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了ZFAS1的亞細(xì)胞定位（圖2）。之后通過RNA22 網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)其與miR-541-3p 存在互補(bǔ)配對(duì)堿基，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了二者之間的靶向關(guān)系（圖3）。

圖2 lncATLAS顯示ZFAS1主要定位于細(xì)胞質(zhì)Fig.2 lncATLAS showed that ZFAS1 was mainly locatedin cytoplasm

圖3 ZFAS1和miR-541-3p的靶向關(guān)系驗(yàn)證Fig.3 Verification of targeting relationship between ZFAS1 and miR-541-3p

2.3 ZFAS1沉默促進(jìn)胃癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡，抑制其增殖 檢測(cè)SGC-7901 組、shRNA scramble 組以及ZFAS1 shRNA 組細(xì)胞凋亡以及增殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于SGC-7901 組，抑制ZFAS1 的表達(dá)能夠顯著誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，抑制其增殖活力（均P<0.05）。而SGC-7901 組與shRNA scramble 組的增殖與凋亡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖4。

圖4 ZFAS1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig.4 Effect of ZFAS1 on proliferation and apoptosis of gastric cancer cells

2.4 ZFAS1 沉默能夠抑制胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移 檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲情況以及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于SGC-7901 組，抑制ZFAS1 表達(dá)后細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著減少，且MMP2 和MMP9表達(dá)被顯著抑制（均P<0.05）。shRNA scramble組與SGC-7901 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖5。

圖5 ZFAS1對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響Fig.5 Effect of ZFAS1 on invasion and metastasis of gastric cancer cells

2.5 miR-541-3p inhibitor 逆轉(zhuǎn)ZFAS1 shRNA 對(duì)胃癌細(xì)胞增殖凋亡的影響 檢測(cè)各組細(xì)胞增殖和凋亡情況發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于shRNA scramble組，ZFAS1 shRNA組凋亡增多而增殖被抑制，miR-541-3p inhibitor 組凋亡減少而增殖活力增強(qiáng)（均P<0.05）。提示miR-541-3p inhibitor 能夠部分逆轉(zhuǎn)ZFAS1 shRNA 對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。見圖6。

圖6 ZFAS1吸附miR-541-3p調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖和凋亡Fig.6 ZFAS1 regulates proliferation and apoptosis of gastric cancer cells by sponging miR-542-3p

2.6 miR-541-3p inhibitor 逆轉(zhuǎn)ZFAS1 shRNA 對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響 檢測(cè)各組細(xì)胞MMP2、MMP9的表達(dá)以及細(xì)胞侵襲情況發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于shRNA scramble 組，ZFAS1 shRNA 組細(xì)胞侵襲數(shù)目減少且MMP2 和MMP9 的表達(dá)被抑制，而miR-541-3p inhibitor 組中細(xì)胞侵襲數(shù)目增多，MMP2 和MMP9 表達(dá)增強(qiáng)（P<0.05）。miR-541-3p inhibitor能夠完全逆轉(zhuǎn)ZFAS1 shRNA對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。見圖7。

圖7 ZFAS1吸附miR-541-3p調(diào)控胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移Fig.7 ZFAS1 regulates invasion and metastasis of gastric cancer cells by sponging miR-542-3p

3 討論

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展以及對(duì)非編碼RNA 認(rèn)識(shí)的深入，非編碼RNA 在眾多疾病中的作用被逐漸揭示，并且為疾病治療提供了新方法和新思路，其在胃癌中的作用也受到廣泛關(guān)注［20-21］。在先前的研究中，LncRNA ZFAS1 就被發(fā)現(xiàn)在胃癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并且能夠通過調(diào)節(jié)PCNA、E-cadherin、N-cadherin、vimentin、MMP2 和MMP14 等相關(guān)因子的表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，加速胃癌的進(jìn)展，除此之外，還參與了癌細(xì)胞耐藥［13］。與既往研究一致，本研究發(fā)現(xiàn)LncRNA ZFAS1在胃癌組織和癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。為進(jìn)一步探究其機(jī)制，本課題組通過生物學(xué)信息工具預(yù)測(cè)了LncRNA ZFAS1 的潛在靶點(diǎn)，并通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了LncRNA ZFAS1 與miR-541-3p 之間存在靶向關(guān)系。miR-541-3p 被報(bào)道通過靶向CCND1 阻礙前列腺癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程，miR-541 則通過調(diào)控HMGA2 的表達(dá)抑制小細(xì)胞肺癌的增殖和侵襲［18-19］。本研究對(duì)LncRNA ZFAS1 在胃癌中的作用展開研究，發(fā)現(xiàn)其在胃癌組織和癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，沉默ZFAS1 能促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，抑制其增殖，而這種作用能夠被下調(diào)miR-541-3p的表達(dá)所逆轉(zhuǎn)，具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步探究。除此之外，沉默ZFAS1 還能抑制MMP2 和MMP9 的表達(dá)，從而抑制癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，同樣，這種效果能夠通過下調(diào)miR-541-3p 被挽救。MMPs 是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜成分的蛋白水解酶，增強(qiáng)癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，參與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，通常MMP2 和MMP9 在胃癌中表達(dá)上調(diào)［22-23］。故推測(cè)，ZFAS1 和miR-541-3p 通過調(diào)控MMP2 和MMP9對(duì)胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響。

綜上所述，ZFAS1可作為ceRNA吸附miR-541-3p，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。ZFAS1/miR-541-3p 軸有望成為治療胃癌的新靶點(diǎn)，但本研究未對(duì)其下游基因進(jìn)行具體探究。miR-541-3p 以往被發(fā)現(xiàn)能夠靶向CCND1 基因進(jìn)而調(diào)控前列腺癌的進(jìn)展［18］。而CCDN1 也曾被證實(shí)在胃癌中發(fā)揮促癌作用［24］。因此ZFAS1/miR-541-3p軸能夠通過調(diào)控CCDN1 或其他靶基因進(jìn)而影響胃癌進(jìn)展將是課題組之后重點(diǎn)關(guān)注的方向。