基于循環(huán)伏安法的蜜蜂組織傳感器對蜂蜜品質(zhì)的鑒別

張軍飛，楊雪梅，孫 惠，張 楠，安傳遠(yuǎn)，吳 帆，李紅亮*

（1 中國計量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 浙江省生物計量及檢疫檢驗(yàn)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 310018 2 新疆北屯市新原養(yǎng)蜂農(nóng)民專業(yè)合作社 新疆北屯 750300）

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)[1-3]，含有果糖、葡萄糖、氨基酸、蛋白質(zhì)、酶類、有機(jī)酸、類黃酮及多酚類物質(zhì)等多種營養(yǎng)活性成分[4]，深受消費(fèi)者喜愛。然而，由于歷史和現(xiàn)實(shí)原因，國內(nèi)蜂蜜市場混亂，存在嚴(yán)重質(zhì)量問題。市售蜂蜜主要分為3 種：（一般未成熟） 需加工的原料蜜、加工濃縮蜜和成熟蜜，其中前者是蜂農(nóng)在蜜蜂轉(zhuǎn)地飼養(yǎng)時生產(chǎn)的含水量高，易發(fā)酵的未成熟蜜（或水蜜）；這些未成熟蜜必須經(jīng)濃縮才能保證不發(fā)酵并符合國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中一級蜜要低于20%含水量的要求[2]，這些加工濃縮蜜是商超蜂蜜的主要類型；而成熟蜜是自然成熟至封蓋的蜂蜜，經(jīng)蜜蜂自身充分釀造而成，含水量低（17%以下），濃度較高（不需濃縮），口感醇厚，活性成分含量豐富，具有較高的營養(yǎng)價值和保健功效[5-7]。

目前，對于不同品質(zhì)蜂蜜產(chǎn)品的檢測是科研工作的重點(diǎn)。蜂蜜的主要成分是葡萄糖和果糖，其它成分含量都比較低，這給蜂蜜品質(zhì)辨別帶來極大困難[8]?，F(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)也未對蜂蜜品質(zhì)進(jìn)行有效區(qū)分[1-2]。現(xiàn)有的蜂蜜品質(zhì)辨別方法主要有高效液相色譜法[9]、氣相色譜法及氣相色譜-質(zhì)譜法[10]、光譜法[11]、碳同位素法[12]等，這些方法在一定程度上可以有效辨別不同品質(zhì)的蜂蜜產(chǎn)品。然而，都存在儀器價格昂貴、操作復(fù)雜、檢測時間長、需要專業(yè)知識以及儀器不便攜帶等缺陷[13]。建立一種新型的能夠區(qū)分成熟蜂蜜、加工濃縮蜜以及果葡糖漿的方法，對于完善蜜蜂產(chǎn)品市場監(jiān)管、食品安全以及保障消費(fèi)者的正當(dāng)權(quán)益具有重要的意義。

蜜蜂的味覺系統(tǒng)主要由口器、觸角等組織構(gòu)成[14]。它的口器組織由下唇須、中唇舌組成，組織表面分布著大量能夠感知化學(xué)分子的味覺感受器，而感受器中的味覺感受蛋白和味覺受體，可與糖、鹽、氨基酸等物質(zhì)結(jié)合，在尋找蜜源時發(fā)揮著重要的作用[14-16]。從品質(zhì)上講，成熟蜜顯然優(yōu)于加工濃縮蜜，更優(yōu)于果葡糖漿，研究表明蜜蜂能夠通過味覺系統(tǒng)分辨出三者的異同[17]。利用這種仿生學(xué)原理，使開發(fā)生物傳感器來分辨不同品質(zhì)蜂蜜成為可能。循環(huán)伏安法是一種具有較高準(zhǔn)確度和靈敏度的電化學(xué)分析方法，也非常適合作為生物傳感器的信號采集方法，來準(zhǔn)確記錄和檢測生物元件反應(yīng)時電極表面的電特性變化[18]。

本研究利用蜜蜂對蜂蜜分辨的仿生學(xué)原理，構(gòu)建一種利用蜜蜂口器組織制備的生物傳感器，并采用循環(huán)伏安法建立一種辨別不同品質(zhì)蜂蜜的新方法。作者將蜜蜂口器組織固定在玻碳電極表面形成傳感器，利用循環(huán)伏安法記錄電極表面電位變化，通過檢測口器組織細(xì)胞被不同蜂蜜刺激的響應(yīng)特征，構(gòu)建出成熟蜂蜜、市售蜂蜜以及果葡糖漿的線性回歸模型標(biāo)定傳感器，通過重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證傳感器及其分析模型的有效性和區(qū)分能力的穩(wěn)定性和可靠性，最終確定最佳的區(qū)分濃度區(qū)間。以期為蜂蜜品質(zhì)鑒定提供一套準(zhǔn)確、靈敏、高效的方法，為蜂蜜的食品安全檢測開拓新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

蜜蜂在中國計量大學(xué)校園內(nèi)飼養(yǎng)；鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、氯化鉀等，均購自生工生物工程（上海）有限公司；成熟蜂蜜為新疆北屯新原養(yǎng)蜂農(nóng)民專業(yè)合作社提供，市售蜂蜜和果葡糖漿購自附近超市，其中糖漿中果糖含量不低于55%。上述成熟蜂蜜編號為H0，4 種市售蜂蜜分別編號H1、H2、H3、H4，果葡糖漿編號為F55。

1.2 儀器與設(shè)備

CHI660E 電化學(xué)工作站，三電極系統(tǒng)：玻碳電極（D=3 mm）、銀/氯化銀電極（KCl，c=3 mol/L）、鉑絲對電極（D=0.5 mm，L=35 mm），購自上海辰華儀器有限公司；德國IKAC-MAGHS 4 恒溫加熱磁力攪拌器，購自艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司（IKA，中國）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蜜蜂組織傳感器制備

1.3.1.1 解剖蜜蜂口器組織 用吸蜂器在蜂箱出入口處吸取供試采集蜂（工蜂），置于試管并存放于-20 ℃環(huán)境2 min，低溫凍暈蜜蜂。將暈厥的蜜蜂置于解剖鏡下，借助解剖工具取下口器組織，并用生理鹽水沖洗。

1.3.1.2 口器組織修飾玻碳電極 用0.05 μm 氧化鋁粉末打磨玻碳電極，并使用Microcloth 拋光布拋光。打磨拋光前使用濕潤的擦鏡紙輕拭電極表面，防止污垢顆粒干擾打磨效果。采用黏性材料將口器組織的一端固定于電極絕緣材料部分，保證口器組織與玻碳電極充分接觸，去離子水淋洗后備用。

1.3.2 循環(huán)伏安法測試

1.3.2.1 測試口器組織修飾前后的電極 配制測試底液（鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀/氯化鉀：0.001/0.001/0.1 mol/L）。使用三電極系統(tǒng)、電化學(xué)工作站，采用循環(huán)伏安對電極、修飾電極進(jìn)行掃描測試。操作參數(shù)：掃描電壓范圍-0.3～0.8V，初始掃描極性為負(fù)，掃描段數(shù)為2，掃描速率30 mV/s。氧化峰電壓記為EpA1，氧化峰電流記為IpA1，還原峰電壓記為EpC1，還原峰電流記為IpC1。

1.3.2.2 循環(huán)伏安法檢測樣品 利用制備的蜜蜂組織傳感器對不同種類的蜂蜜樣品溶液進(jìn)行檢測。取適量蜂蜜H0，使用測試底液將其稀釋備用，最終質(zhì)量濃度分別為0.02，0.04，0.06，0.08，0.01，0.12，0.14，0.16，0.18，0.2 g/mL。其它測試樣品進(jìn)行同樣的操作。試驗(yàn)溫度條件控制在（22±1）℃，每個質(zhì)量濃度進(jìn)行3 次重復(fù)掃描。每個組織傳感器采用1 只蜜蜂口器構(gòu)建，試驗(yàn)中采用5 個生物學(xué)重復(fù)的傳感器對每種樣品重復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用CHI660E 軟件將測試數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為文本數(shù)據(jù)，導(dǎo)入Microsoft Excel 2016 軟件統(tǒng)計，計算出峰值電流變化比：

式中：ΔI——峰值電流變化比；I0——質(zhì)量濃度為0.02 g/mL 時的峰值電流，μA；I——質(zhì)量濃度增加后的峰值電流，μA。數(shù)據(jù)以重復(fù)試驗(yàn)的平均數(shù)表示，使用Origin 對循環(huán)伏安曲線進(jìn)行擬合，采用Prism 8.3 軟件進(jìn)行單因素方差分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 制備蜜蜂口器組織傳感器并表征

以玻碳電極為工作電極，用蜜蜂下唇須活體組織進(jìn)行修飾，對其檢測性能進(jìn)行測試，檢測結(jié)果如圖1a。虛線為蜜蜂口器組織修飾前玻碳電極的循環(huán)伏安曲線，黑色曲線為修飾后玻碳電極的循環(huán)伏安曲線。檢測環(huán)境中，正向掃描時出現(xiàn)氧化峰A1，負(fù)向掃描時出現(xiàn)還原峰C1[19]，即檢測底液中的電極表面發(fā)生氧化還原過程。當(dāng)口器組織修飾工作電極后，工作電極表面的導(dǎo)電特性發(fā)生改變，氧化峰電流IpA1值略小于IpC1，二者均由（6.43±0.02）μA 降低至（6.09±0.02）μA，經(jīng)過多次重復(fù)測定，IpA1、IpC1值穩(wěn)定，這種導(dǎo)電特性在整個檢測過程中是穩(wěn)定的且能長久存在，對EpA1、EpC1、EpA1、IpC1無顯著影響。因此，用這種修飾過的工作電極（即蜜蜂口器組織傳感器）來檢測蜂蜜樣品是可行的。

圖1 蜜蜂口器組織傳感器與蜂蜜樣品的循環(huán)伏安圖Fig.1 Cyclic voltammograms of bee mouthpart tissue sensors and honey samples

2.2 蜜蜂口器組織傳感器檢測樣品

蜜蜂口器組織傳感器檢測10 個質(zhì)量濃度梯度（0.02，0.04，0.06，0.08，0.01，0.12，0.14，0.16，0.18，0.2 g/mL）的H0 樣品溶液，利用CHI660E 采集記錄循環(huán)伏安檢測圖，如圖1b 所示。氧化峰、還原峰峰值電壓分別為：EpA1，（0.171±0.006）V；EpC1，（0.238±0.004）V。H0 樣品不同質(zhì)量濃度的檢測結(jié)果中，氧化峰、還原峰的峰值電流見表1。工作電極表面具有生物活性的口器組織對不同質(zhì)量濃度的H0 樣品發(fā)生不同程度的識別作用，表現(xiàn)為循環(huán)伏安圖中峰電流的變化[20]。由圖1b，隨樣品質(zhì)量濃度的增加，電流峰值呈現(xiàn)一定的下降規(guī)律。電流峰值的梯度下降反映了H0 蜂蜜的質(zhì)量濃度，且隨著蜂蜜含量的增大，電流峰值即傳感器的響應(yīng)信號逐漸降低，這說明質(zhì)量濃度越大，口器組織對蜂蜜成分的結(jié)合作用越明顯，對電極表面的導(dǎo)電特性影響越大，因此能夠?qū)㈦娏鞣逯底鳛閭鞲衅鞯捻憫?yīng)信號表征蜂蜜質(zhì)量濃度，甚至蜂蜜的種類。但是，這種作用和影響并不會無限增加，因?yàn)榭谄鹘M織的表面受體結(jié)合物質(zhì)的能力有限，并且具有一定的活性時間限制[21-22]，檢測結(jié)果中表現(xiàn)為峰電流下降的梯度逐漸減小。

表1 H0 樣品10 個質(zhì)量濃度梯度對應(yīng)的氧化峰、還原峰峰值電流Table 1 Peak current of oxidation peak and reduction peak corresponding to 10 mass concentration gradients of H0

2.3 構(gòu)建樣品檢測線性回歸分析模型

各蜂蜜樣品的質(zhì)量濃度與峰值電流變化比具有高度相關(guān)性。利用蜜蜂口器組織傳感器檢測5種蜂蜜樣品和1 種果葡糖漿，電化學(xué)工作站采集記錄循環(huán)伏安圖，提取每種樣品各質(zhì)量濃度時的峰值電流Ip，計算ΔI，即獲得ΔI 與質(zhì)量濃度的線性回歸曲線（圖2）和回歸模型（表2）。如表2所示，6 種樣品的相關(guān)系數(shù)均在0.9365～0.9853 之間；靈敏度即線性分析的斜率在2.363～3.518 之間；與果葡糖漿F55 相比（相關(guān)性和靈敏度分別為0.9480 和2.300），成熟蜜H0 均顯示出較高的靈敏度和線性相關(guān)性（分別為0.9692 和2.497），表明本研究開發(fā)的傳感器對成熟蜜質(zhì)量濃度的變化更為敏感。對于商超蜂蜜樣品，本傳感器對H1 的靈敏度最低，而對H2、H3、H4 的靈敏度均超過3.0（表2），也具有較高的靈敏度。

表2 各樣品線性回歸方程及靈敏度和相關(guān)性參數(shù)Table 2 Linear regression equation，sensitivity and correlation parameters for each sample

圖2 各樣品峰值電流變化比與質(zhì)量濃度的線性回歸曲線Fig.2 Linear regression curve of peak current changeratio and mass concentration of each sample

H0 是由蜂農(nóng)合作社提供的成熟蜂蜜，未經(jīng)過濃縮和加工，而商超蜂蜜由于原料濃度低而大都需要濃縮加工，其營養(yǎng)成分及糖含量與成熟蜜存在一定差異，該生物傳感器在與各樣品結(jié)合過程中能夠基本分辨出成熟蜜與糖漿的區(qū)別，然而并不能區(qū)別商超的濃縮蜜。Wang 等[9]利用高效液相色譜通過建立純蜂蜜特征峰來區(qū)分糖漿以及商超蜂蜜，提高了蜂蜜檢測的準(zhǔn)確度，但僅能區(qū)分C4淀粉糖漿。湯明杰等[19]利用電化學(xué)技術(shù)采集3 種蜜源蜂蜜的電化學(xué)響應(yīng)信號檢測蜂蜜，預(yù)測模型的相關(guān)性為0.9392，相對低于本研究的檢測模型。初步認(rèn)為該傳感器峰值電流變化比能夠一定程度上反映檢測樣品的質(zhì)量濃度變化，但是從靈敏度上對于分辨不同品質(zhì)的蜂蜜仍有一定的欠缺。

2.4 確定辨別的最佳質(zhì)量濃度區(qū)間

在各質(zhì)量濃度下，對獲得的不同樣品的峰電流變化比，進(jìn)行單因素方差分析（P＜0.05），并根據(jù)顯著性差異來判斷該傳感器辨別不同蜂蜜時的最佳質(zhì)量濃度。如圖3所示，在質(zhì)量濃度為0.04～0.08 g/mL 時（圖3a、3b、3c），傳感器對6 個樣品的峰值電流變化比之間差異性并不顯著，可以將H0和H1、H3、H4 區(qū)別開來，而與其它不能區(qū)分，檢測區(qū)分能力較弱；在質(zhì)量濃度為0.1～0.14 g/mL 時（圖3d、3e、3f），根據(jù)峰值電流變化比的差異性可以將6 種樣品分為3 類，明顯區(qū)分出H0、H1、H2蜂蜜，H3、H4、F55 蜂蜜樣品辨別結(jié)果不明確；在質(zhì)量濃度為0.16～0.2 g/mL 時（圖3g、3h、3i），H0、H1、H2、H3 的峰值電流變化比之間具有顯著性差異，表明在該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，傳感器能夠通過電流變化比將4 種蜂蜜辨別出來，而H0 和F55 未體現(xiàn)出顯著性差異。0.16 g/mL 和0.18 g/mL 時（圖3g、3h），差異性分析結(jié)果一致，H4 和H3 檢測結(jié)果一致，F(xiàn)55 和H0 檢測結(jié)果一致；0.2 g/mL 時（圖3i），H4、F55 與H0 的ΔI 未體現(xiàn)出顯著性差異。該結(jié)果可能是由于隨著蜂蜜質(zhì)量濃度的升高，蜂蜜中的特殊成分（如酮類、酚類、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)）在結(jié)合過程中的比重逐漸增大，并占據(jù)主導(dǎo)作用[22]，有效地將H0～H3 蜂蜜區(qū)分開來。在0.16～0.18 g/mL 時（圖3g、3h），H4 與H2 檢測結(jié)果仍然無顯著差異，推測兩種蜂蜜來自同一蜜源的可能性更大；而F55 與H0 的檢測結(jié)果同樣無顯著差異，該濃度范圍內(nèi)難以區(qū)分果葡糖漿和成熟蜜，但是，在質(zhì)量濃度0.08～0.1 g/mL 范圍時（圖3c、3d），二者的峰電流變化比具有顯著差異，能夠被明顯且穩(wěn)定區(qū)分開來，且質(zhì)量濃度為0.14 g/mL 時（圖3f），二者表現(xiàn)為顯著差異，但濃度鄰域內(nèi)情況不明確。綜上所述，該傳感器辨別蜂蜜的最佳質(zhì)量濃度區(qū)間是0.16～0.18 g/mL，辨別果葡糖漿和蜂蜜的最佳質(zhì)量濃度區(qū)間可能為0.08～0.1 g/mL。

圖3 相同質(zhì)量濃度下6 種蜂蜜樣品的峰電流變化比顯著性分析結(jié)果Fig.3 Results of significance analysis of the peak current change ratio of the 6 honey samples at the same mass concentration

2.5 模型及最佳區(qū)分濃度區(qū)間檢測驗(yàn)證

蜜蜂口器組織傳感器檢測樣品實(shí)際測量電流峰值變化比與傳感器線性回歸模型計算出的峰值電流變化比的對比，如圖4所示。柱狀圖的高度體現(xiàn)峰值電流變化比的情況下，質(zhì)量濃度為0.16 g/mL（圖4a）時，實(shí)際測量值和模型計算值基本一致，最高相差0.043；質(zhì)量濃度為0.18 g/mL（圖4b）時，實(shí)測變化比與模型計算變化比稍有差距，但整體保持一致，最高相差0.066，重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果表明在最佳辨別質(zhì)量濃度區(qū)間中，傳感器的線性檢測模型具有較好的穩(wěn)定性和可靠性。分別對樣品質(zhì)量濃度為0.16，0.18 g/mL 的實(shí)際測量結(jié)果進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05），結(jié)果與2.4 節(jié)保持一致，能夠穩(wěn)定區(qū)分H0、H1、H2、H3 4 種蜂蜜，表明0.16～0.18 g/mL 確為最佳辨別質(zhì)量濃度區(qū)間，并且該質(zhì)量濃度區(qū)間內(nèi)區(qū)分能力具有很好的穩(wěn)定性。在成熟蜜與果葡糖漿的最佳辨別質(zhì)量濃度驗(yàn)證中，實(shí)際測量值的顯著性分析結(jié)果仍然表現(xiàn)為顯著性差異，表明在質(zhì)量濃度區(qū)間確能穩(wěn)定區(qū)分二者。但是，0.08 g/mL（圖4c）時，成熟蜜的測量變化比高于模型計算變化比約0.147，果葡糖漿的變化比基本不變；0.1 g/mL（圖4d）時，成熟蜜的測量變化比高于模型計算變化比約0.015，果葡糖漿的測量變化比高于模型計算變化比約0.047，推測在質(zhì)量濃度0.08～0.1 g/mL 區(qū)間內(nèi)，檢測濃度越靠近中間區(qū)域，模型對二者區(qū)分的有效性和穩(wěn)定性越好，即傳感器對二者的辨別能力最優(yōu)。

圖4 最佳辨別質(zhì)量濃度下傳感器實(shí)際測量變化比與模型計算變化比對比圖Fig.4 Comparison of the actual detected change ratio of the sensor and the calculated change ratio of the model at the best identification mass concentration

3 結(jié)論

利用蜜蜂口器組織修飾玻碳電極，成功制備了一種味覺組織生物傳感器，采用循環(huán)伏安法結(jié)合線性回歸分析模型可以辨別不同蜂蜜樣品。結(jié)果表明，利用該味覺組織傳感器檢測信號的線性模型能夠穩(wěn)定且可靠地區(qū)分不同品質(zhì)蜂蜜或糖漿，且辨別成熟蜜和商超蜂蜜的最佳質(zhì)量濃度區(qū)間為0.16～0.18 g/mL，辨別成熟蜜和果葡糖漿的最佳質(zhì)量濃度區(qū)間為0.08～0.1 g/mL。本研究構(gòu)建的味覺組織傳感器能夠用于蜂蜜檢測，為蜂蜜品質(zhì)鑒定提供了一項(xiàng)新的解決方案，為不同品質(zhì)蜂蜜的儀器辨別提供了新的思路。