內(nèi)鏡下特征聯(lián)合Ki67對早期結(jié)直腸癌黏膜下浸潤的評估價(jià)值

溫聰聰， 周 姝， 劉 華， 吳德卿， 徐曉蓉,

(1. 南京醫(yī)科大學(xué)上海十院臨床醫(yī)學(xué)院消化內(nèi)科，上海 200072； 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200072)

早期結(jié)直腸癌(early colorectal cancer, ECC)指癌細(xì)胞浸潤至黏膜下層，但未累及固有肌層[1]。在腸道上皮腫瘤診治的環(huán)節(jié)中，黏膜下層浸潤深度的識別是關(guān)鍵一環(huán)，高級別上皮內(nèi)瘤變(high-grade neo-plasia, HGN)與淺表黏膜下層結(jié)直腸癌為內(nèi)鏡下治療的良好適應(yīng)證，而黏膜下層浸潤深度>1 mm是內(nèi)鏡切除術(shù)后殘留癌、ECC患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高危因素[2]。盡管已有不少研究從白光、色素內(nèi)鏡角度探討相關(guān)特征與腫瘤浸潤深度的關(guān)系，但術(shù)前判斷的準(zhǔn)確性、術(shù)后是否需追加外科手術(shù)等問題尚未完全解決。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年9月—2022年1月于同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心接受結(jié)直腸息肉治療的患者且本次切除病變術(shù)后病理診斷為高級別瘤變(high-grade neoplasia, HGN)、黏膜內(nèi)癌(intram-ucosal carcinoma, MC)、黏膜下浸潤癌(submucosal invasive carcinoma, SMIC)者進(jìn)行回顧性研究。排除標(biāo)準(zhǔn): (1) 有炎癥性腸病、家族性腺瘤性息肉、既往有中、晚期結(jié)直腸惡性腫瘤病史；(2) 有其他部位惡性腫瘤病史；(3) 切除標(biāo)本無法獲取或缺失切除病灶免疫組化結(jié)果；(4) 病理報(bào)告未具體記錄病灶黏膜下層浸潤的深度。

1.2 研究方法

2019年9月—2022年1月收集ECC病例，根病灶病理結(jié)果分為3組: HGN組(50例)、MC組(49例)、SMIC組(33例)，其中SMIC病例依浸潤深度分為黏膜下淺層浸潤(SM-s)組21例和黏膜下深層浸潤(SM-d)組12例。回顧性收集患者的病史、白光結(jié)腸鏡檢查的內(nèi)鏡特征，基于窄帶成像(narrow-band image, NBI)技術(shù)留取的病變照片隨機(jī)編號后亂序排列，交由2位高年資內(nèi)鏡醫(yī)師獨(dú)立觀察表面結(jié)構(gòu)和微血管形態(tài)并記錄病灶JNET分型結(jié)果、切除病灶免疫組化切片在高倍鏡下隨機(jī)選取5個視野，計(jì)數(shù)Ki67陽性染色細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算5個視野下陽性染色細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比的平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 一般資料

本研究共納入132例患者(132處病灶)，其中HGN組50例，MC組49例，SMIC組33例，男性82例，女性50例，平均年齡為(63.45±10.5)歲。本研究中一代直系親屬有結(jié)直腸癌史的患者僅1例，3組間年齡、性別、便血、血紅蛋白水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。HGN組患者無消瘦癥狀，MC組和SMIC組患者消瘦表現(xiàn)的分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 患者一般資料比較Tab.1 General information and clinical indicatorsin three groups

2.2 病灶的內(nèi)鏡下特征

納入132例ECC病灶的平均直徑為(26.22±11.6) mm，僅1(0.8%)個病灶直徑<10 mm，92.4%病灶直徑在10～40 mm，位于直腸、乙狀結(jié)腸、降結(jié)腸的病灶分別占31.1%、30.3%、13.6%，病灶巴黎分型以0-Ⅰp型(51.5%)、0-Ⅰs型(28.8%)、0-Ⅱa型(13.6%)為主。11.4%病灶表面存在糜爛或者潰瘍，42.4%病灶表面呈結(jié)節(jié)狀，46.2%病灶黏膜顏色較周圍正常黏膜發(fā)紅。

51.0%MC組病灶直徑≥30 mm，占比最高，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HGN組、MC組、SMIC組位于左半結(jié)腸及直腸的病灶比例依次增加，其中SMIC組中比例高達(dá)84.8%，但3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組中隆起型病灶的占比分別為72.0%、89.8%、81.8%，均高于平坦型病灶，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。18.2%SMIC組病灶表面有中央凹陷，顯著高于HGN組(4.0%)和MC組(2.0%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而組間病灶表面存在糜爛潰瘍、表面結(jié)節(jié)狀的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。有序多因素回歸結(jié)果發(fā)現(xiàn): 位于左半結(jié)腸及直腸(OR=2.487，95%CI: 1.081～5.717)、表面存在中央凹陷(OR=10.772,95%CI: 2.211～52.479)、黏膜顏色較周圍正常黏膜顏色紅(OR=2.168,95%CI: 1.084～4.334)和Ki67陽性細(xì)胞比率>25%(OR=2.668，95%CI: 1.171～6.083)是結(jié)直腸病灶發(fā)生黏膜下浸潤的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表2 病灶鏡下特征比較Tab.2 Endoscopic features of included lesionsin three groups

應(yīng)用NBI觀察33例黏膜下浸潤結(jié)直腸癌病灶，并記錄相應(yīng)JNET分型,見圖1。其中JNET分型為2A型共10枚，浸潤深度均為SM-s；Type 2B型共14枚，對應(yīng)浸潤深度為10枚SM-s,4枚SM-d;Type 3型共9枚，對應(yīng)浸潤深度為1枚SM-s，8枚SM-d。SM-s組和SM-d組間JNET分型分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，SM-d組中3型病灶比例顯著高于SM-s組(P<0.001)。3型對黏膜下深層浸潤的敏感度、特異度、準(zhǔn)確率、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為66.7%、95.2%、84.8%、88.9%和83.3%。

圖1 NBI模式下JNET分型特點(diǎn)Fig.1 Features of JNET classification under NBI modeA: Type 2A型，血管粗細(xì)、分布均勻，表面結(jié)構(gòu)規(guī)則，呈樹枝狀改變；B: Type 2B型，血管結(jié)構(gòu)粗細(xì)不均、分布不均，表面結(jié)構(gòu)不規(guī)則；C: 3型，缺乏血管腺管結(jié)構(gòu)

2.3 病灶Ki67表達(dá)

HGN組、MC組、SMIC組病灶Ki67陽性細(xì)胞比率>25%的比例分別為68.0%、79.2%、84.8%，但3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.177)。SM-s組23.8%病灶Ki67陽性細(xì)胞比率<25%，而SM-d組所有病灶Ki67陽性細(xì)胞比率均超過25%，超83%病灶Ki67陽性細(xì)胞比率>50%。將病灶Ki67陽性細(xì)胞比率劃分為有序分類變量，<1%計(jì)0分，1%～24%計(jì)1分，25%～49%計(jì)2分，50%～74%計(jì)3分，≥75%計(jì)4分，秩和檢驗(yàn)結(jié)果示SM-s組和SM-d組病灶Ki67陽性細(xì)胞比率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026)。病灶的Ki67陽性細(xì)胞比率與黏膜下浸潤深度之間存在正向弱相關(guān)關(guān)系(r=0.394，P=0.023)。

2.4 JNET分型聯(lián)合Ki67診斷黏膜下深層浸潤

JNET(AUC=0.889，95%CI: 77.56%,100.22%)、Ki67(AUC=0.726，95%CI: 55.17%,90.07%)對于SM-d 有較高的診斷價(jià)值。而JNET聯(lián)合Ki67對于SM-d的診斷價(jià)值非常高(AUC=0.952，95%CI: 88.32%～102.16%)，在約登指數(shù)最大時(shí)的敏感度為88.3%，特異度為95.2%。Ki67、JNET聯(lián)合Ki67兩種診斷效果的AUC值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018)，見圖2。

圖2 JNET聯(lián)合Ki67陽性細(xì)胞比率預(yù)測SM-d的ROC曲線Fig.2 The ROC curve of JNET classification combined with Ki67 in predicting SM-d

3 討 論

據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)編制的GLOBOCAN 2020年癌癥發(fā)病率和死亡率估計(jì)值: 結(jié)直腸癌(colorectal carcinoma, CRC)位居惡性腫瘤發(fā)病譜第3位及惡性腫瘤死亡譜第2位[3]，我國CRC發(fā)病率及死亡率也呈現(xiàn)上升趨勢，其發(fā)病率從40歲開始上升，在50歲時(shí)出現(xiàn)顯著上升趨勢，男性CRC發(fā)病率及死亡率均高于女性[4]。Ⅰ期CRC與發(fā)生轉(zhuǎn)移的Ⅳ期患者的5年相對生存率存在顯著差異，Ⅰ期CRC可達(dá)90%，Ⅳ期僅為14%[5]，對CRC的早期診斷、早期干預(yù)治療可明顯改善患者生存質(zhì)量及提高患者5年相對生存率。

目前國內(nèi)外指南均支持，ECC首選內(nèi)鏡下治療，主要是內(nèi)鏡下黏膜切除術(shù)(endoscopic mucosal resection, EMR)和內(nèi)鏡下黏膜剝離術(shù)(endoscopic sumucosal disection, ESD)。其中SMIC的治療方式選擇相對謹(jǐn)慎、復(fù)雜，黏膜下層浸潤深度≤1 mm時(shí)，一般推薦內(nèi)鏡下治療，而深層黏膜下浸潤因有約10%的淋巴轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[6]，推薦外科手術(shù)治療，因此如何術(shù)前診斷黏膜下浸潤癌及準(zhǔn)確判斷其浸潤深度對患者治療至關(guān)重要。

腺瘤性息肉是CRC的重要癌前病變，這些病變積累足夠突變后可發(fā)展為HGN、浸潤性癌，其癌變與腺瘤的數(shù)目、大小、位置、腺瘤種類、腺瘤表面形態(tài)等多因素有關(guān)。研究表明SMIC多發(fā)生在乙狀結(jié)腸、直腸，直徑<10 mm的病灶發(fā)生黏膜下浸潤的概率<1%[7]，隨著病灶直徑的增加，黏膜下浸潤的風(fēng)險(xiǎn)也逐漸增加。尤其當(dāng)病灶直徑>50 mm時(shí)，黏膜下浸潤風(fēng)險(xiǎn)顯著增加[8]。本研究納入病灶61%以上位于直腸及乙狀結(jié)腸，病灶直徑集中在20～40 mm，MC組>30 mm病灶比例顯著高于HGN組和SMIC組(P=0.025)，未見病灶黏膜下浸潤風(fēng)險(xiǎn)隨著直徑增大而增加(P>0.05)。病灶直徑與SMIC浸潤深度相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)深層黏膜下浸潤C(jī)RC病灶平均直徑大于淺層浸潤者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[9]。本研究結(jié)果類似，SM-d組病灶平均直徑[(24.58±6.8) mm]大于SM-s組[(22.81±8.9) mm]，組間差異同樣無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Burgess等[8]發(fā)現(xiàn)淺表凹陷型(0-Ⅱc)是結(jié)直腸病灶發(fā)生黏膜下浸潤的高危因素。18.2%SMIC組病灶表面有中央凹陷，顯著高于HGN組(4.0%)和MC組(2.0%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)。本研究中表面存在中央凹陷病灶是表面無中央凹陷病灶癌變的10.77倍?；貧w模型分析結(jié)果顯示: 位于左半結(jié)腸及直腸、表面存在中央凹陷、黏膜顏色較周圍正常黏膜顏色紅和Ki67陽性細(xì)胞比率>25%是結(jié)直腸病灶發(fā)生黏膜下浸潤的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

普通白光內(nèi)鏡很難準(zhǔn)確判斷SMIC浸潤深度，臨床上常借助多種光學(xué)增強(qiáng)內(nèi)鏡技術(shù)用于胃腸道早癌的診治?；谡瓗С上?NBI)放大內(nèi)鏡的JNET分型應(yīng)用廣泛，通過實(shí)時(shí)觀察病變表面結(jié)構(gòu)和微血管形態(tài)幫助判斷病理改變及浸潤深度[10]。Sumimoto等[11]認(rèn)為JNET-3型是診斷SM-d的可靠指標(biāo)，其敏感度、特異度和準(zhǔn)確率為55.4%、99.8%和96.6%。本研究33例SMIC病灶中JNET-3型共9例，其中8例為SM-d，JNET-3型診斷SM-d的敏感度、特異度、準(zhǔn)確率分別為66.7%、95.2%、83.3%，也呈現(xiàn)出高特異度和準(zhǔn)確率。因此內(nèi)鏡下觀察到病灶JNET-3型改變時(shí)，強(qiáng)烈提示已浸潤黏膜下深層，需要慎重考慮治療方式，甚至可將JNET-3型作為內(nèi)鏡治療的禁忌證。

Ki67作為增殖細(xì)胞相關(guān)抗原，廣泛用于病理評估各種惡性腫瘤的細(xì)胞增殖能力，如肺癌、乳腺癌、淋巴瘤等[12-13]。Ki67表達(dá)在CRC的預(yù)后預(yù)測價(jià)值存在爭議，Melling等[14]認(rèn)為Ki67高表達(dá)與CRC的低腫瘤分期相關(guān)。多項(xiàng)研究認(rèn)為Ki67高表達(dá)提示CRC預(yù)后不良，CRC的浸潤深度、腫瘤大小、腫瘤分化程度在不同Ki67表達(dá)組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[15-16]。Sugai等[17]定量分析黏膜下浸潤性結(jié)直腸癌中Ki67、p53、MMP7及α-SMA、CD10、FSP-1、FAP-1等表達(dá)，探究癌細(xì)胞及周圍基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)模式與淋巴轉(zhuǎn)移之間的關(guān)聯(lián)，多變量分析顯示Ki67的高表達(dá)水平與黏膜下浸潤性結(jié)直腸癌的淋巴轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)。對于Ki67的截?cái)嘀的壳吧写嬖跔幾h，一項(xiàng)評估Ki67與預(yù)后相關(guān)的各種截止水平的薈萃分析表明，與評估的其余截止點(diǎn)相比，Ki67陽性細(xì)胞比率>25%可提供更高的死亡風(fēng)險(xiǎn)區(qū)分能力[18]。Tong等[16]通過分析2 080例CRC病灶Ki67表達(dá)量與病理資料的相關(guān)性，病灶Ki67陽性細(xì)胞比率(+: >0且≤25%、++: >25且≤50%、+++: >50且≤75%、++++: >75%)在結(jié)直腸癌病灶不同浸潤深度(Tis和T1、T2、T3、T4)中的分布具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。Ki67的表達(dá)水平與病灶浸潤深度存在正向相關(guān)關(guān)系(r=0.170，95%CI: 0.113～0.225，P<0.001)。本研究對病灶浸潤深度劃分，病灶Ki67陽性細(xì)胞比率>25%在HGN組、MC組、SMIC組的分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對黏膜下層浸潤結(jié)直腸癌進(jìn)一步劃分浸潤深度，SM-s組和SM-d組病灶Ki67陽性細(xì)胞比率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026)。病灶的Ki67表達(dá)水平與黏膜下浸潤深度之間存在正向相關(guān)關(guān)系(r=0.394，P=0.023)。本研究還發(fā)現(xiàn)病灶Ki67陽性細(xì)胞比率>25%是結(jié)直腸病灶癌變的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。上述發(fā)現(xiàn)表明，使用25%作為Ki67表達(dá)的截止值是理想的，Ki67對早期結(jié)直腸癌的浸潤深度判斷具有重要意義。

JNET分型單獨(dú)診斷SM-d呈現(xiàn)出較高特異度和稍差敏感度，而病灶Ki67陽性細(xì)胞比率單獨(dú)診斷SM-d時(shí)則結(jié)果相反。聯(lián)合病灶JNET分型和Ki67陽性細(xì)胞比率時(shí)，則呈現(xiàn)出高敏感度和高特異度(83.3%和95.2%)。本研究JNET分型聯(lián)合病灶Ki67陽性細(xì)胞比率診斷SM-d時(shí)，ROC曲線的曲線下面積高達(dá)0.952，這表明內(nèi)鏡下病灶特征聯(lián)合免疫組化有望提高評估黏膜下浸潤深度的準(zhǔn)確性。但本研究黏膜下浸潤結(jié)直腸癌的樣本量較小及構(gòu)成比偏倚較大，可能對結(jié)論有一定影響。

本研究初步探究了鏡下病灶特征聯(lián)合Ki67陽性細(xì)胞比率與病灶黏膜下層浸潤深度之間的關(guān)系，不足之處為單中心研究，樣本量相對較少。今后需多中心、擴(kuò)大樣本量來進(jìn)一步研究。