創(chuàng)傷性顱腦損傷患者血清M-sec蛋白的表達(dá)與認(rèn)知功能障礙的相關(guān)性研究

馮九庚，鄒樹峰,陳偉,2

（1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，南昌 330006；2.上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)外科，上海 201299）

創(chuàng)傷性顱腦損傷（Traumatic Brain Injury,TBI）的發(fā)病率逐年增長(zhǎng)[1]，因神經(jīng)元功能缺失所致的功能障礙改變嚴(yán)重影響著患者的生存質(zhì)量[2]。近年來(lái)，納米樣隧道管（Tunneling Nanotubes,TnTs）已經(jīng)成為細(xì)胞間研究的熱點(diǎn)之一。盡管目前對(duì)于TnTs的形成尚不完全明確，有研究顯示哺乳動(dòng)物的腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)因子2（Tumor Necrosis Factor-alpha Induced Protein2,TNFAIP2，又名Msec）蛋白為TnTs形成過(guò)程中不可或缺的蛋白[3-4]，并受腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factoralpha,TNF-α)調(diào)節(jié)，因此我們推測(cè)M-sec蛋白可以作為TnTs形成的標(biāo)記蛋白。本文對(duì)TBI患者進(jìn)行回顧性研究，收集TBI患者268例，動(dòng)態(tài)檢測(cè)傷后血清TNF-α、M-sec蛋白含量的變化，傷后6個(gè)月采用蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表（Montreal cognitive assessment,MoCA）評(píng)價(jià)患者有無(wú)認(rèn)知功能障礙，并比較多時(shí)間節(jié)點(diǎn)血清M-sec蛋白含量與MoCA評(píng)分的相關(guān)性。

1 研究對(duì)象

1.1研究組選入標(biāo)準(zhǔn) 明確的TBI病史，TBI后24小時(shí)內(nèi)入院；年齡16~65歲；均受過(guò)小學(xué)以上程度教育；病情穩(wěn)定，在急性期內(nèi)可耐受腰穿，后期可進(jìn)行認(rèn)知功能的測(cè)定。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往有嚴(yán)重的TBI病史及其它顱內(nèi)疾病史；受傷前有反復(fù)腦卒中及癡呆表現(xiàn)；合并其它嚴(yán)重的多臟器損傷；既往有垂體和甲狀腺疾病、嚴(yán)重肝衰竭、糖尿病、惡性腫瘤等全身性疾病史；嚴(yán)重失語(yǔ)和意識(shí)障礙；死亡及失訪病例。共納入研究268例，男性181例，女性87例；年齡18~65歲，平均年齡（41.82±11.22）歲；初中文化程度78例，高中文化程度103例，大學(xué)及以上文化程度87例；受傷方式：車禍傷141例，打擊傷23例，墜落傷88例，跌傷12例；格拉斯哥昏迷評(píng)分（Glasgow Coma Score,GCS）3~8分27例，9~12分51例，13~15分190例。同時(shí)分別在三個(gè)醫(yī)院共選取100例常規(guī)體檢成年患者作為對(duì)照，且MoCA評(píng)分在正常范圍內(nèi)，其中男性70例，女性30例，年齡在18~65歲，平均年齡（40.38±10.66）歲；初中文化程度28例，高中文化程度38例，大學(xué)及以上文化程度34例。本研究經(jīng)過(guò)病人或其家屬的知情同意并自愿參加，上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院、南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院及南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查同意。兩組年齡、性別和文化程度比較無(wú)明顯差異（P>0.05）,具有可比性。

1.2認(rèn)知功能的評(píng)估 本組患者在TBI后6個(gè)月由經(jīng)過(guò)正規(guī)培訓(xùn)的神經(jīng)外科及創(chuàng)傷中心醫(yī)師對(duì)其進(jìn)行認(rèn)知功能的測(cè)試。測(cè)試時(shí)間為北京時(shí)間下午14:00，最長(zhǎng)時(shí)限為30分鐘。選用MoCA量表來(lái)評(píng)估患者認(rèn)知功能，總分為30分，得分>26分提示存在認(rèn)知功能障礙。比較認(rèn)知功能障礙與無(wú)認(rèn)知功能障礙患者的差異。

1.3 TNF-a、M-sec測(cè)定方法 研究組于傷后第1、3、5、7、14天清晨采集空腹血4 mL，4000 r/min×10 min，取上清液，-20℃保存待用。采用化學(xué)發(fā)光法分別測(cè)定血清TNF-α和M-sec含量，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），嚴(yán)格按照各自試劑盒（博士德生物，中國(guó)）的操作說(shuō)明進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀（TECAN，奧地利）在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)度吸光度值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清TNF-α、M-sec蛋白濃度，對(duì)照組早晨空腹采集靜脈血4 mL，同上方法保存和測(cè)定，分析血清TNF-α、M-sec蛋白動(dòng)態(tài)變化與認(rèn)知功能障礙的相關(guān)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行分析計(jì)量資料用(±s)表示，組間比較有采用設(shè)計(jì)兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，對(duì)有認(rèn)知功能障礙患者與無(wú)認(rèn)知功能障礙患者比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。TBI后個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清M-sec蛋白與MoCA意義評(píng)分采用Pearson相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TBI后認(rèn)知功能障礙情況 根據(jù)MoCA量表評(píng)估，研究組傷后6個(gè)月存在認(rèn)知功能障礙108例，（40.29%），認(rèn)知功能障礙病人在視空間與執(zhí)行、注意力與計(jì)算、語(yǔ)言能力、抽象能力及延遲記憶等方面差異明顯（P<0.05）,而在命名和定向力方面無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 TBI后血清TNF-α、M-sec蛋白動(dòng)態(tài)變化TNF-α和M-sec蛋白在正常對(duì)照組組含量分別為(0.56±0.11)ng/mL和(54.25±8.66)ng/mL。TBI患者血清TNF-α和M-sec蛋白含量在TBI后隨著患者有無(wú)認(rèn)知功能障礙而表達(dá)呈不同趨勢(shì)，在無(wú)認(rèn)知功能障礙患者中，TBI后第1天TNF-α、M-sec表達(dá)明顯較對(duì)照組升高（P<0.05），且在傷后7 d內(nèi)都維持在較高水平（P<0.05），在傷后14 d降低至與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異。而在TBI后有認(rèn)知功能障礙組表現(xiàn)則不同，TNF-α、M-sec表達(dá)在傷后第1天則明顯降低，與正常組及無(wú)認(rèn)知功能障礙組差異明顯（P<0.05），并在傷后第3天TNF-α、M-sec蛋白含量均降至最低水平，并與無(wú)認(rèn)知功能障礙組差異明顯（P<0.05），TBI后第5、7天兩者的表達(dá)明顯回升，甚至明顯高于正常組（P<0.05），并與無(wú)認(rèn)知功能障礙組無(wú)明顯差異（P>0.05），在傷后14天，有認(rèn)知功能障礙組的兩者蛋白水平恢復(fù)到與無(wú)認(rèn)知功能障礙組、正常對(duì)照組均無(wú)明顯差異（P>0.05），見(jiàn)表2，3。

2.3 TBI患者血清M-sec動(dòng)態(tài)變化與認(rèn)知功能障礙的相關(guān)性分析 將患者傷后6個(gè)月的MoCA評(píng)分與各時(shí)間點(diǎn)血清M-sec含量進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，傷后第3天血清M-sec表達(dá)與MoCA評(píng)分相關(guān)性最為明顯（P<0.05），而傷后第5天Msec含量與MoCA評(píng)分則無(wú)明顯的相關(guān)性（P>0.05）。說(shuō)明TBI患者急性期血清M-sec含量有助于預(yù)測(cè)患者傷后有無(wú)認(rèn)知功能障礙的發(fā)生，而且在傷后第3天的血清M-sec值與認(rèn)知功能相關(guān)系數(shù)最大，說(shuō)明傷后第3天血清M-sec蛋白含量最能反應(yīng)認(rèn)知功能的預(yù)后，見(jiàn)表4。

表1 有無(wú)認(rèn)知功能障礙TBI患者M(jìn)o CA量表各認(rèn)知領(lǐng)域評(píng)分比較

3 討論

TBI后的神經(jīng)元的治療是一個(gè)世界范圍內(nèi)的難點(diǎn)、熱點(diǎn)。星形膠質(zhì)細(xì)胞（Astrocyte）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的細(xì)胞類型，除了支持、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元外，還參與調(diào)控神經(jīng)元的功能[5]。我們近期的研究結(jié)果顯示，星形膠質(zhì)細(xì)胞可能通過(guò)緩解神經(jīng)元的鈣超載從而產(chǎn)生保護(hù)作用[6]，但此過(guò)程的具體機(jī)制并不完全明確。我們前期針對(duì)于在星形膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)的縫隙連接蛋白阿爾法1（GJA1）蛋白進(jìn)行了深入的研究，并已證明非磷酸化的GJA1蛋白在星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)中起著極為重要的作用[7-8]，由于神經(jīng)元的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于星形膠質(zhì)細(xì)胞，單純的相鄰星形膠質(zhì)細(xì)胞—神經(jīng)元間GJA1的數(shù)量及功能不足以維持星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。因此，我們推測(cè)其它的細(xì)胞間直接連接方式在腦損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)中可能起著更為重要的作用。目前，在這方面與TBI的相關(guān)的研究較少。

15年前，細(xì)胞間的TnTs通道被首次提及,其直徑多在50~1000 nm,而長(zhǎng)度一般在數(shù)微米到數(shù)百微米，可供較大分子量的物質(zhì)通過(guò)（>1.2kD）[9-10]。M-sec最初被稱為TNF-α誘導(dǎo)因子2，其功能尚不完全明確[11]。有研究顯示，M-sec可誘導(dǎo)細(xì)胞膜的F-肌動(dòng)蛋白（F-actin）形成凸起，進(jìn)而延展形成TNTs通道[12]，因此M-sec蛋白亦被稱為TnTs的標(biāo)志蛋白[13]。當(dāng)前與TNTs有關(guān)損傷后保護(hù)的研究也日漸增多，但目前多集中在與干細(xì)胞有關(guān)的損傷后修復(fù)方面[14-15]，且目前國(guó)內(nèi)外在此領(lǐng)域的研究目前僅局限在體外實(shí)驗(yàn)中，尚未涉及到體內(nèi)及臨床領(lǐng)域。因此我們推測(cè)，星形膠質(zhì)細(xì)胞在TBI后與通過(guò)TnTs對(duì)神經(jīng)元起著更為廣泛的保護(hù)作用?；谠撛O(shè)想，我們通過(guò)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TBI后有認(rèn)知功能障礙的患者在TBI后第1天血清TNF-α、M-sec蛋白表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組，而在傷后3天降至最低，盡管其在傷后第5天明顯回升至與無(wú)認(rèn)知功能障礙組無(wú)明顯差異，但仍無(wú)法逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元及其功能的損傷所致的認(rèn)知功能障礙。而有趣的是，在TBI后無(wú)認(rèn)知功能障礙患者血清TNF-a、Msec蛋白的表達(dá)則出現(xiàn)應(yīng)激性升高，并且在7天內(nèi)維持在一個(gè)相對(duì)較高的水平。針對(duì)于此現(xiàn)象分析，我們認(rèn)為原因?yàn)椋?）神經(jīng)元及神經(jīng)功能的損傷呈現(xiàn)不可逆性，尤其在急性期內(nèi)，如缺乏神經(jīng)元保護(hù)，則神經(jīng)元及神經(jīng)功能損傷則進(jìn)一步明顯、（2）無(wú)認(rèn)知功能障礙患者在TBI后，顱內(nèi)TNF-α等炎性代謝產(chǎn)物增多，TNF-α誘導(dǎo)M-sec表達(dá)升高，以誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞建立更多的與神經(jīng)元的TnTs通道,以保護(hù)神經(jīng)元功能。同時(shí)大量產(chǎn)生的M-sec蛋白則通過(guò)受損的腦血屏障進(jìn)入血液，導(dǎo)致血清中M-sec表達(dá)增高、（3）在有認(rèn)知功能障礙的患者中，TNF-α表達(dá)升高延遲，導(dǎo)致在急性期內(nèi)誘導(dǎo)的M-sec蛋白表達(dá)降低，星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元保護(hù)性的TnTs構(gòu)建減少，損傷保護(hù)性效應(yīng)減弱，神經(jīng)元及神經(jīng)功能損傷相對(duì)明顯。

本研究中將患者TBI后6個(gè)月的MoCA量表評(píng)分與各時(shí)間點(diǎn)的M-sec蛋白含量進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在TBI后1、3天（急性期）M-sec蛋白含量與MoCA評(píng)分正相關(guān)，而在亞急性期內(nèi)，M-sec蛋白含量則與MoCA評(píng)分無(wú)明顯相關(guān)性。這說(shuō)明TBI急性期的血清M-sec蛋白含量的檢測(cè)可能有助于預(yù)測(cè)TBI患者傷后有無(wú)認(rèn)知功能障礙發(fā)生，傷后第3天血清M-sec與MoCA相關(guān)系數(shù)R值最大，說(shuō)明傷后第3天血清M-sec與認(rèn)知功能的預(yù)后相關(guān)性最大。

表2 TBI患者血清TNF-α含量的變化（ng/mL）

表3 TBI患者血清M-s e c含量的變化（ng/mL）

表4 TBI患者血清M-s e c含量與Mo CA評(píng)分的Pe a rs on相關(guān)性分析

綜上所述，TBI患者在急性期內(nèi)的M-sec蛋白含量的降低與認(rèn)知功能障礙的發(fā)生的相關(guān)性較大。對(duì)急性期內(nèi)的M-sec蛋白含量進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，可能有助于了解星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元的直接保護(hù)及隨后的神經(jīng)功能的保護(hù)的作用、早期預(yù)測(cè)TBI后神經(jīng)元、神經(jīng)功能損傷及評(píng)估認(rèn)知功能障礙的程度及預(yù)后。不足之處在于，本研究病例數(shù)仍偏小，今后需進(jìn)一步擴(kuò)大臨床樣本，為TBI后神經(jīng)元、神經(jīng)功能的保護(hù)及認(rèn)知功能障礙的預(yù)防、治療提供潛在的靶點(diǎn)。