PHF19對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

張志迪，劉瑞芳，金在順

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，黑龍江 牡丹江 157011；2.邢臺(tái)市人民醫(yī)院病理科,河北 邢臺(tái) 054000)

肺癌是發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤之一[1]。盡管許多治療策略在早期非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)治療中顯示出療效，但NSCLC患者的5年生存率并不令人滿意[2]。鋅指蛋白19 (PHD finger protein19,PHF19)是一種多梳蛋白，控制H3K36me3和H3K27me3，PHF19通過激活多梳抑制復(fù)合體2(Polycomb repressive complex2,PRC2)和廣泛的H3K27me3結(jié)構(gòu)域的形成促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生[3-4]。此外，PHF19還通過H3K27me3沉積[5]調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲性。然而，PHF19在肺癌中的作用尚不清楚。本文主要研究PHF19對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，希望能為治療肺癌提供一種新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑人肺癌A549細(xì)胞株、293T人胚腎細(xì)胞株(無錫欣潤(rùn)生物科技有限公司)；胎牛血清(以色列BI生物科技公司)；轉(zhuǎn)染試劑(上海生工生物工程有限公司)，引物(上海生工生物工程有限公司合成)；RNA提取試劑盒(美國OMEGA公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Roche公司)；SYBR Green Tap Ready Mix(Roche公司)；PCR儀(美國BIO-RAD公司)；熒光倒置顯微鏡(德國徠卡公司)；酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇293T人胚腎細(xì)胞、肺癌A549細(xì)胞，將其放入含10% FBS的F12K培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待密度達(dá)到80%左右進(jìn)行傳代、凍存等其它實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中PHF19的mRNA表達(dá) 培養(yǎng)293T人胚腎細(xì)胞和肺癌A549細(xì)胞，將其分為293T組、A549組；按照E.Z.N.A.TM HP Total RNA Kit說明書提取以上兩組細(xì)胞總RNA；將A549細(xì)胞均勻鋪于六孔板中(每孔3×105個(gè)細(xì)胞)，待細(xì)胞均勻貼壁且密度達(dá)到70%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染，未做任何處理組為Control組、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒為pcDNA3.1組、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PHF19質(zhì)粒組為pcDNA3.1-PHF19組，吸除每孔舊培養(yǎng)基，加入Opti-MEM培養(yǎng)基后置于培養(yǎng)箱，按照LipoHigh脂質(zhì)體高效轉(zhuǎn)染試劑說明書準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染工作液(pcDNA3.1組：a:將pcDNA3.1質(zhì)粒溶于Opti-MEM培養(yǎng)基輕輕混勻，室溫靜置5 min；b:將LipoHigh溶于Opti-MEM培養(yǎng)基輕輕混勻，室溫靜置5 min；c:將上步含有LipoHigh的培養(yǎng)基加入含有pcDNA3.1質(zhì)粒的培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫靜置20 min后加入對(duì)應(yīng)孔中；pcDNA3.1-PHF19組：a:將pcDNA3.1-PHF19質(zhì)粒溶于Opti-MEM培養(yǎng)基輕輕混勻，室溫靜置5 min；b:將LipoHigh溶于Opti-MEM培養(yǎng)基輕輕混勻，室溫靜置5 min；c:將上步含有LipoHigh的培養(yǎng)基加入含有pcDNA3.1-PHF19質(zhì)粒的培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫靜置20 min后加入對(duì)應(yīng)孔中)，轉(zhuǎn)染6 h后更換常規(guī)培養(yǎng)液，24 h后提取以上三組細(xì)胞總RNA，采用NANODROP測(cè)定RNA濃度及純度，將每組細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)完成擴(kuò)增。反應(yīng)條件如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；60 ℃ 30 s；72 ℃ 50 s；進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，收集數(shù)據(jù)。以2-△△CT法來對(duì)PHF19 mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行計(jì)算。引物序列見表1、反應(yīng)體系見表2。

表1 RT-qPCR引物擴(kuò)增序列

表2 RT-qPCR反應(yīng)體系

1.2.3 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 實(shí)驗(yàn)前選用2個(gè)96孔板接種細(xì)胞，每孔1.3×104個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞均勻貼壁且密度達(dá)到70%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染，未做任何處理組為Control組、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒為pcDNA3.1組、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PHF19質(zhì)粒為pcDNA3.1-PHF19組(轉(zhuǎn)染方法同1.2.2)，將細(xì)胞分別置于37 ℃、5%CO2的孵箱中孵育24 h、48 h。然后在每孔中加入CCK-8(10 μl)，1 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度值。

1.2.4 EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 實(shí)驗(yàn)前將多聚賴氨酸細(xì)胞爬片用鑷子夾住放入24孔板中，每孔接種1×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞均勻貼壁且密度達(dá)到70%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染，未做任何處理組為Control組、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒為pcDNA3.1組、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PHF19質(zhì)粒為pcDNA3.1-PHF19組(轉(zhuǎn)染方法同1.2.2)；24 h后棄掉每孔培養(yǎng)液，加入250 μL常規(guī)培養(yǎng)液，再加入250 μL EdU工作液(提前將2 μL EdU與1 mL培養(yǎng)基混勻并于37 ℃水浴鍋中預(yù)熱)，將24孔板放入培養(yǎng)箱2 h；2 h后取出去除孔中液體加入500 μL 4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，棄去固定液每孔加入500 μL PBS沖洗2次；每孔加入200 μL通透液(含0.3% TritonX-100的PBS)，室溫孵育15 min；棄去通透液，每孔加入500 μL PBS沖洗2次；再加入Click反應(yīng)液(430 μL Click Reaction Buffer、20 μL CuSO4、1 μL Azide594和50 μL Click Additive Solution吹打混勻)室溫避光染色30 min；棄去Click反應(yīng)液每孔加入500 μL PBS沖洗2次；每孔加入100 μL 1×Hoechst染色，棄去Hoechst，每孔加入500 μL PBS沖洗2次；載玻片上滴6 μL封片液后取出爬片將其倒扣于載玻片上，熒光顯微鏡下觀察2 h增殖細(xì)胞數(shù)。EdU陽性顯示率=EdU陽性細(xì)胞數(shù)(紅色細(xì)胞)/Hoechst顯色細(xì)胞(藍(lán)色細(xì)胞)總數(shù)。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲能力 實(shí)驗(yàn)前選用六孔板接種細(xì)胞，每孔3×105個(gè)細(xì)胞，待貼壁細(xì)胞密度達(dá)到70%進(jìn)行轉(zhuǎn)染(轉(zhuǎn)染方法同1.2.2)，將其分為Control組、pcDNA3.1組、pcDNA3.1-PHF19組。Transwell小室置于24孔板中并滴入Matrigel膠(遷移實(shí)驗(yàn)不鋪膠)置于培養(yǎng)箱中4 h后取出；將每組細(xì)胞用胰酶消化、離心棄上清，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，將1×105個(gè)細(xì)胞加入200 μL無血清培養(yǎng)液于EP管中混勻后滴入上室，將含血清的培養(yǎng)基加入下室。24 h后用PBS清洗，4%多聚甲醛固定穿過的細(xì)胞后再用PBS清洗，1%結(jié)晶紫染色拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphpadPrism 8軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與比較，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，兩組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析t檢驗(yàn)，當(dāng)P值小于0.05時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PHF19在肺癌A549細(xì)胞中低表達(dá)RT-qPCR結(jié)果表明，與對(duì)照組293T人胚腎細(xì)胞相比，PHF19 mRNA在肺癌A549細(xì)胞中低表達(dá)。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

表3 RT-qPCR驗(yàn)證PHF19 mRNA在肺癌細(xì)胞和293T細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量

2.2 過表達(dá)PHF19后肺癌A549細(xì)胞中PHF19 mRNA表達(dá)增多RT-qPCR結(jié)果表明，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-PHF19組PHF19 mRNA的水平顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而Control組與pcDNA3.1組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 RT-qPCR驗(yàn)證過表達(dá)PHF19后肺癌A549各組細(xì)胞PHF19 mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.3 過表達(dá)PHF19后肺癌A549細(xì)胞增殖活性降低CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明，pcDNA3.1-PHF19作用24 h、48 h后，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-PHF19組細(xì)胞增殖活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而Control組與pcDNA3.1組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表5。

表5 過表達(dá)PHF19基因后肺癌A549各組細(xì)胞存活率

2.4 過表達(dá)PHF19使肺癌A549細(xì)胞增殖能力降低EdU結(jié)果顯示，pcDNA3.1-PHF19作用24 h，與pcDNA3.1相比，顯著抑制了pcDNA3.1-PHF19組細(xì)胞的增殖能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而Control組與pcDNA3.1組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1、表6)。

圖1 過表達(dá)PHF19基因后細(xì)胞增殖能力(×200)

表6 過表達(dá)PHF19基因后肺癌A549各組細(xì)胞增殖能力

2.5 過表達(dá)PHF19基因后肺癌A549細(xì)胞侵襲和遷移能力降低Transwell結(jié)果表明，pcDNA3.1-PHF19組與pcDNA3.1組相比侵襲能力(2A)、遷移能力(2B)顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而Control組與pcDNA3.1組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2、表7)。

表7 過表達(dá)PHF19基因后肺癌A549各組細(xì)胞侵襲、遷移能力

3 討論

人類PHF19位點(diǎn)位于染色體9q33.2，最初在一個(gè)永生化的人類成纖維細(xì)胞系[6]的一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒整合位點(diǎn)附近被識(shí)別。多梳蛋白是一類與染色體相關(guān)的基因抑制因子，參與胚胎發(fā)育、干細(xì)胞分化、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化等多種生物學(xué)過程[7]。它們通常形成兩個(gè)眾所周知的復(fù)合體PRC1和PRC2(多梳抑制復(fù)合體1和2)來修飾表觀基因沉默[8]。多梳蛋白的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致包括癌癥在內(nèi)的疾病的發(fā)生[9-10]。

PHF19在許多人類癌癥中過度表達(dá)，Zhang等[11]研究證明LINC00355通過海綿吸附miR-15a-5p來提高PHF19的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生存能力、遷移能力和侵襲能力，降低了胃癌細(xì)胞G1期的積累和凋亡，從而促進(jìn)胃癌進(jìn)展。Wang等[12]研究證明了PHF19高表達(dá)與胃癌患者預(yù)后不良有關(guān)，PHF19的下調(diào)可能通過降低AKT和ERK信號(hào)通路的活性來強(qiáng)烈抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移。此外，PHF19基因的穩(wěn)定敲除抑制了裸鼠胃癌細(xì)胞的致瘤性，提示PHF19可能是胃癌潛在的生物標(biāo)志物和藥物靶點(diǎn)。因此，我們猜測(cè)PHF19可能作為癌基因在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起到促癌作用。

為了探究PHF19基因在肺癌中是否發(fā)揮促癌作用，首先利用RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了PHF19基因在293T人胚腎細(xì)胞與肺癌A549細(xì)胞中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與293T人胚腎細(xì)胞相比，PHF19基因在肺癌細(xì)胞中低表達(dá)。然后我們構(gòu)建了PHF19過表達(dá)質(zhì)粒，通過體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，選用RT-qPCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示pcDNA3.1-PHF19組PHF19 mRNA的表達(dá)量顯著高于pcDNA3.1組，說明轉(zhuǎn)染成功；隨后通過CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了過表達(dá)PHF19基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞增殖活力的影響，轉(zhuǎn)染24h、48h后發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)PHF19基因顯著抑制了肺癌細(xì)胞的增殖能力；隨后又進(jìn)行了EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，利用熒光顯微鏡拍照，發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1-PHF19組的陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于pcDNA3.1組，說明過表達(dá)PHF19基因顯著抑制了肺癌細(xì)胞的增殖能力，接下來進(jìn)行了Transwell實(shí)驗(yàn)，與pcDNA3.1組相比，發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1-PHF19組侵襲、遷移能力明顯降低；以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果與我們之前預(yù)測(cè)結(jié)果相反，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過表達(dá)PHF19基因在肺癌A549細(xì)胞中可以起到抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

綜上所述，過表達(dá)PHF19基因抑制了肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，但PHF19與肺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不明確。有研究表明，PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的失調(diào)對(duì)腫瘤的發(fā)生有重要影響[13-15]。在此背景下，我們將會(huì)引入PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路繼續(xù)研究、以及增加體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步來研究過表達(dá)PHF19基因?qū)Ψ伟┌l(fā)生發(fā)展機(jī)制，為治療肺癌提供新的靶點(diǎn)。