張 黎,鄭龍龍,呂曉玲,白 瑞,霍乃蕊,鄭明學(xué) (山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,山西 太谷 030801)
豬圓環(huán)病毒3型(porcine circovirus 3,PCV-3)可引起一種免疫抑制疾病,常表現(xiàn)出皮炎腎病綜合征、繁殖功能障礙、呼吸系統(tǒng)疾病和多系統(tǒng)炎癥等相關(guān)的疫病,對我國部分感染豬場的疫病防控造成巨大的困難[1-2]。2015年我國研究者通過PCV-3核酸檢測發(fā)現(xiàn)部分種豬群中存在30%的PCV-3核酸陽性,常引起母豬流產(chǎn)、仔豬腹瀉和呼吸系統(tǒng)癥狀為主的臨床癥狀,在臨床生產(chǎn)中對仔豬的危害性最大,且隨著種豬及仔豬的調(diào)運(yùn),流行范圍呈不斷擴(kuò)大的趨勢[3-4]。
安全高效的疫苗是防控一切病毒性疾病的首選,但目前尚無PCV-3商品化疫苗可用。降低母豬帶毒量,減少病毒垂直傳播給仔豬的載量,可能是當(dāng)前最簡便的防控方式。PCV ORF2基因編碼病毒的衣殼蛋白(capsid protein,Cap)作為PCV唯一的結(jié)構(gòu)蛋白和主要的免疫保護(hù)性抗原,以其為靶抗原研制的PCV-2基因工程疫苗備受青睞[5]。湛洋等[6]通過對PCV-2與PCV-3 Cap結(jié)構(gòu)和抗原性的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)二者具有較大的差異,推測不存在交叉免疫保護(hù)能力。
本研究通過對比山西省某商品母豬場免疫PCV-2疫苗29個月內(nèi)的ORF2基因陽性率、豬群臨床癥狀、育肥期生產(chǎn)成績,并對PCV-3-CN-SX1-2019(NMDC序列號:NMDCN0000NPN)、PCV-3-CN-SX2-2019(NMDC序列號:NMDCN0000NPO)、PCV-3-CN-SX1-20209(NMDC序列號:NMDC-N0000NPP)、PCV-3-CN-SX2-2020(NMDC序列號:NMDCN0000NPQ)、PCV-3-CN-SX1-2021(NMDC序列號:NMDCN0000NPR)、PCV-3-CN-SX2-2021(NMDC序列號:NMDCN0000NPS)進(jìn)行部分分子生物學(xué)分析,了解其與我國部分其他省份的PCV同源性,為深入研究我國PCV-3的遺傳變異及其生物學(xué)特性以及評估母豬免疫PCV-2疫苗對仔豬PCV-3病毒學(xué)和病理學(xué)方面的交叉保護(hù)作用提供依據(jù)。
1.1 樣品來源2018年10月到2021年5月連續(xù)從山西省某500頭種豬未免疫過PCV-2疫苗的商品母豬場連續(xù)采購6批次12~17 kg保育豬,每批次1 000頭左右?;貓?周內(nèi)(10~11周齡)均出現(xiàn)不同程度的腹式呼吸、黏稠黃白色鼻涕、耳尖及臀部充血發(fā)紺、皮膚出現(xiàn)紅色丘疹、皮毛粗亂、豬群扎堆等癥狀,用藥效果不顯著,傷亡率達(dá)25.5%;經(jīng)實(shí)驗(yàn)室ORF-2基因和細(xì)胞病理學(xué)診斷確診為PCV-2、PCV-3及PRRSV共同感染。種豬群免疫PCV-2疫苗及使用藥物控制方案后,所產(chǎn)仔豬全期傷亡率從25.5%逐漸降低到8.0%;采集6批次60~70日齡15~20 kg病死豬組織樣品120份(每批次20份),并對樣品進(jìn)行100℃煮沸處理后于-20℃冷凍保存,對PCV-3 ORF2基因進(jìn)行核酸檢測與基因測序,了解仔豬群PCV-3感染情況及ORF2基因進(jìn)化規(guī)律。
1.2 試驗(yàn)材料QI Aamp DNA MiniKit(QIAN-GE),EasyTap聚合酶(TaKaRa),DL1000 DNA Marker(Biomed),其他化學(xué)試劑均從Sigma-Aldrich公司購買。
1.3 樣品處理取100 mg冰凍的淋巴結(jié)進(jìn)行充分研磨,加入1 mL PBS液反復(fù)凍融3次,10 000 r/min離心5 min,取上清液0.2 mL提取DNA。
1.4 基因擴(kuò)增參考WEN等[7]報(bào)道的方法對發(fā)病豬組織中的PCV-3 ORF2基因進(jìn)行檢測(F:5′-ATTATGGATGCTCCTCATCGTG-3′,R:5′-CA-TCTTCTCCGCAACTTCAGTC-3′)。反應(yīng)條件:94℃ 5 min;94℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 30 s,35個循環(huán);72℃延伸7 min。
1.5 基因序列測定與分析將鑒定為陽性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分析,利用NCBI BLAST、DNAStar和Mega 5.0等生物學(xué)軟件,分別對PCV-3 ORF2基因序列進(jìn)行比對和遺傳進(jìn)化分析,并與國內(nèi)外部分已知的參考序列進(jìn)行比較并繪制遺傳進(jìn)化樹,參考序列見表1。
表1 PCV-3毒株參考序列及其來源
1.6 磷酸化分析使用NetPhos 3.1 Server進(jìn)行氨基酸磷酸化預(yù)測,為制備抗原、磷酸化抗體及基因突變研究提供理論依據(jù)。
1.7 信號肽預(yù)測使用SignalP-5.0 Server對Cap蛋白氨基酸N端進(jìn)行信號肽預(yù)測,預(yù)測其促進(jìn)蛋白分泌到胞外的能力。
1.8 跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測使用TMHMM Server v.2.0進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測,根據(jù)胞外區(qū)(outside)、胞內(nèi)區(qū)(inside)、跨膜區(qū)(transmembrane)的數(shù)值預(yù)測在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的潛力,數(shù)值越大表示該氨基酸位于該區(qū)的可能性越大。
2.1 同源性分析測序結(jié)果顯示,共獲得6株長度為252 bp PCV-3 ORF2基因。利用生物學(xué)軟件DNAStar對基因序列與23條PCV序列進(jìn)行核苷酸同源性分析,結(jié)果表明,此次從死亡仔豬淋巴結(jié)內(nèi)分離出的PCV-3-CN-SX1-2019、PCV-3-CN-SX2-2019、PCV-3-CN-SX1-2020、PCV-3-CN-S1-2020、PCV-3-CN-SX1-2021及PCV-3-CN-SX2-2021毒株同源性為98.4%~99.2%;6株序列與PCV-2a(32.5%~32.9%)、HBxz-PCV2a(32.5%~32.9%)、XJ0904-PCV2a (32.5%~32.9%)同源性32.5%~32.9%;與GXHP-PCV-2b(31.2%~31.7%)、BJ0401-PCV2b(31.2%~31.7%)、SXTY-PCV-2b(30.8%~31.2%)同源性30.8%~31.7%;與XJ16-MD05-PCV2d(33.1%~33.5%)、CBNU0324-PCV-2d(32.6%~33.1%)同源性32.6%~33.5%;與HNU-AHZ-2019-PCV-4同源性33.9%~34.3%。6株序列ORF2基因與PCV-3 ORF2基因同源性為97.2%~99.6%,屬于PCV-3基因型(圖1)。
圖1 PCV-3 ORF2基因同源性分析
6株P(guān)CV-3 ORF2基因與PCV-2a、PCV-2d、PCV-3、PCV-4進(jìn)行基因進(jìn)化樹分型,結(jié)果顯示與PCV-3基因型2012—2015年分離的浙江株ZJ-HB347-20120914、ZJ-459-20130424、ZJ-592-201408-01、ZJ-526-20150703,湖南2018年分離的PCV3-YiY-1-11、PCV3-YiY-2-11及新疆2018年分離的CN-Xinjiang-AL15-2018進(jìn)化同步。與其他地域PCV-3基因型分離株P(guān)CV3-CH-Beijing-1-2016、PCV3-CN-HeNan17、YM2018-YN、CN-Xinjiang-AL15-2018、PCV3-CN-HLJ-p6-2018、FJ65、PCV3-CN-JL-JL44-2019,PCV-2a、PCV-2d、PCV-4進(jìn)化不同步(圖2)。
圖2 PCV-3 ORF2基因遺傳進(jìn)化分析
2.2 氨基酸殘基磷酸化預(yù)測結(jié)果顯示,獲得的6株P(guān)CV-3 ORF2基因均有17個磷酸化位點(diǎn),其中11個蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)位點(diǎn),3個Ⅰ型酪蛋白激酶(casein kinase Ⅰ,CKI)位點(diǎn),3個沒有特異性激酶預(yù)測結(jié)果位點(diǎn)(unsp kinase,UNSP)(表2,圖3)。
表2 Cap蛋白氨基酸殘基磷酸化預(yù)測
圖3 PCV-3 Cap蛋白氨基酸殘基磷酸化預(yù)測
2.3 信號肽預(yù)測6株P(guān)CV-3 ORF2基因編碼的Cap蛋白氨基酸均未預(yù)測到信號肽的潛在可能性,蛋白 N 末端不存在典型的信號肽結(jié)構(gòu)。
2.4 跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測6株P(guān)CV-3 ORF2基因編碼的Cap蛋白氨基酸位于胞外區(qū)的可能性最大,均未預(yù)測到跨膜結(jié)構(gòu)存在的潛在可能性(圖4),蛋白可在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。
表3 Cap蛋白信號肽預(yù)測
圖4 PCV-3 Cap蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測
2018年10月到2021年5月連續(xù)從未免疫過PCV-2疫苗的商品母豬場采購6批次10周齡保育豬,全期傷亡率(8.0%~25.5%)。本研究從病死仔豬淋巴組織中獲得6株P(guān)CV-3 ORF2基因,其與PCV-3基因型2012-2015年分離的浙江株、2018年湖南及新疆分離株進(jìn)化同步;與1999-2020年分離的北京、河南、云南、黑龍江、福建、吉林等地區(qū)PCV-3、PCV-2a、PCV-2d、PCV-4基因型毒株進(jìn)化不同步;磷酸化位點(diǎn)、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)等預(yù)測結(jié)果一致,氨基酸進(jìn)化同步。
健康豬群免疫高效商品疫苗是目前獸醫(yī)臨床上防控PCV-2的最主要手段,通過使用疫苗已經(jīng)基本控制住疫情的大流行[8-12]。檢測數(shù)據(jù)顯示,我國部分地區(qū)PCV-3感染率呈逐年增加的趨勢,但是目前鮮有報(bào)道PCV-3有安全有效的商品疫苗[13-15]。該病的防控面臨著極大的困難,需要對其進(jìn)行流行病學(xué)的持續(xù)調(diào)查和疫苗防控手段以外措施的不斷探討。
我國各地豬場在2018年后減少了疫苗的使用,部分豬場PCV-2疫苗長期不免疫或降低免疫頻次用于減少非洲豬瘟傳入的風(fēng)險(xiǎn),造成地域性或個別場區(qū)種豬群PCV常年帶毒生產(chǎn),臨床中時有斷奶仔豬出現(xiàn)皮炎腎炎綜合征的典型癥狀,給豬群造成免疫抑制性危害,同時也加大了PCV-3、PCV-4傳入的風(fēng)險(xiǎn)和臨床損失[16-18]。根據(jù)本研究數(shù)據(jù)顯示,母豬免疫PCV-2疫苗能夠給仔豬提供部分病毒學(xué)和病理學(xué)方面的保護(hù),減少PCV-3核酸的檢出率和傷亡率。