4′-氯-7-[2-(哌嗪-l-基)乙氧基]異黃酮的合成及分析方法的建立

連孟強(qiáng)　劉婭琛　郭春燕

摘要：為解決天然大豆苷元（daidzein，DAI）抗腫瘤活性不足的問題，對DAI的4′位和7位進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾。首先，以間苯二酚和對氯苯乙酸為起始原料，經(jīng)傅克?；?、增碳關(guān)環(huán)反應(yīng)制備4′-氯-7-羥基-異黃酮，將4′-氯-7-羥基異黃酮依次與二溴乙烷、哌嗪通過取代反應(yīng)制備目標(biāo)化合物4′-氯-7-[2-（哌嗪-l-基）乙氧基]異黃酮（3-（4-chlorophenyl）-7-[2-（piperazin-l-yl）ethoxy]-4H-chromen-4-one，CPEO-43），采用柱層析方法實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物與雜質(zhì)的分離。其次，通過FT-IR，MS，1H-NMR及13C-NMR確證結(jié)構(gòu)。再次，通過MTT實(shí)驗(yàn)評價(jià)化合物CPEO-43對A549肺癌細(xì)胞和HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用。最后，建立CPEO-43血漿樣品的超高效液相色譜（ultra high performance liquid chromatography，UPLC）分析方法。結(jié)果表明，通過FT-IR，MS，1H-NMR及 C-NMR確證了所合成的化合物與目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)一致。10 μmol/L DAI對A549肺癌和HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制率分別為4.421%和5.601%;而相同濃度的CPEO-43對A549肺癌細(xì)胞和HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞抑制率分別為58.43%和72.03%，IC值分別為2.51 μmol/L和0.87 μmol/L。建立的UPLC方法無內(nèi)源性物質(zhì)干擾，在0.5～10 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，日內(nèi)精密度及日間精密度均小于10%，化合物CPEO-43的低、中、高濃度的血漿樣品的回收率為92.98%～100.10%?；衔顲PEO-43的抗腫瘤活性顯著高于DAI，UPLC分析方法能簡便快速地測定血漿中CPEO-43的含量，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可為提高DAI的抗腫瘤效果提供理論依據(jù)，為藥物臨床檢測提供方法基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：藥學(xué)其他學(xué)科;大豆苷元;大豆異黃酮衍生物;抗腫瘤活性;超高效液相色譜;核磁共振;質(zhì)譜

中圖分類號：R917文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.7535/hbkd.2022yx03010

Synthetic and analytical method establishment of 3-（4-chlorophenyl）-7-[2-（piperazin-l-yl）ethoxy]-4H-chromen-4-one

LIAN Mengqiang LIU Yachen GUO Chunyan

（1.School of Pharmacy，Hebei North University，Zhangjiakou，Hebei 075000，China;2.School of Life Science，Hebei Normal University，Shijiazhuang，Hebei 050024，China）

Abstract：In order to solve the problem of insufficient antitumor activity of natural daidzein （DAI），the 4 'and 7 positions of DAI were modified.Firstly，3-（4-chlorophenyl）-7-hydroxy-4H-chromen-4-one was prepared from resorcinol and p-chlorophenylacetic acid by friedel crafts acylation，carbonization and ring closing reaction.The 3-（4-chlorophenyl）-7-[2-（piperazin-l-yl）ethoxy]-4H-chrome-4-one （CPEO-43） was synthesized by substitution reaction of 3-（4-Chlorophenyl）-7-hydroxy-4H-chromen-4-one with dibromoethane and piperazine.Column chromatography was used to separate the target product from impurities.Secondly，F(xiàn)T-IR，H-NMR，C-NMR and MS were used to identify the compounds.Thirdly，MTT assay was used to detect the inhibitory effect of compound CPEO-43 on A549 lung cancer cells and HCT116 colon cancer cells.Finally，an ultra high performance liquid chromatography （UPLC） method was established for the analysis of CPEO-43 plasma samples.The results show that the structure of the synthesized compound is consistent with that of the target compound confirmed by FT-IR，MS，1H-NMR and 13C-NMR.The inhibitory rates of DAI （10 μmol/L） on A549 lung cancer and HCT116 colon cancer cells are 4.421% and 5.601%，respectively.The inhibitory rates of the same concentration of CPEO-43 on A549 lung cancer cells and HCT116 colon cancer cells are 58.43% and 72.03%，respectively.The IC values of CPEO-43 are 2.51 μmol/L and 0.87 μmol/L，respectively.The established UPLC method has no interference from endogenous substances.The linear relationship is good in the range of 0.5～10 μg/mL.The intra-day precision and inter-day precision are less than 10%.The average recoveries of low，medium and high plasma samples of compound CPEO-43 are in the range of 92.98%～100.1%.The antitumor activity of compound CPEO-43 is significantly higher than that of DAI.The established UPLC assay method can easily and rapidly determine the content of CPEO-43 in plasma，and the results are accurate and reliable，provide a theoretical basis for improving the antitumor activity of DAI，and provide method basis for drug clinical testing.

Keywords：

other disciplines of pharmacy;daidzein;soybean isoflavone derivatives;antitumor activity;ultra high performance liquid chromatography;nuclear magnetic resonance;mass spectrum

癌癥是全球第2大死亡原因，2018年約有960萬人死于癌癥，占死亡人數(shù)的1/6。肺癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌、胃癌和肝癌是男性最常見的癌癥類型，而乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、宮頸癌和甲狀腺癌在女性中最為常見。肺癌和結(jié)腸直腸癌在男性和女性中都是最常見的癌癥類型。研究表明，飲食富含異黃酮的食物可以降低許多癌癥的發(fā)病率和死亡率[1-9]。人體中異黃酮的主要飲食來源是大豆和豆制品，大豆異黃酮的主要結(jié)構(gòu)是以3-苯并吡喃酮為母核的化合物群[10-11]，分為游離型的苷元和結(jié)合型的糖苷2種[12-13]。近年來，游離型苷元大豆苷元（daidzein，DAI）的生物活性，特別是抗癌活性引起了人們的極大關(guān)注[14-17]。DAI對A549肺癌細(xì)胞半數(shù)致死量（IC）為32.18 μmol/L[17]。大豆異黃酮在大豆中的含量為0.1%～0.5%，而游離型苷元僅占大豆異黃酮含量的5%～10%，僅僅依靠飲食富含異黃酮的食物抑制癌細(xì)胞的生長是不現(xiàn)實(shí)的。

基于DAI抗腫瘤活性不足的缺點(diǎn)，本研究旨在對DAI進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，以提高其抗腫瘤活性。大豆異黃酮活性具有結(jié)構(gòu)依賴性[11]，從理論上分析，DAI的4′位和7位引入活性基團(tuán)可以增加活性。因此，在4′位引入鹵族元素Cl，在7位引入哌嗪基團(tuán)，合成大豆異黃酮衍生物4′-氯-7-[2-（哌嗪-l-基）乙氧基]異黃酮（3-（4-chlorophenyl）-7-[2-（piperazin-l-yl）ethoxy]-4H-chromen-4-one，CPEO-43），通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究CPEO-43抗腫瘤活性，并建立CPEO-43的超高效液相色譜（ultra high performance liquid chromatography，UPLC）分析方法。

1儀器與材料

1.1主要儀器

核磁共振儀WIPM-NMR-400（中科牛津波譜技術(shù)有限公司）;酶標(biāo)儀SpectraMax25 （Molecular Devices）;電子分析天平ME235P（德國Sartorius）;AB Sciex QTRAP 4500液質(zhì)聯(lián)用儀（LC-MS，日本島津）;紫外可見分光光度計(jì)UV9100（北京萊伯泰科儀器股份有限公司）;傅里葉紅外光譜儀（德國Bruker）;ACQUITY UPLC色譜儀（美國Waters）。

1.2材料

A549肺癌細(xì)胞和HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞，河北北方學(xué)院藥學(xué)系實(shí)驗(yàn)室保存。

SD雄性大鼠（250 g），購自北京華阜康，飼養(yǎng)溫度為（25±2） ℃，濕度為（50±2）% 。

三氟化硼乙醚（批號 RH328089）、五氯化磷（批號 DX6RRR1A PCl），購自安耐吉;間苯二酚（批號 F2002009）、二溴乙烷（批號 F1808053）、4-氯苯乙酸（批號 B1826138），購自阿拉丁;哌嗪（批號 LMB0S39）、碘化鈉（批號 LDB0S31），購自百靈威;碳酸鉀、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、乙酸乙酯、石油醚等常規(guī)有機(jī)試劑，購自天津永大;DMEM 高糖培養(yǎng)基，購自Gibco公司;胎牛血清（FBS），購自ZATA公司;DAI，購自上海源葉生物科技有限公司;MTT試劑盒，購自Solarbio公司。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1化合物CPEO-43的合成與表征

2.1.1合成方法

以天然DAI結(jié)構(gòu)（如圖1所示）為母核，對4′和7位進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，增加DAI的抗腫瘤活性。4′位引入Cl能夠保證后續(xù)取代反應(yīng)僅發(fā)生在7位，防止副反應(yīng)發(fā)生，提高產(chǎn)率。另外，哌嗪是含氮雜環(huán)體系中的重要一員，環(huán)上的 N 原子可以參與生物體中氫鍵的形成，增加藥物與受體的親和力和選擇性[18]，因此在7位引入哌嗪增加了DAI的生物活性。合成過程中并未以DAI為起始原料，因?yàn)橹苯淤徺IDAI成本較高，若從植物中提取，過程較為繁瑣且收率較低[19-20]，且以DAI為原料進(jìn)行取代反應(yīng)時(shí)，4′位及7位均可能發(fā)生取代反應(yīng)，難以制備單一的4′-氯-7-羥基異黃酮（圖2中b），進(jìn)而影響后續(xù)中間產(chǎn)物4′-氯-7-溴乙氧基異黃酮和目標(biāo)化合物CPEO-43的合成。因此，參照文獻(xiàn)[21-22]設(shè)計(jì)了CPEO-43合成方案，如圖2所示。

CPEO-43的合成：對氯苯乙酸在路易斯酸三氟化硼催化下形成C，具備較強(qiáng)的吸電子能力，與富電子基團(tuán)間苯二酚發(fā)生傅克?；磻?yīng)，生成脫氧安息香（圖2中a）。化合物a反應(yīng)溶液在DMF/PCl條件下生成中間產(chǎn)物4′-氯-7-羥基異黃酮（圖2中b）?；衔颾的酚羥基在堿性條件下生成氧負(fù)離子，溴代烷烴與氧負(fù)離子發(fā)生親電取代反應(yīng)，生成4′-氯-7-溴乙氧基異黃酮（圖2中c）。再利用碘化鈉作為催化劑，與化合物c反應(yīng)，生成反應(yīng)活性更強(qiáng)的碘取代物，堿性條件生成C，與哌嗪發(fā)生親核取代反應(yīng)，生成CPEO-43。使用柱層析方法，采用甲醇-二氯甲烷作為洗脫溶劑梯度洗脫，純化化合物CPEO-43。具體過程如下。

4′-氯-7-羥基異黃酮的合成：將間苯二酚（10 mmol）和對氯苯乙酸（11 mmol）溶于三氟化硼乙醚（80 mmol）中，于85 ℃條件下磁力攪拌4 h，冷卻，緩慢加入DMF（10 mL），生成脫氧安息香（圖2中a）。向化合物a反應(yīng)溶液中加入DMF（20 mL）/PCl（15 mmol）混合溶液，室溫?cái)嚢? h，倒入沸騰的0.1 mol/mL HCl水溶液中，冷卻、過濾、干燥得粗產(chǎn)物4′-氯-7-羥基異黃酮，再經(jīng)乙醇重結(jié)晶純化。

4′-氯-7-溴乙氧基異黃酮的合成：將化合物b（10 mmol）、碳酸鉀（25 mmol）、二溴乙烷（52 mmol）加到DMF（50 mL）中。氮?dú)鈼l件下，80 ℃反應(yīng)3 h，冷卻后倒入冰水中，過濾、干燥得到粗產(chǎn)物4′-氯-7-溴乙氧基異黃酮，再經(jīng)乙醇重結(jié)晶純化。

CPEO-43的合成：將化合物c（10 mmol）、碘化鈉（10 mmol）、哌嗪（12 mmol）、碳酸鉀（35 mmol）加到DMF（100 mL）中，氮?dú)鈼l件下，60 ℃反應(yīng)3 h，冷卻后倒入冰水中，過濾、干燥得到化合物CPEO-43粗產(chǎn)物，再經(jīng)二氯甲烷-甲醇梯度洗脫純化（9∶1～3∶1）。

2.1.2化合物CPEO-43結(jié)構(gòu)鑒定

通過FT-IR，MS，1H- NMR及C-NMR鑒定合成化合物CPEO-43的結(jié)構(gòu)。取適量CPEO-43，加入溴化鉀研磨后壓片，在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)測定紅外吸收光譜。稱取適量CPEO-43，加入DMSO氘代試劑，進(jìn)行核磁共振氫譜及碳譜檢測。

配制質(zhì)量濃度約為5 ng/mL的 CPEO-43甲醇溶液，采用電噴霧離子源（ESI），以多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）進(jìn)行正離子（H）檢測;噴霧電壓為3 000 V;噴霧溫度為500 ℃，m/z385.0→113.1（CPEO-43）進(jìn)行質(zhì)譜檢測，觀察樣品溶液在m/z為385.0的離子片段下的吸收峰。

2.2化合物CPEO-43抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)

2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

A549肺癌細(xì)胞和HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞用含10% FBS及1% 青霉素-鏈霉素（penicillin-streptomycin solution，PS）的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃，5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d用胰酶消化液消化傳代。

2.2.2MTT法檢測細(xì)胞活性

實(shí)驗(yàn)分為溶劑組（以DMSO為溶劑）、陽性藥對照組（以DAI為陽性對照藥）、CPEO-43實(shí)驗(yàn)組和空白組（不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)基）。取對數(shù)生長期的A549和HCT116細(xì)胞計(jì)數(shù)后均勻鋪于96孔板，每孔8 000細(xì)胞，在37 ℃，5% CO細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，按照上述分組給藥處理。

除空白組不含細(xì)胞外，其余每組加藥之前含有相同數(shù)量的細(xì)胞，溶劑組、陽性藥對照組、CPEO-43實(shí)驗(yàn)組中含有相同濃度的DMSO，終濃度為0.1%;陽性藥對照組DAI終濃度為10 μmol/L;CPEO-43實(shí)驗(yàn)組設(shè)置8個(gè)濃度，CPEO-43終濃度分別為0.01，0.03，0.25，0.5，1，2，4，10 μmol/L。細(xì)胞給藥后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，吸棄上清，加入90 μL新鮮培養(yǎng)液，加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清，加入110 μL Formazan溶液，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀在波長490 nm處測定光密度值（optical density，OD），根據(jù)公式計(jì)算抑制率。抑制率%=（OD-OD）/（OD-OD）×100%。

2.3化合物CPEO-43的UPLC方法的建立

2.3.1色譜條件

ZORBAX Eclipse Plus C（4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱;流動(dòng)相為甲醇（A）-0.025%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液（B），流速：1 mL/min，柱溫：35 ℃，進(jìn)樣量：5 μL。洗脫條件：0～2.5 min，46% A;2.5～8.0 min，46%～52.3% A;8.0～8.5 min，52.3%～59.5% A;8.5～12.0 min，59.5%～73% A;12.0～13.0 min，73%～46% A;13.0～15.0 min，46% A。檢測波長：254 nm。

2.3.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取10 mg 化合物CPEO-43，加甲醇溶解，制成1 mg/mL的CPEO-43標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20 ℃下保存?zhèn)溆?。臨用時(shí)，用起始流動(dòng)相稀釋至所需濃度即可。

2.3.3血樣采集

大鼠摘眼球取血，將血液采集至抗凝離心管中，搖勻，4 000 r/min離心10 min。

2.3.4血漿樣品預(yù)處理

取血漿樣品100 μL，置于離心管中，再加入900 μL甲醇，渦旋3 min，充分沉淀蛋白，再于4 ℃下以15 000 r/min離心10 min，取上清液，氮?dú)鈼l件下吹干，再用100 μL 50%甲醇水復(fù)溶，15 000 r/min離心10 min，取上清液，微孔濾膜過濾，待測。

2.3.5方法學(xué)考察

1）專屬性考察

分別取大鼠空白血漿和含CPEO-43藥物血漿，按“2.3.4”所述方法處理樣品，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，考察血漿中內(nèi)源性物質(zhì)是否會(huì)干擾被測物質(zhì)CPEO-43的測定。

2） 線性關(guān)系與定量限考察

取空白血漿100 μL，加入不同濃度的化合物CPEO-43，按“2.3.4”所述方法處理，制備CPEO-43標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按照上述色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。以信噪比10對應(yīng)的CPEO-43濃度確定方法定量限。

3）準(zhǔn)確度和精密度考察

參照《中華人民共和國藥典》2020版第4部生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則（以下簡稱指導(dǎo)原則）[23]，配制定量下限0.5 μg/mL及低（1.00 μg/mL）、中（4.00 μg/mL）和高濃度（7.50 μg/mL）質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度5個(gè)樣本。按照上述色譜條件進(jìn)樣，連續(xù)測定3 d。準(zhǔn)確度以測定值與質(zhì)控樣品標(biāo)示值的差值表示，差值控制在±15%之內(nèi)，定量下限準(zhǔn)確度應(yīng)在標(biāo)示值的±20%范圍內(nèi)。同一批內(nèi)低、中、高濃度的日內(nèi)精密度的標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值和不同批的低、中、高濃度的日間精密度的RSD值均不得超過15%，定量下限的RSD值均不得超過20%。

4）提取回收率實(shí)驗(yàn)考察

取空白血漿100 μL，加入適量的化合物CPEO-43，按“2.3.4”項(xiàng)方法處理，制成終濃度分別為0.5，4.0，10.0 μg/mL的CPEO-43血漿樣品，每個(gè)濃度平行制備5份，進(jìn)樣分析，記錄峰面積A1;另取空白血漿，按“2.3.4”項(xiàng)方法處理。準(zhǔn)確移取取上清液，加入適量化合物CPEO-43，使終濃度分別為0.5，4.0，10.0 μg/mL，旋渦混勻，氮?dú)獯蹈?。然后，加?00 μL 起始流動(dòng)相復(fù)溶，微孔濾膜過濾，進(jìn)樣分析，記錄峰面積A2。以A1與A2的比值進(jìn)行回收率計(jì)算。

5）穩(wěn)定性考察

參照3）方法制備定量下限0.5 μg/mL及低（1.00 μg/mL）、中（4.00 μg/mL）和高濃度（7.50 μg/mL）質(zhì)控樣品，分別于室溫下放置8 h，4 ℃保存3 d和-20 ℃保存10 d，在上述色譜條件下檢測，考察樣品的穩(wěn)定性。含量與初始值的偏差不得超過±15%。

2.4統(tǒng)計(jì)分析方法

用GraphPad Prism v8.0.2.263，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果與分析

3.1化合物CPEO-43的合成與表征

目標(biāo)化合物的合成分為3步：1）間苯二酚和對氯苯乙酸在三氟化硼乙醚作用下生成脫氧安息香（a）;2）a溶液在DMF/PCl催化下完成增碳反應(yīng)生成中間產(chǎn)物b，產(chǎn)率為50%;3）化合物b在堿性條件下完成烷烴取代反應(yīng)得到中間體c，產(chǎn)率為61%?；衔颿與哌嗪反應(yīng)得到含有哌嗪和異黃酮結(jié)構(gòu)的化合物CPEO-43，產(chǎn)率為54%，總產(chǎn)率為 16.5%

CPEO-43制備過程中，中間產(chǎn)物b和c利用乙醇進(jìn)行重結(jié)晶能夠有效提純，方法簡單。但終產(chǎn)物CPEO-43通過乙醇重結(jié)晶后，產(chǎn)物混有雜質(zhì)，結(jié)合終產(chǎn)物與其他雜質(zhì)極性大小的差異，選擇甲醇-二氯甲烷作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，可實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物與雜質(zhì)的有效分離。

利用FT-IR鑒定化合物CPEO-43的官能團(tuán)。如圖3所示，化合物CPEO-43主要吸收峰如下：3 424 cm為NH的伸縮振動(dòng)，1 627 cm為C=O的伸縮振動(dòng)，1 335 cm為C-N伸縮振動(dòng)，1 257 cm為=C-O-C伸縮振動(dòng)，1 371 cm和1 201 cm為苯環(huán)的骨架振動(dòng)產(chǎn)生的吸收峰，1 044，954，882，826 cm為苯環(huán)上的=C-H的彎曲振動(dòng)所產(chǎn)生。

MS，H-NMR及C-NMR對化合物CPEO-43結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果為：MS （CIHONCl）：385 （M+H）+。1H-NMR（400 MHz，DMSO） δ 8.51（s，1H），8.01（d，J= 8.8 Hz，1H），7.62（d，J?= 8.0 Hz，2H），7.49（d，J?= 7.9 Hz，2H），7.20（s，1H），7.09（d，J?= 8.9 Hz，1H），4.22（s，2H），2.68（s，6H），2.40（s，4H），1.21（s，1H）。13C-NMR（101 MHz，DMSO）δ 154.90（C-2），122.95（C-3），174.67（C-4），127.35（C-5），115.76（C-6），163.53（C-7），101.64（C-8），157.87（C-9），117.90（C-10），131.30（C-1′），131.09（C-2′，6′），128.61（C-3′，5′），133.01（C-4′），66.82（C-1′′），54.81（C-2′′）， 57.54（C-2′′′，6′′′）， 45.90（C-3′′′，5′′′）。

3.2化合物CPEO-43對癌細(xì)胞存活率的影響

如圖4和圖5所示，與溶劑對照組相比，DAI對A549肺癌細(xì)胞和HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞具有抑制作用，然而抑制率較低，結(jié)構(gòu)優(yōu)化后，CPEO-43對癌細(xì)胞的抑制作用顯著增加。

由圖4和圖5可知，10 μmol/L DAI對A549肺癌和HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制率分別為4.421%和5.601%;而相同濃度新合成的化合物CPEO-43對A549肺癌細(xì)胞和HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞抑制率分別為58.43%和72.03%，該濃度下化合物CPEO-43對A549肺癌細(xì)胞和HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞抑制率分別是DAI的13.2倍和12.9倍。表明化合物CPEO-43能夠顯著抑制A549肺癌細(xì)胞和HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞生長，IC值分別為2.51 μmol/L和0.87 μmol/L。

3.3化合物CPEO-43色譜分析專屬性結(jié)果

如圖6和圖7所示，化合物CPEO-43的保留時(shí)間為8.2 min，峰形良好，無血漿雜質(zhì)干擾。

3.4線性關(guān)系與定量限

以質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸： y=21 403x+356.08（R=0.999 9）。線性范圍：0.5～10 μg/mL。利用信號噪音比值法確定定量限，信噪比為10時(shí)樣品質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL。

3.5準(zhǔn)確度和精密度

本方法的CPEO-43定量下限、低、中、高血漿樣品的日內(nèi)精密度和日間精密度RSD值分別為8.19%，3.27%，0.53%，0.53%和8.91%，5.90%，4.22%，2.35%，均小于《中華人民共和國藥典》指導(dǎo)原則的15%。實(shí)測值與質(zhì)控樣本標(biāo)示值的差值亦符合指導(dǎo)原則方法驗(yàn)證的要求。結(jié)果表明，本方法的準(zhǔn)確度和精密度能夠滿足CPEO-43的分析要求。

3.6回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

如表1所示，低、中、高3種質(zhì)控濃度的樣品的提取回收率在92%～100%，RSD值均小于5%，回收率滿足分析要求。

3.7穩(wěn)定性

將化合物CPEO-43低、中、高3個(gè)濃度質(zhì)控樣品于室溫下放置8 h，4 ℃保存3 d和-20 ℃保存10 d后實(shí)驗(yàn)測得的各個(gè)濃度的含量與初始值相差均不超過10%，符合指導(dǎo)原則不超過±15%的要求，這表明該方法制備的樣品在上述條件下是穩(wěn)定的。

4結(jié)語

準(zhǔn)確測定生物基質(zhì)（如全血、血清、血漿、尿）中的藥物濃度，對于藥物和制劑的研發(fā)非常重要。本研究基于CPEO-43良好的抗腫瘤效果，建立了CPEO-43血漿樣本的UPLC-UV分析方法。

甲醇和乙腈是液相色譜最常用的流動(dòng)相試劑，甲酸、乙酸、三氟乙酸常作為調(diào)節(jié)劑來改善色譜峰形。選擇甲醇-水-甲酸進(jìn)行分析嘗試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相中含有甲酸后，能夠降低色譜流出曲線的標(biāo)準(zhǔn)差，色譜結(jié)果更好。本研究考察了不同濃度甲酸對色譜峰形和保留時(shí)間的影響。甲酸體積比分別為0.1%，0.05%，0.025%時(shí)，CPEO-43 的峰形無明顯變化，隨著甲酸酸度的降低，保留時(shí)間由7.8 min延長到8.2 min?？紤]酸度對色譜柱壽命的影響，因此選擇0.025%的甲酸作為流動(dòng)相進(jìn)行色譜分析。

本研究所建立的UPLC分析方法在0.5～10.0 μg/mL線性關(guān)系良好，其準(zhǔn)確度、精密度和穩(wěn)定性均能滿足要求。方法的定量限為0.5 μg/mL，CPEO-43能抑制A549肺癌細(xì)胞和HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞生長，IC值分別為2.51 μmol/L和0.87 μmol/L。因此該分析方法的定量下限值能滿足定量分析有效抗腫瘤藥物濃度，可為藥物臨床檢測提供方法基礎(chǔ)。

本研究針對DAI抗腫瘤活性低的缺陷，在DAI的4′位引入鹵族元素Cl，在7位引入哌嗪基團(tuán)，進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，成功全合成了CPEO-43，并顯著提高了DAI抗腫瘤活性。但是，合成CPEO-43的工藝條件仍有待進(jìn)一步優(yōu)化，CPEO-43的抗腫瘤機(jī)制有待更為深入的研究。

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