傳統(tǒng)發(fā)酵酸凝硬質(zhì)奶酪中乳酸菌的分離鑒定及其體外益生特性

伊力夏提·艾熱提，李 偉，徐楊林，嚴宏孟，戴志偉，周建中

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院，烏魯木齊 830052；2. 南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，南京 210095)

0 引 言

【研究意義】新疆伊犁地區(qū)特色乳制品種類繁多，包含著豐富的微生物資源[1-3]。通過傳統(tǒng)發(fā)酵方式及自然選擇的良好微生物制作而成[4]，發(fā)酵過程包含自然發(fā)酵、晾干和成型[5]。新疆奶酪大多屬于酸凝奶酪，依靠乳酸菌代謝產(chǎn)生的酸達到酪蛋白等電點從而成凝制成，研究傳統(tǒng)發(fā)酵酸凝硬質(zhì)奶酪中乳酸菌的分離鑒定及其體外益生特性，對篩選出優(yōu)良益生菌有實際意義?！厩叭搜芯窟M展】新疆奶酪在含有豐富的微生物資源的同時對菌種的產(chǎn)酸特性有了自然地選擇[6]，菌種高產(chǎn)酸的特性使得奶酪的pH降低[7-8]，配合硬質(zhì)奶酪較低的水分活度使得新疆奶酪在有獨特風味口感的同時抑制有害微生物的生長，便于保存運輸?！颈狙芯壳腥朦c】奶疙瘩含有牛乳中大部分的營養(yǎng)物質(zhì)，富含磷酸鹽類、鈣及維生素類[9]，食用奶酪不僅可以補充機體所需的微量元素還可以降低口腔pH值，使口腔酸性降低，從而避免了很多口腔疾病問題[10-11]，目前鑒定乳酸菌的方法居多[12]，其中最廣泛引用的是16S rRNA和16S rDNA同源序列分析的方法[13]。目前，研究人員對新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的研究大多停留在菌株的鑒定方面，對乳酸菌的分離鑒定及其體外益生特性的研究較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從新疆伊犁地區(qū)昭蘇縣傳統(tǒng)自然發(fā)酵制作的奶酪中分離乳酸菌，采用生理生化試驗選取符合條件的乳酸菌，采用16S rDNA測序法檢測其遺傳信息，并對鑒定菌株進行體外益生特性試驗，篩選出最優(yōu)益生特性的乳酸菌，為體內(nèi)驗證及發(fā)酵益生酸奶產(chǎn)品提供發(fā)酵菌株。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 奶酪

從伊犁昭蘇民間不同作坊及農(nóng)家采購的傳統(tǒng)自然發(fā)酵奶酪。

主要試劑為MRS固體、肉湯培養(yǎng)基，杭州微生物試劑有限公司；引物、2×TSINGKE Master Mix、TSINGKE高純度低電滲瓊脂糖、DNA 凝膠回收試劑盒、DL2000 Marker，北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

UV-8000紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；XSZ-4GA顯微鏡，上海光學儀器廠；3730XL測序儀、2720 thermal cycler PCR儀，Applied Biosystems 公司；Legend Micro17 離心機，Thermo 公司；JY300C電泳儀、JYDF(定制)電泳槽、JY04S-3C型凝膠成像儀，北京君意東方電泳設備有限公司；L550板式離心機，湖南cence湘儀動力測試儀器有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 乳酸菌篩選鑒定

1.2.1.1 乳酸菌分離與純化

按照GB 4789.35-2016乳酸菌檢驗[14]方法，對樣品進行梯度稀釋，并涂布在MRS培養(yǎng)基上，于37℃恒溫厭氧培養(yǎng)48 h。

培養(yǎng)48 h后分別挑取不同菌落特征菌落，再次劃線接于MRS培養(yǎng)基上，于37℃恒溫厭氧培養(yǎng)48 h[15]，重復此操作直到固體平板上菌落形態(tài)一致。

1.2.1.2 菌株鑒定與保存

觀察疑似乳酸菌菌株的菌落特征，對其進行革蘭氏染色鏡檢及過氧化氫酶實驗，選擇革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性的菌株進行斜面和甘油管保存(菌液和50%甘油按1∶1 的體積比接入甘油管內(nèi)并置于實驗室-40℃冰箱)，并對其進行生理生化鑒定[16]。

1.2.1.3 各菌株生長性能

將乳酸菌株活化3代后，按3%的接種量接入MRS肉湯培養(yǎng)基中，每隔2 h測定菌液的OD600值，以空白培養(yǎng)基為對照重復3次[17]。

1.2.1.4 各菌株產(chǎn)酸能力

參考羅強等[18]方法，將乳酸菌株活化3代，按照3%的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基(pH 6.50)中，每隔2 h測定發(fā)酵液的pH值，每組進行3個平行。

1.2.1.5 各菌株產(chǎn)酸率

參照GB/T5413.34-2010[19]和緱敬軒[20]、龔加路[21]等的方法，將菌株以3%的接種量接入MRS肉湯培養(yǎng)基中，每隔2 h測滴定酸度，每組滴定重復3個平行。計算產(chǎn)酸率：

(1)

式中，c：NaOH的濃度(moL/L)；v：滴定所消耗的NaOH溶液的體積(mL)；v0：樣品的體積(mL)。0.09：總酸轉(zhuǎn)換系數(shù)。

1.2.1.6 各菌株分子生物學鑒定

乳酸菌16S rDNA鑒定以M.F.P.Domingos-Lopes等的方法為參考[22]進行擴增，將篩選出來的菌株用DNA提取試劑盒(TSP101試劑盒，北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)提取DNA，用細菌16S rDNA基因的通用PCR擴增引物27 F(AGTTTGATCMTGGCTCAG)和1492 R(GGTTACCTTGTTACGACTT)進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳(150 V、100 mA、20 min)檢測后，送至北京擎科生物科技有限公司昆明分公司(昆明)進行測序鑒定。將所獲基因序列在NCBI gene bank上進行Blast比對，選擇相似度最高菌株的序列，運用MEGA X軟件構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育進化樹進行分析。

1.2.2 菌株體外益生特性

1.2.2.1 菌株耐膽鹽能力

取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的乳酸菌新鮮菌液，然后在含有0.1%、0.3%、0.5% 和1%(1%=0.01 g/mL)膽鹽的MRS肉湯中培養(yǎng)24 h后測其OD600值，按公式2計算其耐受率[23]：

(2)

1.2.2.2 菌株耐酸能力

用1 moL/L HCl、1 moL/L NaOH調(diào)節(jié)MRS液體培養(yǎng)基的pH值分別為2、4、6、8將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌液以2%的接種量，接種于不同pH值的MRS液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱24 h，測定OD600值，每組3個平行試驗，按公式3計算其耐受率[24]。

(3)

1.2.2.3 菌株耐模擬人工胃液能力

人工胃液：取稀鹽酸(1 moL/L)16.4 mL，加約800 mL蒸餾水與10 g胃蛋白酶，充分混勻溶解，加水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH至2.5，用0.22 μm無菌微孔濾膜過濾除菌[25]。

分別取1.0 mL菌懸液與9.0 mL人工胃液混合后，于37℃培養(yǎng)，分別在0、2、4 h取樣，挑取菌落數(shù)合適的平板(30-300CFU)，采用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)，同時作平行實驗。計算存活率[26]。

(4)

式中，N0：0 h的活菌數(shù)(空白培養(yǎng)基)；Nt：不同時間段的活菌數(shù)。

1.2.3 表面特性測定

1.2.3.1 菌株表面疏水能力

將活化好的菌株接種于MRS肉湯培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)16～18 h，菌液以5 000 g/min離心15 min，并在磷酸鹽緩沖液中懸浮2次。記錄懸浮液在600 nm處的初級吸光度后，將3 mL菌株懸液轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中，加入1 mL的二甲苯渦旋2 min，室溫下靜置15 min，以便均相分離。去除上層有機相，測定下層水相的OD600值[27]。計算疏水性[28]。

(5)

式中，A0：試劑萃取前水相在600 nm波長處的吸光度；At：試劑萃取后水相在600 nm波長處的吸光度。

1.2.3.2 菌株自凝集能力

將供試菌株菌懸液的濃度調(diào)整為在600 nm波長處OD值約為1.0，分別取4 mL置于10 mL的試管中，在室溫條件下靜置待其分層，分別靜置1、3、5 h后吸取1 mL上層懸液測OD600值，分別記作OD1、OD3、OD5，每個實驗做3個平行。計算自凝集率[29]。

(6)

式中：A0：0 h時的水相在600 nm波長處吸光度；At：th時的水相在600 nm波長處吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 各菌株菌落及細胞形態(tài)比較

研究表明，分離得到的36株菌株中有6株菌滿足革蘭氏陽性且過氧化氫陰性的條件，對這些菌落再次進行分離純化。挑取單個菌落，并在MRS固體培養(yǎng)基中劃線傳代，最終獲得在固體平板和鏡檢下形態(tài)一致的菌落。這6個菌株在固體培養(yǎng)基上的形態(tài)表現(xiàn)出一定的差異。圖1，表1

圖1 各菌株菌落及細胞形態(tài)(油鏡×1 000)Fig.1 Colony and cell morphology of strains

表1 菌株菌落特征及菌體形態(tài)Table 1 Colonialand morphological characteristics of the strains

該6株菌種均為革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性。在葡萄糖發(fā)酵實驗當中均為陽性，能充分利用葡萄糖進行發(fā)酵。硫化氫實驗當中該6株菌種均表現(xiàn)出陰性，符合初步鑒定為乳酸菌種的條件。表2

表2 菌株生理生化鑒定Table 2 Physiological and biochemical identification test results of the strains

2.2 菌株生長性能

研究表明，6株菌種的生長趨勢均有所差異，其中菌株E11的生長速度最快，從0到10 h迅速繁殖，在此過程中其OD600值從0.150升到2.003，無明顯延滯期，從10 h開始進入穩(wěn)定期，生長速率變慢逐漸達到飽和狀態(tài)。菌株B8、B34和B25的生長趨勢基本相同，到達穩(wěn)定期的時間短，分別在8至10 h基本進入穩(wěn)定期達到飽和。菌株A75的生長趨勢比較穩(wěn)定，從0到28 h基本都在生長的狀態(tài)，沒有延滯期，從28 h開始基本進入穩(wěn)定期。菌株A4從0到16 h的生長趨勢幾乎不變，從16 h開始生長速度加快。菌株E11、B8、B34和B25的最佳收獲時間在10至20 h，A75的生長一直保持勻速生長，到20 h開始緩慢，一直到24 h基本穩(wěn)定，其最佳收獲期在20至24 h。菌株A4的生長趨勢比較緩慢，一直到24 h開始生長加快，株菌的最佳收獲期在24 h以后。圖2

圖2 各菌株40 h生長曲線Fig.2 Growth curve of strains within 40 h

2.3 菌株酸度

2.3.1 菌株產(chǎn)酸能力

研究表明，該6株菌種在MRS液體培養(yǎng)基當中的產(chǎn)酸性能有所差異。其中E11的pH下降最快，這也說明該菌株對發(fā)酵基質(zhì)的利用率最高，發(fā)酵性能較強，從0到10 h其pH值從6.35下降至4.00。菌株B8、B34和B25的產(chǎn)酸性質(zhì)曲線基本一致，從第12 h開始產(chǎn)酸緩慢，到了32 h開始基本停止產(chǎn)酸。菌株A75的產(chǎn)酸能力一直保持均勻的狀態(tài)，產(chǎn)酸能力較弱。菌株A4的產(chǎn)酸性質(zhì)最差，從開始到18 h基本保持一致，18到40 h其pH值開始下降，但趨勢很緩慢，到了32 h基本停止產(chǎn)酸。圖3

圖3 各菌株40 h產(chǎn)酸能力變化Fig.3 Acid-producing ability of the strains within 40 h

2.3.2 菌株產(chǎn)酸率

研究表明，各個菌株的產(chǎn)酸率有著很明顯的差異性。E11的產(chǎn)酸率最高，前18 h的產(chǎn)酸率最快，到了18 h之后其產(chǎn)酸率開始緩慢，最高產(chǎn)酸率到達2.21%，在這6株菌當中產(chǎn)酸性能最佳。菌株B25、B34和B8的產(chǎn)酸率幾乎相同從0到26 h產(chǎn)酸率持續(xù)上升，最高分別達到1.39%、1.30%和1.16%，從26 h開始該3株菌的產(chǎn)酸率開始緩慢。菌株A75和A4的產(chǎn)酸率從起始至測定結(jié)束一直緩慢上升，其中A4到了32 h之后出現(xiàn)降低的趨勢。圖4

圖4 各菌株40 h產(chǎn)酸率變化Fig.4 Acid production rate of strains within 40 h

2.4 菌株分子生物學鑒定

研究表明，菌株P(guān)CR擴增，在1 500 bp附近出現(xiàn)亮條，與預期結(jié)果相符，擴增成功。瑞士乳桿菌屬共5株，分別為A4、A75、B8、B25和B34，屬于植物乳桿菌屬的為E11。圖5，表3

表3 菌株相似鑒定Table 3 Analysis on the results of similar identification of strains

圖5 PCR擴增后檢測電泳(M為DNAmarker)Fig.5 PCR amplification electropherogram of strains(M is DNA marker)

E11單獨位于1條枝，親緣關(guān)系與植物乳桿菌相近，相似度高達100%，確定該菌株為植物乳桿菌屬。A4、A75、B25、B34和B8聚集于1枝上，根據(jù)親緣相似菌株與其相似度判斷該菌種為瑞士乳桿菌屬。6株菌的菌落特點、菌株形態(tài)和生理生化測定結(jié)果，鑒定其中A4、A75、B8、B25以及B34為瑞士乳桿菌，E11為植物乳桿菌。圖6

圖6 基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of strains basedon 16S rDNA sequence

2.5 菌株體外益生特性

2.5.1 菌株耐酸及耐膽鹽能力

研究表明，篩選出的6株乳酸菌在不同pH值的MRS肉湯培養(yǎng)基中的生長能力為菌株A4在pH 2的條件下耐受率只有3.64%，然而分離菌株E11、B34、B25、A75和B8在pH 2的條件下仍然能生長，耐受率分別達到21.79%、14.01%、13.23%、11.61%和11.14%。只有菌株E11在pH 2的高酸性條件下表現(xiàn)出最高的存活率，可判斷其有良好的耐酸能力，能夠在機體消化道里面定殖。

篩選出來的6株乳酸菌在不同pH值的MRS肉湯培養(yǎng)基中的生長能力。菌株A4在pH 2的條件下耐受率只有3.64%，分離菌株E11、B34、B25、A75和B8在pH 2的條件下仍然能生長，耐受率分別達到21.79%、14.01%、13.23%、11.61%和11.14%。只有菌株E11在pH 2的高酸性條件下表現(xiàn)出最高的存活率。圖7

注：在圖中不同的字母表示差異顯著(P<0.05)，同一個字母表示差異不顯著(P>0.05),下同

該6株乳酸菌在不同濃度的膽鹽MRS肉湯培養(yǎng)基的耐受率。大多數(shù)菌株能夠在0.1%到0.3%的膽鹽MRS肉湯里面存活，當膽鹽濃度到達0.5%和1%時，大多菌株開始有了下降的趨勢。其中菌株A75和E11在膽鹽濃度達到0.5%和1%時仍表現(xiàn)出43.94%、33.14%和46.42%、38.76%的高耐受率,并在其2株菌之間差異顯著。其余菌株在膽鹽濃度達到0.3%開始出現(xiàn)存活率下降的趨勢，甚至下降至10%左右，這些菌株對于高濃度膽鹽有敏感性。圖8

圖8 菌株耐膽鹽能力Fig.8 Bile salts tolerance of the strains

2.5.2 菌株在模擬人工胃液的耐受能力

研究表明，即使在pH 2.5培養(yǎng)2 h，各菌株均耐受模擬胃液的酸性條件，存活的菌株仍占初始細胞的90%左右。對模擬胃液最敏感的是瑞士乳桿菌A4，4 h時菌落總數(shù)從最初的10-9CFU/mL降到10-6CFU/mL。6株菌株當中對模擬胃液抵抗力最強的是植物乳桿菌E11和瑞士乳桿菌A75，到了4 h時菌落總數(shù)依然能保持很高的狀態(tài)，2株菌都均能保持10-6CFU/mL的水平。表4

表4 各菌株在模擬人工胃液的耐受能力Table 4 Resistance tosimulated gastric solution of the strains

2.5.3 菌株表面疏水能力及自凝集能力

研究表明，各菌株用二甲苯處理過后表現(xiàn)出了不同程度的疏水能力。菌株A75和E11對二甲苯的疏水性最高(差異不顯著)，分別達到42.3%和44.26%，菌株B25和B8的疏水能力最低，只有16.51%和14.45%。圖9

圖9 各菌株表面疏水率Fig.9 Cell surfacehydrophobicity of the strains

各個菌株均表現(xiàn)出了不同程度的自凝集能力，隨著處理時間的增長，各菌株的自凝集能力也隨之增長。其中菌株E11的自凝集能力明顯很高，在靜止5 h之后自凝幾率達到了63.6%，該菌株在上消化道運輸過程中會比其余的菌株表現(xiàn)出更強的粘附性。菌株E11可能對上消化道的粘附性很強。圖10

圖10 各菌自凝集能力Fig.10 Auto-aggregatio ability of the strains

3 討 論

近幾年已經(jīng)開始對新疆自然發(fā)酵乳制品進行研究，并嘗試從中篩選出優(yōu)良乳酸菌開發(fā)新型乳制品發(fā)酵劑，同時應用于各種食品發(fā)酵中[30]。Xin Lü等[31]從新疆傳統(tǒng)發(fā)酵駱駝奶中分離篩選出來干酪乳桿菌，Xiaoji Zheng等[32]對新疆哈薩克族手工發(fā)酵制作奶酪微生物多樣性進行研究，并檢測出乳桿菌屬、鏈球菌屬以及酵母菌屬等多種微生物菌群。陳歡等[33]從傳統(tǒng)發(fā)酵奶酪中分離篩選出潛在益生乳酸菌乳酸明串球菌、格氏乳球菌、干酪乳桿菌以及瑞士乳桿菌等多種乳酸菌。

通過16S rDNA測序法篩選出來了6株乳酸菌，包括5株瑞士乳桿菌和1株植物乳桿菌。分子生物學鑒定，即16S rDNA或16S rRNA測序的原理是從菌株樣本當中提取基因片段通過克隆、測序及探針雜交獲得16S rRNA序列信息再與NCBI基因序列數(shù)據(jù)庫中其他菌株的基因信息進行比較，確定該菌株在發(fā)育樹中的位置，鑒定其微生物種類[34]。

能夠耐受上消化道的條件是菌株具有潛在益生的主要特征，符合該條件的菌株可初步評估為能夠生存和定值胃腸道[35]。大多數(shù)菌株能夠在pH 3的條件下仍然能夠表現(xiàn)出抵抗能力，但是很少有乳酸菌能夠在pH 2的條件下生存，胃液的pH值在空腹或攝入酸性食品時可降至pH 1.5～pH 2，能夠在這種極端條件下生存，可判定該菌株具有較強的耐酸性。膽鹽是細菌生存的另一個嚴重障礙，也是刺激胃腸道菌株的主要因素[36]。益生菌的表面疏水能力和自凝集能力與其對腸黏膜的粘附能力有關(guān)，可間接判斷和評價菌株在體內(nèi)的粘附定置能力[35]。對各菌株進行在MRS液體培養(yǎng)基當中的耐受性，模擬人工胃液當中的存活率及表面特性等[37]。通過菌株的耐酸、耐膽鹽、模擬消化系統(tǒng)當中的存活率以及其表面特性等能力能夠判定該菌株為潛在益生特性的菌株，可間接判定為益生菌。能夠耐受pH 2～3的酸度和濃度為0.3%～0.5%的膽鹽可評估該菌株能夠在體內(nèi)消化系統(tǒng)中存活。對這些菌株進一步進行了表面特性的研究。研究的表面特性包括菌株的自凝集能力和疏水能力，在實驗過程中所有菌株都表現(xiàn)出了不同水平的自凝集和疏水能力，其中植物乳桿菌E11在這6株菌株當中表現(xiàn)出最高的自凝集和疏水能力。

4 結(jié) 論

篩選36株疑似乳酸菌，其中有6株菌初步鑒定為目標乳酸菌菌株。將目標乳酸菌株進行16S rDNA分子生物學鑒定并分析基因測序。其中A4、A75、B8、B25和B34為瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)，E11為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。

菌株E11、A75、B34、B8和B24表現(xiàn)較優(yōu)異，其產(chǎn)酸率和產(chǎn)酸能力較高。分離菌株E11、B34、B25和B8的生長速率在這6株菌株當中最優(yōu)，其中E11的生長速率最高。植物乳桿菌E11和瑞士乳桿菌A75在低酸和高膽鹽條件下仍然能保持很高的存活率。菌株E11的表面特性最優(yōu)，并在模擬人工胃腸液當中菌株E11的存活率最高，判定其為優(yōu)良益生特性菌株。