亞麻萌發(fā)期耐鹽鑒定體系優(yōu)化及150份種質(zhì)耐鹽性綜合評價

李 梟，郭棟良，李恭澤，薛 敏，江海霞，葉佳麗，謝麗瓊

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046)

0 引 言

【研究意義】土壤鹽堿化是作物生長發(fā)育過程中面臨的主要非生物脅迫因子之一[1]。我國鹽堿化主要分布在西北、東北、華北及濱海地區(qū)[2，3]，篩選和培育耐鹽作物是應(yīng)對土壤鹽堿化問題最經(jīng)濟(jì)有效的辦法之一[4]。亞麻(LinumusitatissimumL.)作為一種重要的纖維和油料作物，主要種植于我國西北和華北地區(qū)[5]，而西北和華北地區(qū)又是我國主要的鹽堿地分布區(qū)。優(yōu)化亞麻耐鹽鑒定體系和篩選耐鹽種質(zhì)對于因地制宜地利用鹽堿地、促進(jìn)鹽堿地亞麻栽培具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】有關(guān)亞麻萌發(fā)期耐鹽鑒定體系建立和種質(zhì)耐鹽性評價已有一些研究。郭媛等[6]利用NaCl濃度梯度(0、50、100、150、200、250 mmol/L)處理10個亞麻品種發(fā)現(xiàn)200 mmol/L NaCl脅迫下相對發(fā)芽率分布最離散。于瑩等[7]選用150和250 mmol/L NaCI脅迫16份亞麻品種，發(fā)現(xiàn)了高濃度鹽溶液才能夠有效區(qū)分不同品種的發(fā)芽率。M.Zaghdoudi等[8]探討了NaCl濃度梯度(0、200、250和300 mmol/L)脅迫下對2個亞麻品種萌發(fā)的影響，在NaCl濃度高于200 mmol/L時才能明顯降低發(fā)芽率。Datir.S.S等[9]研究了不同濃度的NaCl(0、25、50、75和100 mmol/L)對2種亞麻品種的種子發(fā)芽率、活力指數(shù)、相對含水量、總長度和淀粉酶的影響。趙瑋等[10]利用NaCl濃度梯度(0、50、100、150、200、250 mmol/L)處理了2個亞麻品種，通過發(fā)芽率、總鮮重、根長和芽長的生長狀況確定亞麻萌發(fā)期NaCI溶液的鹽脅迫濃度為100 mmol/L并選用該濃度處理并綜合評價了28份胡麻種質(zhì)的耐鹽性?！颈狙芯壳腥朦c】亞麻萌發(fā)期耐鹽鑒定體系并沒有形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，并且已建立的體系中，無論從NaCl濃度梯度的設(shè)置還是樣本數(shù)量都不夠充分。已有的研究對于鹽脅迫濃度的選用展現(xiàn)出不一致的結(jié)果，即不同研究中選用的NaCl脅迫濃度差異較大，單個脅迫濃度不能有效區(qū)分所有生理指標(biāo)。有必要對亞麻萌發(fā)期耐鹽鑒定體系作出優(yōu)化。【擬解決的關(guān)鍵問題】選用芽長、根長和發(fā)芽率作為亞麻萌發(fā)期耐鹽性鑒定的表型性狀。設(shè)置13個NaCl濃度梯度(0～ 250 mmol/L)脅迫處理30份亞麻種質(zhì)，針對每個指標(biāo)優(yōu)化鹽脅迫的濃度并以此脅迫處理150份亞麻材料并進(jìn)行萌發(fā)期耐鹽性綜合評價，優(yōu)化亞麻萌發(fā)期耐鹽鑒定體系，為耐鹽種質(zhì)資源的篩選和耐鹽功能基因研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗于2019年在新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院分子育種實驗室進(jìn)行。供試亞麻材料源于該課題組構(gòu)建的核心種質(zhì)資源[11]，從中選取油用亞麻、纖用亞麻、兼用亞麻各50份，共150份種質(zhì)。所有材料均由新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院分子育種實驗室保存。

1.2 方 法

1.2.1 耐鹽評價體系建立

從150份種質(zhì)中隨機(jī)挑選30個亞麻種質(zhì)材料，設(shè)置0(對照，蒸餾水)、50、75、100、125、150、175 、200、210、220、230、240、250 mmol/L的NaCl梯度鹽溶液。每個品種挑選出飽滿完整的種子置于1.5 mL EP管中，1%NaClO浸泡10 min，無菌水沖洗2至3次后，放置在墊有2張中性濾紙(φ 9 cm)的1次性塑料培養(yǎng)皿(φ9 cm)中[12]，每個培養(yǎng)皿中50粒種子。鹽脅迫的培養(yǎng)皿中加入15 mL的NaCl溶液，對照組加入15 mL蒸餾水，置于24±2(℃)，光照16 h/黑暗8 h，光照強(qiáng)度為5 000lx的恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)第3 d補(bǔ)加對應(yīng)濃度的鹽溶液4 mL使培養(yǎng)皿內(nèi)的各離子濃度保持相對穩(wěn)定。各處理重復(fù)3次。培養(yǎng)7 d后統(tǒng)計各培養(yǎng)皿種子的發(fā)芽率(germination rate，GR)，同時隨機(jī)選取10株利用掃描儀結(jié)合Image J 1.8.0軟件測量亞麻的芽長(shoot length，SL)和根長(root length，RL)。

1.2.2 種質(zhì)耐鹽性篩選

在亞麻萌發(fā)期，以相對芽長和相對根長為指標(biāo)時，適宜的NaCl脅迫濃度為100 mmol/L；而以相對發(fā)芽率為指標(biāo)時，適宜的NaCl篩選濃度為220 mmol/L。用100和220 mmol/L濃度NaCl溶液分別處理150份亞麻材料。

1.2.3 耐鹽性綜合評價

各指標(biāo)相對值被用于衡量種質(zhì)耐鹽性的差異，包括相對發(fā)芽率(relative germination rate，RGR)、相對芽長(relative shoot length，RSL)和相對根長(relativeroot length，RRL)。發(fā)芽率=發(fā)芽種子數(shù)/參試種子數(shù)×100%；鹽脅迫下各性狀的相對值=NaCl脅迫處理測定值/對照測定值。綜合RGR、RSL和RRL計算加權(quán)隸屬函數(shù)值(D值)，對供試亞麻種質(zhì)萌發(fā)期的耐鹽性進(jìn)行綜合評價。計算D值[13]：

μ(Xi)=(Xi-Xi min)/(Xi max-Xi min) .

(5)

(6)

(7).

式中，Xi表示各材料基于指標(biāo)i的相對值，Xi max和Xi min分別表示Xi的最大值和最小值，μ(Xi)表示各材料基于Xi的隸屬函數(shù)值。CVi為μ(Xi)的變異系數(shù)，Wi表示μ(Xi)的變異與總變異的比率即權(quán)重。D值表示各指標(biāo)隸屬函數(shù)值μ(Xi)與其權(quán)重Wi乘積的累加，代表多個指標(biāo)對各品種耐鹽性進(jìn)行綜合評價。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2016軟件整理試驗數(shù)據(jù)，使用SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用Graphpad prism 5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度 NaCl脅迫對亞麻萌發(fā)的影響

研究表明，隨著NaCl溶液濃度逐漸升高，亞麻的生長被明顯的抑制。根長和芽長對鹽濃度表現(xiàn)出極度的敏感，在低濃度NaCl溶液(50、75和100 mmol/L)脅迫下，芽長分別降低到對照的79%、48%和33%，根長分別降低到對照的71%、43%和18%。當(dāng)NaCl溶液濃度升高至175 mmol/L，根長和芽長幾乎被完全抑制，僅為對照的1%和2%，故高于175 mmol /L NaCl濃度的處理組將不再統(tǒng)計芽長和根長。相較于根長和芽長，發(fā)芽率對鹽脅迫表現(xiàn)出更高的耐受性。在低濃度NaCl溶液(50、75和100 mmol/L)脅迫下，發(fā)芽率與對照相比沒有表現(xiàn)出明顯差異(均接近100%)。當(dāng)NaCl溶液濃度升高至175 mmol/L時，發(fā)芽率才出現(xiàn)較明顯下降。當(dāng)NaCl溶液濃度達(dá)到220 mmol/L時，發(fā)芽率降低至對照的一半以下(40%)。不同指標(biāo)對鹽脅迫的敏感度不一樣，芽長和根長在較低濃度的鹽脅迫下即可表現(xiàn)出明顯的抑制，而發(fā)芽率在較高濃度的鹽脅迫下才能表現(xiàn)出差異。圖1，表1

圖1 不同濃度NaCl溶液脅迫下2個亞麻種質(zhì)Olayozon和Line 629-01萌發(fā)7 d生長變化(比例尺=1cm)Fig.1 The growth of two flax germplasm Olayozon and Line 629-01 under the stress of different concentrations of NaCl solution after germination for 7 days(bar=1cm)

表1 不同濃度鹽脅迫下30份亞麻種質(zhì)萌發(fā)期各指標(biāo)的耐鹽系數(shù)變化Table 1 Salt tolerant coefficient of each single index of 30 flax germplasm during germination under different concentrations salt stress

2.2 不同生理指標(biāo)下NaCl適宜脅迫濃度

研究表明，在50 ～ 175 mmol/L NaCl濃度梯度脅迫下芽長和根長均表現(xiàn)出明顯的抑制，RSL和RRL的變異系數(shù)(CV)表現(xiàn)為先增高后降低的趨勢，且均在100 mmol/L的NaCl脅迫下最大，分別為60.73%和70.59%。以RSL和RRL為指標(biāo)時適宜的NaCl脅迫濃度為100 mmol/L。在此NaCl濃度脅迫下，種子發(fā)芽率與對照相比沒有差異(平均RGR≈1)，100 mmol/L的NaCl脅迫對發(fā)芽率沒有影響，該濃度不能有效區(qū)分鹽脅迫下各種質(zhì)發(fā)芽率的差異。隨著NaCl濃度的增加，在220 mmol/L 時，出現(xiàn)受試種子全部不萌發(fā)RGR最小值為0的情況，此時部分亞麻種質(zhì)最大RGR值仍高達(dá)0.9，受試群體平均RGR為0.4，變異系數(shù)達(dá)58.55%。隨著NaCl脅迫濃度繼續(xù)升高至230 ～ 250 mmol/L，越來越多品種RGR趨于0導(dǎo)致RGR的變異系數(shù)仍在增大，不過數(shù)據(jù)的離散程度顯著降低，當(dāng)以RGR為指標(biāo)時適宜的NaCl篩選濃度為220 mmol/L。不同耐鹽指標(biāo)的最適NaCl篩選濃度不同，同一鹽脅迫濃度不能有效區(qū)分不同生長指標(biāo)。表1，圖2

注：在箱線圖中，最上方和最下方的線段分別表示數(shù)據(jù)的最大值和最小值，其中箱線圖的上方和下方的線段分別表示第三四分位數(shù)和第一四分位數(shù)，箱線圖中間的線段表示數(shù)據(jù)的中位數(shù)。另外，在最上方和最下方的黑色圓點分別表示樣本數(shù)據(jù)中的極端值。橙色圓點表示變異系數(shù)(CV)。下同

2.3 150份亞麻種質(zhì)萌發(fā)期耐鹽性綜合評價

研究表明，與正常條件相比，鹽脅迫下芽長、根長和發(fā)芽率都受到顯著的抑制。3個鑒定指標(biāo) SL、RL和GR在鹽脅迫條件下的平均值比對照條件下的平均值分別減小了81.60%、80.62%和39.07%，變異系數(shù)為對照的6.67、2.86和5.07倍，優(yōu)化后的耐鹽性鑒定體系能反映NaCl對亞麻種子萌發(fā)的抑制效果，基于這些指標(biāo)可以有效區(qū)分不同品種的耐鹽性。表2，圖3

表2 150份亞麻種質(zhì)在鹽脅迫和對照條件下各指標(biāo)的變異Table 2 Variation analysis of 150 flax germplasm under salt stress and control conditions

圖3 鹽脅迫下150份亞麻種質(zhì)芽長、根長和發(fā)芽率變化Fig.3 Effects of salt stress on shoot length, root length and germination rate of 150 flaxgermplasm

優(yōu)化的耐鹽性鑒定體系能夠使耐鹽系數(shù)RSL、RRL和RGR呈現(xiàn)出豐富的變異。μ(RGR)的變異系數(shù)和權(quán)重最小，μ(RSL)和μ(RRL)變異系數(shù)和權(quán)重相當(dāng)且都較大。μ(RGR)、μ(RSL)、μ(RRL)和D值進(jìn)行相關(guān)性分析，μ(RSL)和μ(RRL)表現(xiàn)出最高的相關(guān)性(R=0.910，P=1.542×10-58)，μ(RSL)和μ(RRL)在評價亞麻萌發(fā)期耐鹽性方面一致性高。而μ(RGR)與μ(RSL)或μ(RRL)表現(xiàn)出低相關(guān)(R=0.193，P=0.018；R=0.238，P=0.003，分別)，μ(RGR)與μ(RSL)或μ(RRL)在評價亞麻萌發(fā)期耐鹽性方面一致性低。D值與這些指標(biāo)隸屬函數(shù)值均呈極顯著正相關(guān)(P<0.001)，D值可以用來綜合評價供試亞麻萌發(fā)期的耐鹽性。表3，表4

表3 基于不同鑒定指標(biāo)的耐鹽系數(shù)和隸屬函數(shù)值Table 3 Salt tolerance coefficient and membership function values based on different identification indices

表4 各指標(biāo)隸屬函數(shù)值與D值相關(guān)性Table 4 Correlation analysis ofeach index membership function value and D value

D值變化范圍為0.022 1～0.956 7，ALSEE的D值最大為0.956 7，其對鹽脅迫的耐受性最強(qiáng)，而Raisa的D值最小為0.022 1，其對鹽脅迫最敏感。根據(jù)供試亞麻種質(zhì)的D值進(jìn)行聚類分析，150份亞麻種質(zhì)被劃分為5個類群，依據(jù)D值從大到小對應(yīng)5個耐鹽等級，其中高耐等級種質(zhì)3份(2%，占總數(shù)，下同)、耐鹽等級種質(zhì)36份(24%)、中耐等級種質(zhì)67份(44.7%)、敏感等級種質(zhì)33份(22%)、高敏等級種質(zhì)11份(7.3%)。表5

2.4 亞麻不同亞群間萌發(fā)期耐鹽性的差異

研究表明，隨著耐鹽等級的提高，不論是單一指標(biāo)還是D值，纖用亞麻所占比例都在不斷下降，而油用亞麻所占比例都在不斷升高，兼用亞麻則居于兩者之間。在高耐級別中，除RGR外，其余指標(biāo)中纖用亞麻占比為0，而油用亞麻占比為100%，在高敏級別中，纖用亞麻占比65%～90%不等，而油用亞麻占比僅為8%～15%。油用亞麻群體中RGR、RSL、RRL和D值均顯著高于纖維亞麻和兼用亞麻(除RGR中油用亞麻和兼用亞麻無差異)。油用亞麻對鹽脅迫的耐受性要強(qiáng)于兼用亞麻和纖維亞麻，纖用亞麻對鹽脅迫的耐受性最差。圖4

注：(A，C，E，G)亞麻不同亞群鹽脅迫下各耐鹽系數(shù)的分布。(B，D，F(xiàn)，H)亞麻不同亞群間各耐鹽系數(shù)的箱線圖。A和B：相對萌發(fā)率；C和D:相對芽長；E和F:相對根長；G和H：D值

3 討 論

植物的耐鹽性是由多個數(shù)量性狀基因座(QTL)調(diào)控的復(fù)雜性狀[14]。由于植物耐鹽機(jī)制的復(fù)雜性以及遺傳基礎(chǔ)的多樣性，對植物耐鹽性作出全面、有效的評價涉及多方面的考慮[15]。以往的研究往往利用多個指標(biāo)綜合評價植物萌發(fā)期的耐鹽性[10，16-19]，但由于不同生理指標(biāo)間可能存在交互作用導(dǎo)致某一類指標(biāo)的權(quán)重被放大，會使耐鹽性評價效果受到影響，指標(biāo)并不是越多越好[12]。趙瑋等[10]利用11個指標(biāo)對28份胡麻進(jìn)行耐鹽性綜合評價，通過主成分分析將11個指標(biāo)轉(zhuǎn)化成3個主成分(累計貢獻(xiàn)率87.213%)，分別代表種子萌發(fā)情況、下胚軸和胚根長勢情況。基于少數(shù)生理指標(biāo)的選擇也可以作為作物抗鹽脅迫篩選的有效標(biāo)準(zhǔn)[20]。研究選用芽長、根長和發(fā)芽率為生理指標(biāo)來評價亞麻萌發(fā)期耐鹽性。

亞麻萌發(fā)過程中，低濃度的NaCl溶液脅迫能夠提高部分亞麻種質(zhì)的發(fā)芽率并促進(jìn)芽、根的伸長，這與前人研究結(jié)果一致[6，10，21]。當(dāng)NaCl溶液濃度為175 mmol/L時，根長和芽長幾乎被完全抑制，而此濃度下發(fā)芽率才開始出現(xiàn)較明顯下降，當(dāng)濃度達(dá)到250 mmol/L時，個別材料仍保持較高發(fā)芽率，芽長和根長對鹽脅迫的敏感度遠(yuǎn)高于發(fā)芽率，以發(fā)芽率作為亞麻萌發(fā)期鑒定指標(biāo)適宜的鹽濃度較高，前人對亞麻的研究中也發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象[6-8]。固定脅迫濃度不適用所有指標(biāo)的評價，單一濃度脅迫的評價體系可能導(dǎo)致某些指標(biāo)作用被低估。研究利用13個NaCl濃度梯度(0～250 mmol/L)對30份亞麻種質(zhì)進(jìn)行脅迫處理?；谧儺愊禂?shù)篩選各鑒定指標(biāo)適宜的NaCl 脅迫濃度，以RSL或RRL為指標(biāo)時適宜的NaCl脅迫濃度均為100 mmol/L，與趙瑋等[10]的研究結(jié)果一致。以RGR為指標(biāo)時適宜的NaCl篩選濃度為220 mmol/L，與郭媛[6]、于瑩[7]、M.Zaghdoudi[8]等的研究結(jié)果相當(dāng)。同時，不同NaCl濃度各指標(biāo)的變異系數(shù)的變化也表明，篩選出的適宜脅迫濃度下的各指標(biāo)均達(dá)到良好評價效果。此外，研究玉米[22]、花生[23]等作物耐鹽性時提出，單一濃度難以準(zhǔn)確反映各品種的耐鹽性強(qiáng)弱，有必要綜合幾個濃度進(jìn)行耐鹽性評價。

試驗結(jié)果表明，NaCl 脅迫濃度為100 mmol/L時，RSL和RRL在評價亞麻萌發(fā)期耐鹽性方面表現(xiàn)出高度的正相關(guān)，鹽脅迫對于亞麻萌發(fā)期生長的影響可能是全面的，萌發(fā)期的芽和根對于鹽脅迫的耐受表現(xiàn)出一致性。在NaCl篩選濃度為220 mmol/L時，盡管RGR能很好區(qū)分不同亞麻種質(zhì)的耐鹽性，但μ(RGR)與μ(RSL)或μ(RRL)表現(xiàn)出低的相關(guān)性，鹽脅迫下亞麻種子的萌發(fā)和胚根、胚芽的生長應(yīng)對脅迫的機(jī)制不同。高鹽對植物的損傷主要是滲透脅迫和離子毒害[24]，種子萌動時主要受到滲透脅迫，外界環(huán)境中高離子濃度形成的低水勢抑制了種子的吸脹作用從而抑制了種子萌發(fā)[25]，而幼苗胚根、胚芽的生長則受到滲透脅迫和離子毒害的協(xié)同作用，體內(nèi)Na+、Cl-等離子富集產(chǎn)生離子毒害并引起體內(nèi)K+等營養(yǎng)元素失衡而造成幼苗生長受到嚴(yán)重抑制。

油用亞麻亞群中RGR、RSL、RRL和D值均顯著高于纖維亞麻亞群和兼用亞麻亞群，這些結(jié)果表明，油用亞麻對鹽脅迫的耐受性要強(qiáng)于兼用亞麻和纖維亞麻，這與郭媛[6]和郭棟良[12]等的研究結(jié)果一致。前人研究認(rèn)為油用亞麻是栽培亞麻的祖先，兼用亞麻是從油用到纖用亞麻馴化過程的中間型，與纖用亞麻相比，油用亞麻遺傳多樣性更為豐富[11，26，27]。研究顯示在高耐鹽材料中(D>0.6),油用亞麻占70%，兼用亞麻占30%，不包含纖維亞麻，鹽脅迫抗性位點主要集中在油用亞麻中，這些材料可在亞麻育種中使用。

4 結(jié) 論

不同耐鹽指標(biāo)的最適篩選濃度不同。在亞麻萌發(fā)期，相較于芽長和根長，發(fā)芽率對鹽脅迫具有更高的耐受性，確定了當(dāng)以相對根長或相對芽長作為耐鹽性鑒定指標(biāo)，適宜的NaCl篩選濃度為100 mmol/L；當(dāng)以相對萌發(fā)率作為耐鹽性鑒定指標(biāo)，適宜的NaCl篩選濃度為220 mmol/L。篩選出高耐材料共3份；耐鹽材料共36份；中耐材料共67份；敏感材料共33份；高敏材料共11份。3份高度耐鹽材料(ALSEE、OLEIFERA和CIli 2038)可用于亞麻耐鹽育種。亞麻耐鹽能力為油用>兼用>纖用。