MT1E在三陰性乳腺癌中的表達和意義

梁家瑋，郭海峰

(1.牡丹江醫(yī)學院；2.牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011)

三陰性乳腺癌(Triple-negative breast cancer,TNBC)具有雌激素受體(Estrogen receptor,ER)、孕激素受體(Progesterone receptor,PR)和人表皮生長因子受體2(Human epidermal growth factor receptor-2 extracellular domain,HER2)陰性表達的特殊分子表型[1]。鑒于這種特殊表型，TNBC對內(nèi)分泌治療和靶向治療均不敏感，常規(guī)術后輔助放化療而殘留的轉(zhuǎn)移病灶最終會導致腫瘤復發(fā)，5年內(nèi)死亡率可高達40%[2-3]。故迫切需要開發(fā)針對TNBC的新的治療方案和靶點。金屬硫蛋白1E(Metallothionein1E,MT1E)是一種富含半胱氨酸的非酶類小分子蛋白，是人金屬硫蛋白(Metallothionein,MT)的亞型之一，其可由多種內(nèi)源和/或外源性刺激誘導表達，在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演重要角色[4]。本研究通過免疫組化SP法對人TNBC組織和癌旁組織中的MT1E表達進行檢測，并進一步分析其與TNBC患者臨床病理特征和預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集自2015年1月至2016年12月間于牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院治療的45例TNBC患者的TNBC組織和癌旁組織，并制作成石蠟切片。45名患者均為女性，年齡29～79歲，中位年齡56歲，平均年齡(51.87±11.00)歲，資料均來自臨床入院病歷。納入標準：患者均行乳腺癌改良根治術+前哨淋巴結活檢術(陽性者進行腋窩淋巴結清掃)，所有患者術前均未接受放療、化療和靶向治療等。排除標準：臨床或病理資料不可獲得者；合并其它惡性腫瘤者；術前存在其它臟器轉(zhuǎn)移者；未按乳腺癌治療指南行術后輔助治療者。所有使用標本均符合倫理委員會要求并簽署知情同意書。

1.2 免疫組織化學染色SP法檢測MT1E表達

1.2.1 免疫組織化學染色SP法 (1)烤片：石蠟切片60 ℃恒溫箱烤片1 h；(2)脫蠟至水：依次在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中浸泡 20 min，無水乙醇、95% 乙醇、85%乙醇和 75% 乙醇內(nèi)各浸泡5 min，最后用PBS清洗切片；(3)抗原修復：切片上滴加檸檬酸緩沖液進行抗原修復后用PBS溶液進行5 min×3次的清洗；(4)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：切片置入3%雙氧水后室溫避光孵育20 min，PBS溶液進行5 min×3次的清洗；(5)血清封閉: 切片甩干后用組化筆畫圈，在組化圈內(nèi)滴加3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉20 min；(6)加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加配好的一抗溶液，置于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜；(7)滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育1 h后PBS溶液進行5 min×3次的清洗；(8)滴加SP工作液，37 ℃孵育1 h后PBS溶液進行5 min×3次的清洗；(9)DAB顯色5 min、蘇木精復染2 min，常規(guī)脫水、透明、封片后鏡檢。兔抗人MT1E一抗購自上海澤葉生物技術有限公司(ZY-6074)，按1∶100比例稀釋。

1.2.2 結果判讀 采用半定量法進行結果分析。(1)按細胞著色程度評分：不著色者0分，著色弱、淺黃色者1分，著色中等、棕黃色者2分，著色強、棕褐色者3分。(2)按陽性細胞占比評分：無陽性細胞者記0分，1%～25%者記1分，26%～50%者記2分，51%～75%者記3分，≥76%者記4分。(3)兩項得分相乘:0分為陰性，1～3分為弱陽性，4～8分為陽性，9～12為強陽性。最終得分0～3視為低表達，4～12視為高表達。

1.3 隨訪和預后分析隨訪方式涵括住院復查、門診和電話隨訪。隨訪起始于術后第一天，每3個月一次，截止時間點為2020年6月30日?？偵嫫?Overall survival,OS)為患者術后第一日起至因TNBC引起死亡的時間，無病生存期(Disease-free survival,DFS)為患者術后第一日起至TNBC出現(xiàn)復發(fā)或轉(zhuǎn)移的時間，對中途失訪、死于其它疾病和生存期超過隨訪截止時間的數(shù)據(jù)視為刪失數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學方法以SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料采用卡方檢驗進行統(tǒng)計學分析。Kaplan-Meier曲線法用以進行MT1E表達相關的預后分析。Cox比例風險回歸模型分析與患者DFS和OS相關的臨床病理特征，因該研究樣本總數(shù)偏少、變量多，先通過單因素分析篩選出可能相關的變量后再行多因素分析。P<0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 患者隨訪信息患者的隨訪時間為23～63個月，中位隨訪時間為49個月，其中41例完成隨訪，4例失訪，失訪率為8.9%；至隨訪截止，出現(xiàn)TNBC復發(fā)或轉(zhuǎn)移的患者共15例，其中11例因腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移死亡，死于其他原因者4例。

圖1 MT1E在TNBC組織及對應癌旁組織中表達的代表性圖片(×400)

2.2 MT1E在TNBC組織及癌旁組織中的表達免疫組織化學染色SP法結果顯示，MT1E陽性定位于細胞質(zhì)，見圖1。TNBC組織中MT1E的高表達率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 MT1E在TNBC組織和癌旁組織中的表達

2.3 TNBC中MT1E表達與臨床病理特征的關系臨床病理特征資料均來自臨床入院病歷及術后病理報告。MT1E高表達與患者年齡、絕經(jīng)與否和腫瘤大小無關(P>0.05)；但與淋巴結轉(zhuǎn)移、TNM分期和組織學分級有關(P<0.05)。MT1E表達水平越高TNBC的惡性程度越高，發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性事件的可能越大，見表2。

表2 MT1E與TNBC臨床病理特征的關系

2.4 MT1E表達與TNBC預后的相關性Kaplan-Meier法進行MT1E表達與TNBC預后相關性的統(tǒng)計學分析，MT1E高表達和低表達患者的無病生存曲線和總生存曲線分別見圖2、圖3。MT1E高表達組的累積無病生存率為45.5%，低表達組的累積無病生存率為68.0%，MT1E高表達組的累積無病生存率顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；MT1E高表達組的累積總生存率為53.6%，低表達組的累積總生存率為75.4%；MT1E高表達組的累積總生存率顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。上述結果提示MT1E高表達組的TNBC患者較低表達組更容易出現(xiàn)復發(fā)和死亡等惡性事件且時間較早。

圖2 MT1E表達與患者無病生存率的關系

圖3 MT1E表達與患者總生存率的關系

2.5 影響TNBC患者DFS和OS的臨床病理特征經(jīng)單因素分析后分別將MT1E表達、淋巴結轉(zhuǎn)移和TNM分期納入DFS的多因素Cox比例風險回歸模型，MT1E表達、淋巴結轉(zhuǎn)移和TNM分期和病理學分級納入OS的多因素Cox比例風險回歸模型。多因素分析結果提示TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移和MT1E表達與TNBC的復發(fā)相關，而TNM分期和MT1E表達與TNBC的死亡相關。推測MT1E表達可作為預測TNBC復發(fā)和死亡的獨立危險因素。見表3和表4。

表3 TNBC患者臨床病理特征與DFS的單因素和多因素COX比例風險回歸模型分析

表4 TNBC患者臨床病理參數(shù)與OS的單因素和多因素COX比例風險回歸模型分析

3 討論

乳腺癌的分子亞型主要由免疫組織化學的方式進行確定。TNBC具有ER、PR和HER-2表達缺失的分子表型，但作為一種異質(zhì)性疾病，其基因組和轉(zhuǎn)錄組譜等方面都表現(xiàn)出巨大差異[5]。TNBC的這種異質(zhì)性致使很難在臨床前研究中找到合適的分子靶點，無法研發(fā)針對整個TNBC的藥物，使其主要治療方法仍然停留在蒽環(huán)類和紫杉醇類化療。雖然新輔助化療的臨床治療效果明顯，但與其他乳腺癌亞型相比TNBC患者的遠處復發(fā)率仍然更高，預后更差，生存期明顯短于其它乳腺癌亞型[6]。因此，除了開發(fā)舊藥的新用途外，不斷尋找新的有效的治療靶點逐漸成為TNBC治療重點。

MT是一種分子量低約6～7kDa的、由61～68個氨基酸組成的、高度保守的、富含半胱氨酸的小分子蛋白，其對正常細胞和腫瘤細胞的增殖、分化和凋亡發(fā)揮了至關重要的影響[7]。MT在生物學中最初被認定的功能便是與金屬離子(鋅和鎘等)的結合、轉(zhuǎn)運和調(diào)控，這項功能使其可調(diào)控許多與腫瘤相關的鋅依賴性蛋白的合成，對腫瘤的細胞分化與增殖、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移起重要作用，并作為調(diào)節(jié)金屬穩(wěn)態(tài)的免疫調(diào)節(jié)劑對腫瘤微環(huán)境進行重塑使腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸。同時，MT還可作為抗氧化劑保護腫瘤細胞免受由誘變劑、抗腫瘤藥和輻射產(chǎn)生的自由基和氧化應激的影響，并對DNA損傷和細胞凋亡起到保護作用[8]。盡管MT在不同腫瘤組織中表達水平具有差異，但這恰恰說明了MT在腫瘤的發(fā)生和進展中扮演重要角色[9]。

MT1E是MT的亞型之一，F(xiàn)riedline[10]、Jin[11]以及Tai[13]均發(fā)現(xiàn)，相較雌激素受體陽性乳腺癌，MT1E在雌激素陰性受體的乳腺癌中表達更高，MT1E可能在雌激素受體陰性的乳腺癌中具有獨特的生物學作用。本研究通過免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)TNBC組織中MT1E的表達高于癌旁組織，且MT1E的表達與TNBC的淋巴結轉(zhuǎn)移、TNM分期、組織學分級等臨床病理特征，并影響著TNBC的復發(fā)、患者的死亡等預后狀況。由此可見，MT1E在TNBC中扮演著促進其生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的角色，其可能作為調(diào)控因子直接或間接調(diào)控靶向TNBC的部分腫瘤基因的表達進而參與TNBC的發(fā)生和發(fā)展中。

綜上所述，MT1E可能在TNBC等多種腫瘤的發(fā)生和進展中扮演重要的角色。雖然本研究樣本量較小且僅采用免疫組織化學染色的實驗方法分析了MT1E在TNBC中的表達和作用，但明顯可見MT1E在TNBC中具有很高的科研價值。相信通過對MT1E與TNBC的深入研究，不僅可揭示其在TNBC發(fā)病機制中的功能，還將為TNBC診斷和治療提供新的見解。