高效液相色譜法同時測定口腔潰瘍油中鹽酸達(dá)克羅寧和醋酸氯己定含量*

熊 英，雷 健，邢 茂

（中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，重慶 400037）

口腔潰瘍油主要由醋酸氯己定、醋酸潑尼松龍、鹽酸達(dá)克羅寧、冰片、鞣酸等配伍制成，可改善口腔潰瘍癥狀，治療口腔潰瘍的療效顯著。其中，醋酸氯己定可殺菌、消炎［1-3］；醋酸潑尼松龍有抗炎作用［4］；鹽酸達(dá)克羅寧有止痛功效［5］；冰片可止痛消腫［6］；鞣酸可減輕皮膚或黏膜的炎癥，在炎癥表面使蛋白質(zhì)形成一層保護(hù)膜，減輕外界對神經(jīng)末梢的刺激作用，消除痛覺和局部血管的擴(kuò)張反應(yīng)［7-8］。口腔潰瘍油原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未完全解決鞣酸對主要成分測定的干擾，以及醋酸氯己定的色譜峰形的展寬和拖尾問題［9］。本研究中建立了同時測定口腔潰瘍油中醋酸氯己定和鹽酸達(dá)克羅寧含量的高效液相色譜（HPLC）法［10-13］，以提高口腔潰瘍油的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司），包括G7114A VWD 檢測器和Chemstation 工作站；PB-10 型pH 計（上海雷磁儀器有限公司）；ME235S型電子天平（德國Sartorius公司，精度為十萬分之一）。

1.2 試藥

口腔潰瘍油（陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑室，批號分別為141219，150310，150416，150506）；鹽酸達(dá)克羅寧對照品（批號為100423-201102，含量為99.8%），醋酸氯己定對照品（批號為100183 - 201003，含量為96.2%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純，美國Honeywell 公司）；磷酸二氫鉀（色譜純，阿拉丁試劑＜上海＞有限公司）；冰醋酸（分析純，重慶川東化工集團(tuán)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C8柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）- 0.02 mol/ L KH2PO4溶液（B，冰醋酸調(diào)pH 至2.5），梯度洗脫（0～20 min 時45%A，20～21 min 時45%A～60%A，21～30 min 時60%A，30～31 min 時60%A～45%A，31～35 min 時45%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：259 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

取醋酸氯己定對照品25 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用初始比例流動相［甲醇- 磷酸鹽緩沖液（45∶55，V/V）］溶解并定容，搖勻，作為醋酸氯己定對照品濃溶液。取鹽酸達(dá)克羅寧對照品25 mg，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，精密量取醋酸氯己定對照品濃溶液5 mL，加入同一容量瓶中，用流動相溶解并定容，搖勻，即得混合對照品貯備液。精密量取混合對照品貯備液1 mL，置10 mL 容量瓶中，用流動相稀釋并定容，搖勻，即得混合對照品溶液。

取樣品，用移液管精密量取2 mL，置200 mL容量瓶中，用甲醇分次洗滌移液管內(nèi)壁，洗液并入容量瓶中。加甲醇適量，振搖使溶解，再加流動相稀釋并定容，搖勻，即得供試品溶液。

按處方工藝配制缺醋酸氯己定和鹽酸達(dá)克羅寧的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：取2.2 項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。結(jié)果相鄰峰之間的分離度均大于1.5，且陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。

線性關(guān)系考察：精密量取2.2項下混合對照品貯備液10 mL，置50 mL 容量瓶中，用流動相稀釋并定容，搖勻，即得200%對照品溶液。分別精密量取200%對照品溶液8，6，5，4，3，2 mL，置10 mL 容量瓶中，加流動相定容，搖勻，制成系列混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得鹽酸達(dá)克羅寧和醋酸氯己定的回歸方程分別為Y鹽=15 505.066 3X鹽-1.709 0，r= 0.999 8（n =7）；Y醋= 31 759.537 6X醋-7.048 2，r=0.999 8（n=7）。結(jié)果表明，鹽酸達(dá)克羅寧和醋酸氯己定的質(zhì)量濃度分別在39.23～196.17 μg/mL和3.87～19.35 μg/mL 范圍內(nèi)與各自峰面積的線性關(guān)系良好。

1. 鹽酸達(dá)克羅寧 2. 醋酸氯己定A. 陰性對照品溶液 B. 混合對照品溶液 C. 供試品溶液圖1 高效液相色譜圖1.Dyclonine hydrochloride 2.Chlorhexidine acetate A.Negative reference solution B.Mixed reference solution C.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

精密度試驗：取2.2 項下混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果鹽酸達(dá)克羅寧和醋酸氯己定峰面積的RSD分別為0.35%和0.43%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取樣品（批號為141219）適量，按2.2項下方法制備供試品溶液6 份，再按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計算鹽酸達(dá)克羅寧和醋酸氯己定的含量。結(jié)果的RSD分別為0.50%和0.63%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品（批號為141219）適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10 h時按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果鹽酸達(dá)克羅寧和醋酸氯己定峰面積的RSD分別為0.55%和0.59%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

加樣回收試驗：取醋酸氯己定對照品適量，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加流動相溶解，制成醋酸氯己定對照品濃溶液。取鹽酸達(dá)克羅寧對照品適量，精密稱定，置100 mL容量瓶中，精密量取醋酸氯己定對照品濃溶液20 mL，加入同一容量瓶中，用流動相溶解并定容，搖勻，作為混合對照品貯備液。精密量取已知含量的供試品溶液1 mL（鹽酸達(dá)克羅寧9.638 mg/mL，醋酸氯己定0.948 mg/mL），共9 份，置200 mL 容量瓶中，分別加入混合對照品貯備液8，10，12 mL，用流動相稀釋并定容，搖勻。按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

耐用性試驗：取樣品（批號為141219）適量，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，適當(dāng)調(diào)整色譜條件參數(shù)，在不同色譜條件下測定樣品含量，考察方法的耐用性。結(jié)果鹽酸達(dá)克羅寧和醋酸氯己定含量的RSD分別為0.95%和1.37%（n= 9），表明不同色譜條件對測定結(jié)果均無顯著影響，方法耐用性良好。

2.4 樣品含量測定

取3 批（批號分別為150310，150416，150506）樣品各適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件分別進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計算鹽酸達(dá)克羅寧和醋酸氯己定的含量，結(jié)果見表2。

表2 鹽酸達(dá)克羅寧和醋酸氯己定含量測定結(jié)果（%）Tab.2 Results of content determination of dyclonine hydrochloride and chlorhexidine acetate（%）

3 討論

3.1 檢測波長選擇

樣品中鹽酸達(dá)克羅寧濃度是醋酸氯己定的10 倍，故同時測定鹽酸達(dá)克羅寧和醋酸氯己定時選擇醋酸氯己定的最大吸收波長（259 nm）作為檢測波長，此波長處鹽酸達(dá)克羅寧的吸光度也能滿足檢測要求。

3.2 色譜柱和流動相選擇

醋酸氯己定結(jié)構(gòu)中含有多個仲胺基和亞胺基，與硅膠表面的硅醇基有較強(qiáng)的氫鍵作用和親硅醇基效應(yīng)［14-16］，使用常用的十八烷基硅烷鍵合硅膠柱，并嘗試用不同流動相檢測醋酸氯己定，其色譜峰的拖尾均較嚴(yán)重。為了改善峰形，使各組分能選擇性地分離，選擇辛烷基硅烷鍵合硅膠柱，以甲醇- 0.02 mol/ L KH2PO4溶液為流動相。試驗中發(fā)現(xiàn)，降低流動相的pH能顯著改善醋酸氯己定的峰形，同時，考慮色譜柱對pH的耐受性，調(diào)節(jié)流動相pH 值至2.5。用以上色譜條件檢測樣品，可使干擾成分鞣酸在5 min 內(nèi)快速出峰，且大幅減少鞣酸的色譜峰拖尾，很好地解決了鞣酸對主成分測定的干擾，使鹽酸達(dá)克羅寧、醋酸氯己定和鞣酸的色譜峰均達(dá)到基線分離。

3.3 方法評價

本研究中所建立的方法專屬性強(qiáng)、分離度高，鹽酸達(dá)克羅寧和醋酸氯己定的保留時間適宜，其他組分干擾小，操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性、耐用性均良好，可用于提升口腔潰瘍油的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。