張家口地區(qū)甲癬病原真菌分布及藥物敏感性試驗研究*

吳遠(yuǎn)慧，馮冬梅，王世寧，陳雷剛，楊曉靜

（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北 張家口 075000）

甲癬是臨床較常見的皮膚科淺表真菌疾病，致病菌主要包括皮膚癬菌、酵母菌、霉菌等［1］，疾病進(jìn)展緩慢，病程反復(fù)［2］。隨著疾病的進(jìn)展，可累及患者的甲板及甲下組織，給患者的生理、心理造成一定影響。有研究報道，甲癬地域性差異顯著［3］。及時、有效分析甲癬病原真菌的分布及藥物敏感性，對于指導(dǎo)臨床用藥具有顯著意義。通常，溫暖潮濕的環(huán)境適宜真菌生長［4］。但張家口地區(qū)的氣候寒冷干燥，僅夏季為淺部真菌病高發(fā)季節(jié)，真菌性皮膚病的菌種分布可能與氣候濕熱地區(qū)有所不同，且國內(nèi)一直缺乏張家口地區(qū)淺部真菌病病原菌檢測及藥物敏感性試驗（簡稱藥敏試驗）分析相關(guān)的研究資料［5］。為此，本研究中分析了張家口地區(qū)甲癬病原真菌的培養(yǎng)鑒定及藥敏試驗結(jié)果，為臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入標(biāo)準(zhǔn)：確診為甲癬；符合淺部真菌?。ㄊ肿惆_、體癬、股癬、甲真菌?。┑呐R床表現(xiàn)，實驗性真菌鏡檢陽性。所有患者在張家口地區(qū)的分布性較均一。

排除標(biāo)準(zhǔn)：合并糖尿病、惡性腫瘤等慢性消耗性疾?。唤?jīng)過抗真菌治療。

病例選擇：采用描述性研究，選取我院2019年3月1日至2021年3月31日診治的甲癬患者512例。其中，男255例，女257例；年齡10～66歲，平均（33.26±2.59）歲；體質(zhì)量指數(shù)（24.55±2.65）kg/m2；病程（3.12±1.02）年；病灶部位的臨床癥狀主要包括甲板內(nèi)型、白色表淺型、全甲毀損型、近端甲下型、遠(yuǎn)端側(cè)位甲下型等。

1.2 研究方法

甲癬病原真菌培養(yǎng)與鑒定：取患者的皮屑，分別進(jìn)行直接鏡檢和真菌培養(yǎng)。直接鏡檢采取氫氧化鉀玻片法，以查到菌絲結(jié)構(gòu)為陽性結(jié)果。傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)及鑒定方法為，取標(biāo)本接種于含5×10-4g/L氯霉素的沙保弱瓊脂培養(yǎng)基斜面，置25～27 ℃恒溫培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）內(nèi)培養(yǎng)，觀察菌落生長情況，第4 周未生長者視為培養(yǎng)陰性。培養(yǎng)陽性者應(yīng)用馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基、玉米瓊脂培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基及尿素瓊脂培養(yǎng)基行真菌分離培養(yǎng)與鑒定。根據(jù)菌落的大小、形態(tài)、生長速度、色素和質(zhì)地，以及鏡下菌絲、孢子的形態(tài)特征鑒定菌種。必要時做玻片小培養(yǎng)，結(jié)合鏡下菌絲、孢子的形態(tài)和位置進(jìn)行鑒定。在超凈臺上挑取和轉(zhuǎn)種真菌，顯微鏡下觀察，用棉藍(lán)對挑取的菌落染色。記錄菌種鑒定結(jié)果。

采用新興的真菌核糖體DNA（rDNA）基因間隔序列（ITS）測定技術(shù)進(jìn)一步確定致病真菌類型。1）真菌DNA 的提?。悍謩e收集培養(yǎng)于沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上的真菌組織約100 mg，按照DNeasy Plant Mini Kit說明書提取菌株DNA，并利用E.Z.N.A.Micro Elute DNA CleanUp Kit 進(jìn)行基因組DNA 純化。所有操作按試劑盒說明書進(jìn)行，測量其濃度及純度。2）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)- 高分辨熔解曲線分析技術(shù)（PCR - HRM）分型鑒定：于生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，得出菌種鑒定結(jié)果，并與傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)與鑒定方法進(jìn)行比較，判斷結(jié)果是否一致。

藥敏試驗：采用抗真菌藥物紙片（杭州微生物試劑有限公司，批號為20181223）進(jìn)行藥敏試驗，選取張家口地區(qū)常用藥物克霉唑、咪康唑、氟康唑、灰黃霉素、兩性霉素、特比萘芬等。分別挑取菌落于1 mL 蒸餾水中，以獲得菌絲和分生孢子的混合菌液，沉淀30 min；均勻涂布Mueller Hinton（MH）瓊脂（英國Oxoid 公司，批號為20280930）平板；待平板干燥，將其置28 ℃溫度下培養(yǎng)5～10 d。當(dāng)平板生長時，測定抑菌環(huán)，得到藥敏試驗結(jié)果。分別對上述藥物的耐藥情況進(jìn)行比較。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。計數(shù)資料以率（%）表示，行χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 真菌培養(yǎng)與鑒定結(jié)果

經(jīng)過菌群培養(yǎng)與鑒定，共培養(yǎng)陽性菌群患者366例，檢出病原菌366株，主要檢出紅色毛癬菌、犬小孢子菌、念珠菌及絮狀表皮癬菌。詳見表1。

表1 真菌培養(yǎng)與鑒定結(jié)果（n=366）Tab.1 Results of fungal culture and identification（n=366）

2.2 患者性別分布

犬小孢子菌、鐵銹色小孢子菌以男性患者為主，青霉菌、念珠菌以女性患者為主。詳見表2。

表2 真菌培養(yǎng)與鑒定結(jié)果患者性別分布（例）Tab.2 Results of fungal culture and identification of patients with different genders（case）

2.3 患者年齡分布

患者主要以31～40歲的感染人群為主。詳見表3。

表3 真菌培養(yǎng)與鑒定結(jié)果患者年齡分布（例）Tab.3 Results of fungal culture and identification of patients with different ages（case）

2.4 陽性菌群患者藥敏試驗結(jié)果比較

藥敏試驗結(jié)果分析顯示，陽性菌群患者對克霉唑及咪康唑的耐藥率均在20%以上。詳見表4。

表4 藥敏試驗結(jié)果（n=366）Tab.4 Results of drug susceptibility test（n=366）

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查顯示，由甲真菌病造成的指甲疾病的發(fā)病率為15%～40%［6］。英國的甲真菌的發(fā)病率為3%，疾病的形成碼顯示，30%的患者多與足癬疾病顯著相關(guān)［7］。老年人及男性患者的發(fā)病率顯著高于其他人群［8］。同時，甲真菌病存在顯著地域性及種族性差異［9］。英國一項調(diào)查顯示，85%～90%的甲真菌病是由皮膚癬造成，而其他疾病則是由非皮膚癬菌疾病造成［10］。既往研究顯示，造成甲真菌病的致病菌主要包括紅色毛癬菌及須癬毛癬菌，而這類致病菌的感染多見于親動物性的皮膚感染。而遺傳學(xué)研究認(rèn)為，甲真菌病的易感性具有顯著遺傳學(xué)基礎(chǔ)，須癬毛癬菌及紅色毛癬菌具有顯著的家族遺傳性［11］。傳統(tǒng)的真菌鑒定方法為真菌培養(yǎng)后根據(jù)菌種的顯微鏡下形態(tài)進(jìn)行鑒別，以其形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)和生態(tài)學(xué)的特征為依據(jù)，簡單、易行、直觀，不需要昂貴的儀器，但在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)仍未普及［12］，導(dǎo)致真菌性皮膚病的診斷主要是通過臨床經(jīng)驗，常被誤診，且缺乏藥敏試驗，導(dǎo)致臨床用藥混亂，治愈率低。

本研究中，共培養(yǎng)陽性菌群患者366例，其陽性檢出率在70%以上，與既往研究結(jié)果［13］一致。而在對陽性菌群患者的研究中，主要以紅色毛癬菌、犬小孢子菌、念珠菌及絮狀表皮癬菌為主，提示張家口地區(qū)的真菌感染主要以上述病原微生物為主。張蕊娜等［14］的研究顯示，不管是老年人群，還是非老年人群，甲真菌病患者的主要致病菌均主要為紅色毛癬菌。鄭文愛等［15］對351株甲真菌病病原菌進(jìn)行了體外藥敏試驗，結(jié)果紅色毛癬菌和指（趾）間毛癬菌對特比萘芬的最低抑菌濃度幾何均數(shù)最低。本研究中，張家口地區(qū)對兩性霉素及特比萘芬的耐藥情況顯著降低，提示臨床治療首選兩性霉素和特比萘芬，與鄭文愛等［15］、楊虹霞［16］的研究結(jié)果較一致。不同性別、年齡患者的致病菌的感染情況呈顯著差異，提示在治療中應(yīng)根據(jù)患者的年齡、性別調(diào)整治療方式。

臨床皮膚科門診真菌性皮膚病病種多，病情復(fù)雜，并可能同時合并細(xì)菌或繼發(fā)其他微生物感染，臨床用藥復(fù)雜多樣，多有耐藥現(xiàn)象，為治療真菌性皮膚病帶來了難度，易延誤患者的治療，導(dǎo)致病情反復(fù)不愈［17］。尤其是基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)缺乏真菌鏡檢、培養(yǎng)及鑒定技術(shù)，且傳統(tǒng)的真菌鑒定方法在一定程度上受人為因素的干擾較大。本研究中，通過對患者的致病菌的核酸檢測，并進(jìn)一步核對致病微生物，提高了本研究結(jié)果的準(zhǔn)確性［18］。

綜上所述，張家口地區(qū)甲癬病原真菌以犬小孢子菌及紅色毛癬菌為主，對兩性霉素、特比萘芬的耐藥性較低。臨床需加強甲癬病原菌的檢測與鑒別，選擇治療藥物時可選擇耐藥性較低者，提高治療效率。