丙基菊粉納米粒子作為益生元對(duì)植物乳桿菌抑菌性能的影響

劉曦宇 杜麗欣 萬(wàn)入?yún)R 鄒 雪 張建斌 蒲 蕾 馬吉飛 胡德寶 洪 亮

(天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300392)

抗生素作為一種具有預(yù)防、治療和促生長(zhǎng)作用的藥物，被廣泛應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中，推進(jìn)了畜牧業(yè)的發(fā)展。然而，部分畜牧工作者大量使用、甚至濫用抗生素，導(dǎo)致病原菌耐藥性和抗生素殘留的問(wèn)題愈發(fā)嚴(yán)重。繼歐美國(guó)家陸續(xù)禁止在飼料中添加抗生素作為促生長(zhǎng)類藥物之后，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也宣布，自2020年1月1日起，我國(guó)飼料中全面禁止添加所有促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑。在“禁抗”的大環(huán)境下，合生元(synbiotics)作為主要的綠色飼料添加劑之一而備受關(guān)注。合生元又稱合生素，是由益生菌和益生元組合而成的混合制劑。益生菌和益生元的使用往往具有替代抗生素促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)及提高動(dòng)物機(jī)體免疫力的作用[1]。之前已有研究，如由納豆菌和甘露寡糖[2]、芽孢桿菌和果寡糖[3]組成的合生元，能調(diào)控畜禽消化道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境，提高生長(zhǎng)性能。

益生菌是一種對(duì)畜禽生長(zhǎng)和發(fā)育有促進(jìn)作用的微生物，通常有乳酸菌、芽孢菌和酵母菌三大類，功能主要體現(xiàn)在防控疾病、增加營(yíng)養(yǎng)、促進(jìn)黏膜免疫、抵抗應(yīng)激和促進(jìn)飼料的消化等方面[4]。植物乳桿菌是乳酸菌的一種，不但能分解飼料中的蛋白質(zhì)、糖類，并具有合成維生素[5]、促進(jìn)動(dòng)物的消化吸收、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、增強(qiáng)動(dòng)物免疫力、提高生長(zhǎng)性能等諸多功能[6]，還有很好的遺傳穩(wěn)定性[7]和熱穩(wěn)定性[8]，有非常強(qiáng)的殺菌能力，尤其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性病原菌有很好的控制能力[9]，被認(rèn)為是最理想的益生菌之一。

益生元是對(duì)調(diào)節(jié)腸道功能和維持腸道微生態(tài)平衡有重要作用的因子，可被益生菌利用從而促進(jìn)益生菌生長(zhǎng)，具有增加益生菌菌群數(shù)量以及發(fā)酵產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸等作用[3]。大多數(shù)益生元是基于菊粉的果糖低聚物或低聚半乳糖。菊粉是一種天然果糖聚合物，被認(rèn)為具有調(diào)節(jié)消化道微生物區(qū)系的作用，是促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)和抑制有害菌生長(zhǎng)的益生元[10]。菊粉幾乎不被胃酸水解和消化，而在結(jié)腸中被大量有益微生物發(fā)酵生成短鏈脂肪酸，在動(dòng)物的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。據(jù)研究，丙酸可作為有效的免疫調(diào)節(jié)輔助因子，攝入丙酸后，不僅可使調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的線粒體功能和形態(tài)正常化，還能使腸道中T細(xì)胞誘導(dǎo)基因的表達(dá)增加，使T細(xì)胞數(shù)量顯著增加，而輔助性T細(xì)胞1(Th1)和輔助性T細(xì)胞17(Th17)數(shù)量顯著減少[11]，此外，丙酸可通過(guò)提高緊密連接蛋白的表達(dá)提高腸道屏障的功能[12]。

近年來(lái)，許多研究人員已經(jīng)開(kāi)始合成和應(yīng)用基于多糖的自組裝納米顆粒的藥物傳遞系統(tǒng)。由疏水核和親水殼組成的自組裝聚合物納米顆粒，由于其在疏水核內(nèi)負(fù)載藥物后能迅速被哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)吞，現(xiàn)已成為一種很有前途的藥物載體[13]。但本試驗(yàn)合成的丙基菊粉納米粒子(propyl-inulin nanoparticles，IPrN)不是藥物或基因載體，而是作為一種新型的益生元?jiǎng)┬吞骄科渥饔脵C(jī)理。因此，本試驗(yàn)旨在研究由菊粉和丙酸酐合成的丙基菊粉納米粒子處理后的植物乳桿菌的抑菌活性，為畜牧業(yè)開(kāi)發(fā)一種新型替代抗生素的益生元?jiǎng)┬吞峁┧悸贰?/p>

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

菊粉、N,N-二甲基甲酰胺、醋酸鈉、熒光染色劑[4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、異硫氰酸熒光素(FITC)]購(gòu)于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，MRS肉湯/瓊脂、LB肉湯、麥康凱瓊脂購(gòu)于上海玉博生物科技有限公司。主要儀器包括共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)(德國(guó)奧博科亨卡爾·蔡司股份公司)、電子顯微鏡(SEM)(德國(guó)奧博科亨卡爾·蔡司股份公司)、Avance Ⅱ 600MHz核磁共振波譜儀(AVANCE 600，瑞士布魯克公司)、動(dòng)態(tài)光散射粒度分析儀(DLS-7000，日本大塚電子公司)。

1.2 合成丙基菊粉(PI)

準(zhǔn)確稱取1 g菊粉投加到250 mL三口燒瓶中，添加10 mL N,N-二甲基甲酰胺和催化劑醋酸鈉，氮?dú)獯等? min。加熱至40 ℃時(shí)投入適量丙酐并氮?dú)獯等? min后反應(yīng)24 h，在4 ℃環(huán)境下將反應(yīng)產(chǎn)物置于蒸餾水中透析，過(guò)濾未反應(yīng)的丙酐與有機(jī)溶劑，將得到的產(chǎn)物進(jìn)行冷凍干燥。將冷凍干燥產(chǎn)物溶解于N,N-二甲基甲酰胺蒸餾水中進(jìn)行第二次透析，在4 ℃溫度條件下攪拌，過(guò)夜。將得到的產(chǎn)物冷凍干燥保存，得到丙基菊粉納米粒子(圖1-A)，丙酐與菊粉合成的化學(xué)式見(jiàn)圖1-B。

圖1 丙基菊粉的合成試驗(yàn)步驟(A)和合成原理(B)

1.3 丙基菊粉物理特性的鑒定

丙基菊粉中丙基的置換率通過(guò)600 MHz1H-核磁共振(NMR)光譜確認(rèn)。使用掃描電子顯微鏡分析丙基菊粉的表面形貌。用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)測(cè)量丙基菊粉納米粒子的尺寸。

1.4 通過(guò)CLSM確定納米粒子的內(nèi)化

制備FITC標(biāo)記的丙基菊粉。將5 mg FITC與100 mg丙基菊粉混合溶解在2 mL二甲基亞砜中，室溫下在不透明管中攪拌4 h，在4 ℃條件下將產(chǎn)物用蒸餾水透析24 h，將FITC標(biāo)記的丙基菊粉凍干并保存在20 ℃下備用。

為了觀察植物乳桿菌對(duì)丙基菊粉的內(nèi)化，將植物乳桿菌(2.0×106CFU/mL)接種到1 mL MRS肉湯中，用0.5%(w/v)FITC標(biāo)記的丙基菊粉在37 ℃條件下溫育2 h。用磷酸鹽緩沖溶液洗滌樣品，并通過(guò)CLSM分析。為了證實(shí)納米顆粒內(nèi)化到植物乳桿菌中，在CLSM中通過(guò)Z-截面模式觀察用FITC標(biāo)記丙基菊粉處理的植物乳桿菌[8]。

1.5 丙基菊粉納米粒子對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酸的影響

分別分析加入菊粉的植物乳桿菌試驗(yàn)組、加入丙基菊粉的植物乳桿菌試驗(yàn)組和植物乳桿菌對(duì)照組，通過(guò)測(cè)量其生長(zhǎng)培養(yǎng)基的pH和指定時(shí)間點(diǎn)的乳酸菌活細(xì)胞數(shù)來(lái)檢查不同益生元制劑對(duì)植物乳桿菌的生長(zhǎng)特征及產(chǎn)乳酸的影響[9]。

1.6 通過(guò)共培養(yǎng)法和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)分析植物乳桿菌的抑菌能力

參考了共培養(yǎng)法[10]和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)[11]測(cè)定植物乳桿菌對(duì)大腸桿菌K88和雞沙門氏菌的抑菌活性的方法，本試驗(yàn)中做了一些改動(dòng)。2.0×106CFU/mL的大腸桿菌K88分別與加入0.5%(w/v)菊粉或丙基菊粉納米粒子的植物乳桿菌、以及未作處理的植物乳桿菌進(jìn)行共培養(yǎng)，置于37 ℃震蕩培養(yǎng)箱(250 r/min)中振蕩8 h。將其共培養(yǎng)的培養(yǎng)液涂布在麥康凱瓊脂上，37 ℃下培養(yǎng)24 h，計(jì)大腸桿菌K88的菌落數(shù)，抑菌活性是由病原菌的存活率決定。植物乳桿菌對(duì)雞沙門氏菌的抑菌活性也通過(guò)上述的共培養(yǎng)法來(lái)確定。

瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)：將100 μL大腸桿菌K88原液(2.0×108CFU/mL)涂布在LB瓊脂上，放置藥敏紙片。將使用0.5%(w/v)菊粉或丙基菊粉納米粒子處理的植物乳桿菌和未處理的植物乳桿菌培養(yǎng)液滴加到藥敏紙片上。藥敏紙片在室溫下干燥后，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。通過(guò)抑菌圈的大小判斷植物乳桿菌的抑菌能力。用同樣的方法評(píng)判植物乳桿菌對(duì)雞沙門氏菌生長(zhǎng)的抑制作用。用1 mg/mL蛋白酶K處理使用0.5%(w/v)菊粉或丙基菊粉納米粒子處理的植物乳桿菌和未處理的植物乳桿菌培養(yǎng)液，在37 ℃條件下培養(yǎng)2 h后將每種培養(yǎng)液的上清液在100 ℃條件下加熱30 min。再用上述方法進(jìn)行植物乳桿菌對(duì)大腸桿菌K88和雞沙門氏菌的瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010軟件進(jìn)行處理后，采用GraphPad Prism軟件進(jìn)行單因素方差分析。P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 丙基菊粉的合成

首先化學(xué)合成了丙基菊粉，并對(duì)其進(jìn)行了核磁共振氫譜分析。結(jié)果表明，丙基在菊粉的取代率為76.88 mol%(圖2-A)。在電鏡下成像可觀察到球形粒子(圖2-B)。進(jìn)一步通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射試驗(yàn)測(cè)出了其直徑為366.6 nm(圖2-C)。

圖2 通過(guò)600 MHz 1H-核磁共振(NMR)光譜(A)、發(fā)射掃描電子顯微鏡(B)、動(dòng)態(tài)光散射(DLS)試驗(yàn)(C)鑒定丙基菊粉的物理特性

2.2 共聚焦內(nèi)化分析

為了證實(shí)植物乳桿菌對(duì)丙基菊粉納米粒子的內(nèi)化，首先通過(guò)不同染色劑對(duì)植物乳桿菌和丙基菊粉納米粒子進(jìn)行染色，可觀察到DAPI熒光和FITC熒光信號(hào)重合在一起(圖3)。為了進(jìn)一步探究丙基菊粉納米粒子是否位于植物乳桿菌表面，在CLSM中通過(guò)Z-截面模式可觀察到FITC的熒光在植物乳桿菌的中心處最強(qiáng)，結(jié)果表明丙基菊粉納米粒子進(jìn)入到了植物乳桿菌內(nèi)(圖4)。

DAPI：4’，6-二脒基-2-苯基吲哚 4’,6-diamidino-2-phenylindole；2，F(xiàn)ITC：異硫氰酸熒光素 fluorescein isothiocyanate；Scale bar：比例尺。

IPrN：丙基菊粉納米粒子 propyl-inulin nanoparticle；FITC：異硫氰酸熒光素 fluorescein isothiocyanate； LP：植物乳桿菌 Lactobacillus plantarum； DAPI：4’,6-二脒基-2-苯基吲哚 4’,6-diamidino-2-phenylindole；Scale bar：比例尺。

2.3 丙基菊粉納米粒子對(duì)植物乳桿菌的抑菌能力的影響

為了評(píng)估丙基菊粉納米粒子的內(nèi)化作用對(duì)植物乳桿菌的抑菌能力是否有影響，通過(guò)檢測(cè)共培養(yǎng)法中病原體的活細(xì)胞數(shù)和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)中抑菌圈大小來(lái)分析植物乳桿菌對(duì)大腸桿菌K88和雞沙門氏菌的抑菌能力的影響。由圖5可見(jiàn)，通過(guò)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果顯示，植物乳桿菌、加入菊粉的植物乳桿菌以及加入丙基菊粉的植物乳桿菌均表現(xiàn)出抑菌能力，但菊粉的添加對(duì)植物乳桿菌的抑菌能力沒(méi)有影響，而添加丙基菊粉納米粒子的植物乳桿菌的抑菌圈相對(duì)較大，表明其抑菌能力比植物乳桿菌和加入菊粉的植物乳桿菌有了提升，且對(duì)雞沙門氏菌表現(xiàn)出的抑菌能力有顯著提升(P<0.05)。此外，共培養(yǎng)試驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)估了其抑菌能力，結(jié)果顯示，當(dāng)丙基菊粉納米粒子處理植物乳桿菌時(shí)，病原體的活細(xì)胞數(shù)目比植物乳桿菌和加入菊粉處理的植物乳桿菌的活細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P<0.05)，且對(duì)于雞沙門氏菌有顯著抑菌能力(P<0.05)。

SG：雞沙門氏菌 Salmonella galiranum；E. coli：大腸桿菌K88 Escherichia coli K88；LP：植物乳桿菌Lactobacillus plantarum；LP/I：植物乳桿菌/菊粉 Lactobacillus plantarum/inulin；LP/IPrN：植物乳桿菌/丙基菊粉納米粒子 Lactobacillus plantarum/propyl-inulin nanoparticles。

2.4 丙基菊粉納米粒子對(duì)植物乳桿菌的作用機(jī)制

通過(guò)在不同時(shí)間點(diǎn)計(jì)數(shù)菌落的形成單位來(lái)研究丙基菊粉納米粒子對(duì)植物乳桿菌的生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示(圖6-A)，添加菊粉或丙基菊粉納米粒子對(duì)植物乳桿菌的生長(zhǎng)沒(méi)有影響。進(jìn)一步測(cè)定了處理后植物乳桿菌培養(yǎng)基的pH以評(píng)估菊粉或丙基菊粉的添加對(duì)其乳酸產(chǎn)生的影響，結(jié)果顯示(圖6-B)，不同處理對(duì)植物乳桿菌的乳酸產(chǎn)生沒(méi)有直接影響。因此，丙基菊粉納米粒子的內(nèi)化對(duì)植物乳桿菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸沒(méi)有影響。為了測(cè)試植物乳桿菌是否通過(guò)分泌細(xì)菌素發(fā)揮其抑菌能力，先在菊粉、丙基菊粉處理的植物乳桿菌和未處理的植物乳桿菌中加入蛋白酶K，之后進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，可觀察到添加蛋白酶K的3組的抑菌能力基本相等，且抑菌能力明顯小于未添加蛋白酶K的處理(圖6-C、圖6-D)，結(jié)果表明影響抑菌能力的主要物質(zhì)為細(xì)菌素。為了進(jìn)一步證實(shí)細(xì)菌素的表達(dá)，可知編輯植物乳桿菌細(xì)菌素的基因?yàn)閜lanS，通過(guò)熒光定量PCR法檢測(cè)到植物乳桿菌在處理丙基菊粉納米粒子后planS的基因表達(dá)水平顯著提高(P<0.05)，即丙基菊粉納米粒子的加入可有效提高植物乳桿菌細(xì)菌素的表達(dá)，planS的基因表達(dá)水平清楚地證實(shí)丙基菊粉納米粒子處理的植物乳桿菌的細(xì)菌素表達(dá)量增多(圖6-E)。

LP：植物乳桿菌 Lactobacillus plantarum；LP/I：植物乳桿菌/菊粉 Lactobacillus plantarum/inulin；LP/IPrN：植物乳桿菌/丙基菊粉納米粒子 Lactobacillus plantarum/propyl-inulin nanoparticles；PK：蛋白酶K proteinase K。

3 討 論

世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)表明，抗生素的濫用是病原微生物產(chǎn)生耐藥性的主要原因。抗生素耐藥性不僅影響家畜健康，也影響人類健康，且在很多國(guó)家中已經(jīng)被禁用[14]。一些研究已經(jīng)證明益生菌已成為一種潛在的替抗物質(zhì)，因?yàn)樗鼈兡軌蛞种颇c道內(nèi)的細(xì)菌定植或通過(guò)其分泌的細(xì)菌素直接殺死病原體[15]。因此，研究人員已經(jīng)進(jìn)行了許多嘗試來(lái)提高細(xì)菌素的產(chǎn)生，其中包括生物和物理方法。以益生菌和益生元組合而成的合生元就是生物方法之一[16]。益生元通常被定義為非消化性化合物，通過(guò)選擇性的刺激腸胃中1種或幾種細(xì)菌的生長(zhǎng)與活性而對(duì)寄主產(chǎn)生有益的影響，從而改善家畜寄主腸道健康。一些益生元也可以被腸道菌群發(fā)酵產(chǎn)生以乙酸、丙酸和丁酸為主的短鏈脂肪酸，在宿主能量代謝和免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用。短鏈脂肪酸在腸道內(nèi)參與三羧酸循環(huán)和門靜脈循環(huán)為機(jī)體供能，可促進(jìn)白細(xì)胞介素-10(IL-10)等抗炎因子生成，增強(qiáng)腸道免疫機(jī)能。此外，短鏈脂肪酸還可以通過(guò)促進(jìn)5-羥色胺(5-HT)合成進(jìn)而激活迷走神經(jīng)來(lái)調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力[17]。

在本試驗(yàn)研究中，利用丙酸合成了丙基菊粉納米粒子作為益生元，通過(guò)改良益生元的劑型來(lái)提高益生菌的抑菌活性。其基于自組裝納米顆粒的形式進(jìn)行內(nèi)化，因方法簡(jiǎn)單，可更廣泛的應(yīng)用于臨床。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的研究已經(jīng)證實(shí)了納米粒子如何進(jìn)入到細(xì)胞中[18]，而聚合物納米粒子可以將治療藥物遞送到必要的作用位置[19]，并且可以用于在遞送疏水性藥物時(shí)克服細(xì)胞屏障[20]，然而除了金屬納米粒子外，原核生物如何將益生元納米顆粒內(nèi)化的研究仍處于早期。本試驗(yàn)只從共聚焦結(jié)果中得出益生元納米粒子內(nèi)化作用完成，并未深入研究證明其內(nèi)化的過(guò)程和機(jī)制。接下來(lái)，我們將進(jìn)一步探究乙酸化菊粉和丁酸化菊粉是否能形成納米顆粒，并進(jìn)一步探索短鏈脂肪酸化納米顆粒進(jìn)入益生菌以及其提高益生菌抑菌能力的機(jī)制。探明其作用機(jī)理對(duì)益生元材料的改良和新型合生元制劑的研發(fā)具有重要意義。

本研究的另一個(gè)目標(biāo)是評(píng)估益生元對(duì)益生菌抑菌特性的影響。試驗(yàn)中選用益生菌的原因在于其能分泌天然的抑菌物質(zhì)，而益生元是用來(lái)提高益生菌的抑菌能力，其主要具有增強(qiáng)益生菌或腸道中其他有益菌的活性或生長(zhǎng)速度等功能。

益生菌分泌細(xì)菌素屬于自身防御機(jī)制[21]。丙基菊粉納米粒子的直徑為366.6 nm，當(dāng)植物乳桿菌對(duì)其進(jìn)行內(nèi)化時(shí)，對(duì)于植物乳桿菌來(lái)說(shuō)屬于相對(duì)龐大的一種入侵物質(zhì)，使植物乳桿菌在有壓強(qiáng)環(huán)境中產(chǎn)生對(duì)抗性，從而刺激提高細(xì)菌素的分泌。此外，細(xì)菌產(chǎn)生細(xì)菌素的機(jī)制是通過(guò)調(diào)控自身的群體感應(yīng)機(jī)制，因此，我們猜測(cè)顆?；嫔罅看嬖谟谥参锶闂U菌的周圍環(huán)境，可能觸發(fā)了植物乳桿菌的群體感應(yīng)機(jī)制使其分泌出大量的細(xì)菌素[22-23]。將來(lái)我們要進(jìn)一步驗(yàn)證未經(jīng)透析的直鏈益生元與顆?；嫔膬?nèi)吞與否是否會(huì)改變植物乳桿菌群體感應(yīng)機(jī)制相關(guān)基因的表達(dá)。雖然益生元納米顆粒刺激植物乳桿菌的細(xì)菌素分泌，但沒(méi)有影響其生長(zhǎng)和乳酸的分泌。與菊粉單獨(dú)處理植物乳桿菌相比，用丙基菊粉納米粒子處理植物乳桿菌增強(qiáng)了其對(duì)大腸桿菌K88和雞沙門氏菌的抑菌活性，且對(duì)植物乳桿菌不顯示毒性。通過(guò)planS的基因表達(dá)證實(shí)丙基菊粉納米粒子的內(nèi)化增加了植物乳桿菌細(xì)菌素的產(chǎn)生。

最終，以聚合物納米顆粒為益生元可以對(duì)益生菌產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性影響，通過(guò)提高益生菌細(xì)菌素的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)抑菌能力。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)植物乳桿菌對(duì)丙基菊粉納米粒子的內(nèi)化產(chǎn)生的溫和應(yīng)激，提高了細(xì)菌素的產(chǎn)量，使其抑菌能力提高。益生元納米粒子和益生菌作為新型的合生元組合，為抗生素替代劑的研發(fā)提供了新思路。