銀甲片對(duì)盆腔炎性疾病大鼠模型炎性因子及輸卵管纖毛形態(tài)的影響研究

鄧蒂斯，黃葉芳，龔道銀

(成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610075)

盆腔炎性疾病(Pelvic Inflammatory Disease,PID)是女性上生殖道感染引起的一組疾病，包括子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎、輸卵管卵巢膿腫和盆腔腹膜炎[1]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為PID屬于“婦人腹痛”“帶下病”等范疇。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)[2]輸卵管炎會(huì)損害正常的輸卵管功能，并導(dǎo)致精子受精能力下降，是導(dǎo)致人類(lèi)和模型動(dòng)物生育力低下和不孕的主要原因。炎癥的刺激會(huì)導(dǎo)致輸卵管黏膜受損，甚至粘連、堵塞，纖毛也常伴缺損，導(dǎo)致纖毛活動(dòng)障礙和分泌減少[3]。纖毛粘連導(dǎo)致細(xì)胞纖毛運(yùn)動(dòng)受阻，影響精子和卵細(xì)胞運(yùn)輸及受精過(guò)程[4-5]。銀甲片是以川派婦科名醫(yī)王渭川經(jīng)驗(yàn)方研制而成，現(xiàn)為成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑。依據(jù)川派婦科醫(yī)家多年臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，銀甲片治療濕熱瘀結(jié)型PID臨床療效顯著，但具體機(jī)制仍不明確。本研究以銀甲片降低炎性因子水平及輸卵管纖毛形態(tài)為切入點(diǎn)，初探銀甲片對(duì)輸卵管炎的治療作用機(jī)制，以期為銀甲片治療輸卵管炎提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

7-8周齡SPF級(jí)SD雌性大鼠60只，體質(zhì)量(200±10)g(四川省中醫(yī)藥科學(xué)院提供，許可證號(hào)：SYXK(川)2013-100)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

婦科千金片(株洲千金藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：0.32 g×18片×6板，生產(chǎn)批號(hào)：201510021)；銀甲片(成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，川藥制字，規(guī)格：0.6 g×100片，生產(chǎn)批號(hào)：Z20070650)：每片含0.6 g原生藥。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

腫瘤壞死因子α(Tumor Necrosis Factor α,TNF-α)、超敏C-反應(yīng)蛋白(High Sensitivity C-reactive Protein,hs-CRP)、白細(xì)胞介素6(Interleukin 6,IL-6)、白細(xì)胞介素1β(Interleukin 1β,IL-1β)Elisa試劑盒(上海茁彩生物，生產(chǎn)批號(hào)：ZC-37624，ZC-36450，ZC-36404，ZC-36391)；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：K135925C)；PBS(北京中杉金橋生物有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：ZLI-9062)。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)(型號(hào)：TDZ5-WS，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；石蠟包埋機(jī)(型號(hào)：EG1160，德國(guó)徠卡儀器有限公司)；石蠟切片機(jī)(型號(hào):BM-2135,德國(guó)徠卡儀器有限公司)；奧林巴斯光學(xué)顯微鏡(型號(hào)：BX41，奧林巴斯株式會(huì)社)；自動(dòng)酶標(biāo)儀(型號(hào)：Infinite M200 pro，瑞士帝肯集團(tuán)公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組

以隨機(jī)數(shù)字表法將正常的SD雌性大鼠以1∶5比例分為空白組和造模組。造模后以隨機(jī)數(shù)字表法將造模成功大鼠等分為5組：模型組、銀甲片低劑量組(以下簡(jiǎn)稱(chēng)低劑量組)、銀甲片中劑量組(以下簡(jiǎn)稱(chēng)中劑量組)、銀甲片高劑量組(以下簡(jiǎn)稱(chēng)高劑量組)、婦科千金片組(以下簡(jiǎn)稱(chēng)對(duì)照組)，加上空白組，共6組，每組8只，共48只大鼠。

2.2 給藥方法

2.2.1 造模方法[6]:造模組大鼠腹腔注射1.5 %戊巴比妥納(40 mg/kg)麻醉后下腹常規(guī)消毒，縱向1 cm切口暴露子宮，經(jīng)子宮以4號(hào)針頭進(jìn)針，分別向兩側(cè)卵巢方向緩慢注入25 %苯酚膠漿共0.04 mL，分層關(guān)腹。術(shù)后2只/籠分籠正常飼養(yǎng)，每日消毒護(hù)理。造模后無(wú)大鼠死亡，其中2只大鼠傷口膿腫。模型判定標(biāo)準(zhǔn)：肉眼見(jiàn)輸卵管、卵巢腫大，輸卵管、卵巢粘連，病理學(xué)結(jié)果顯示子宮炎細(xì)胞浸潤(rùn)，輸卵管、卵巢周?chē)馨图?xì)胞為主的慢性炎細(xì)胞增多。

2.2.2 治療方法：模型組和空白組以10 mL/(kg·d)灌胃蒸餾水；對(duì)照組每天以4片/kg即1.28 g/kg(相當(dāng)于成人等效劑量20倍)脫賦形劑后等體積灌胃婦科千金片(脫賦形劑方法：實(shí)驗(yàn)前將藥物研磨后溶解于蒸餾水中，置電爐加熱至沸騰，冷卻后以2 000 r/min(離心半徑15 cm)離心5 min，上清液分裝，保存?zhèn)溆?。高劑量組以按原生藥1.52 g/(kg·d)灌服中藥(基于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物“體表面積與劑量換算”原則，相當(dāng)于成人臨床劑量20倍)。中劑量組同上法按原生藥0.76 g/(kg·d)灌服中藥，相當(dāng)于成人臨床劑量10倍；低劑量組同上法按原生藥0.38 g/(kg·d)灌服中藥，相當(dāng)于成人臨床劑量5倍；1次/d，每日以每100 g大鼠1 mL等體積灌胃，灌胃7 d后停藥1 d，7 d為1個(gè)周期，共灌胃觀察3個(gè)周期。

2.3 取材方法

大鼠最后一次給藥24 h后，麻醉后股動(dòng)脈取血，室溫下放置1 h，再以2 000 r/min(離心半徑15 cm)離心10 min，分離血清后存入-80 ℃?zhèn)溆谩Ｂ樽砗箢i椎脫臼法處死后剖開(kāi)腹腔，取雙側(cè)輸卵管、卵巢與子宮，于10 %中性甲醛固定于4 ℃保存。

2.4 檢測(cè)方法

將處理干凈的輸卵管、卵巢與子宮經(jīng)常規(guī)脫水、透明石蠟包埋，制作病理切片，HE染色。光鏡下觀察輸卵管、卵巢與子宮形態(tài)學(xué)改變(由于銀甲片中劑量與低劑量組肉眼觀測(cè)改善不明顯，因此僅予高劑量組進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察)。按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)孔及測(cè)定孔，分批次加入親和物、底物及終止液，于酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回歸方程后，帶入OD值獲得樣本濃度。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 輸卵管、卵巢及子宮肉眼下改變

肉眼觀察見(jiàn)：空白組輸卵管、卵巢及子宮組織新鮮，均呈淡紅色，輸卵管呈花環(huán)樣緊貼卵巢，子宮管徑纖細(xì)，肌肉豐滿。模型組輸卵管、卵巢及子宮色澤蒼白，輸卵管、卵巢腫大，輸卵管與卵巢粘連明顯，子宮管徑增粗。與模型組相比較，高、中劑量組輸卵管、卵巢及子宮水腫減輕，減輕程度與劑量相關(guān)，高劑量組輸卵管、卵巢及子宮呈淡白色，組織肌肉薄，輸卵管粘連不明顯；中劑量組充血較明顯，輸卵管與卵巢存在部分粘連；低劑量組改善不明顯。與對(duì)照組相較，高劑量組卵巢充血、子宮水腫減輕更顯著(見(jiàn)圖1)。

注：A為空白組，B為模型組，C為高劑量組，D為中劑量組，E為低劑量組，F(xiàn)為對(duì)照組

3.2 輸卵管、卵巢組織形態(tài)學(xué)改變

光鏡下見(jiàn)：空白組輸卵管纖毛清晰、排列整齊，輸卵管黏膜層、環(huán)縱層肌肉組織清晰，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)水腫、充血。模型組輸卵管與卵巢纖維結(jié)締組織增生明顯，周?chē)馨图?xì)胞為主的慢性炎細(xì)胞增多，組織疏松、水腫，小血管擴(kuò)張淤血顯著；輸卵管黏膜皺襞萎縮，纖毛細(xì)胞部分倒伏、脫落，肌層肌平滑肌厚薄不一，部分?jǐn)嗔?；卵巢組織疏松、水腫明顯，髓質(zhì)內(nèi)纖維結(jié)締組織及慢性炎細(xì)胞明顯增多；與模型組相較，高劑量組灶性組織充血、水腫，但輸卵管黏膜皺襞萎縮，纖毛細(xì)胞倒伏、脫落、肌層平滑肌局灶性厚薄不一、纖維斷裂顯著減輕，卵巢組織皮髓質(zhì)分界清楚，髓質(zhì)纖維組織增生減少，輸卵管及卵巢炎性細(xì)胞均顯著減少。與對(duì)照組相較，高劑量組卵巢組織皮髓質(zhì)分界較清，輸卵管纖毛形態(tài)恢復(fù)更顯著(見(jiàn)圖2～3)。

注：左側(cè)圖HE×100，右側(cè)局部放大圖HE×400；A為空白組，B為模型組，C為高劑量組，D為對(duì)照組

注：HE×100；A為空白組，B為模型組，C為高劑量組，D為對(duì)照組

3.3 子宮組織形態(tài)學(xué)改變

光鏡下見(jiàn)：空白組子宮組織結(jié)構(gòu)清晰，腺體、血管豐富，模型組子宮黏膜組織結(jié)構(gòu)模糊，肌層組織疏松水腫，間質(zhì)增多，纖維組織增生，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組相較，高劑量組黏膜組織纖維化及肌層組織水腫減輕，腺體及血管結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞間質(zhì)較疏松，炎性細(xì)胞顯著減少。與對(duì)照組相較，高劑量組黏膜組織纖維化、肌層組織水腫程度均更低，腺體及血管結(jié)構(gòu)欠清晰且形態(tài)欠佳，炎性細(xì)胞減少程度近似(見(jiàn)圖4)。

注：HE×100，A為空白組，B為模型組，C為高劑量組，D為對(duì)照組

3.4 血清炎性因子

與空白組比較，模型組TNF-α、hs-CRP、IL-6、IL-1β的水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，高劑量組、中劑量組、低劑量組、對(duì)照組TNF-α、hs-CRP、IL-6、IL-1β水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖5，表1)。

表1 銀甲片對(duì)血清炎性因子的影響

注：n=8，與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

4.1 濕熱瘀結(jié)型PID的中醫(yī)病因病機(jī)

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為：因攝生不慎、房事不潔，或經(jīng)期、產(chǎn)后、流產(chǎn)后及各種宮腔手術(shù)操作后導(dǎo)致脈胞空虛，濕熱之邪經(jīng)陰戶侵襲胞宮絡(luò)脈，留滯體內(nèi)。且因濕為陰邪，其性重濁趨下，易襲陰位，生殖道位居下焦，最易遭受濕邪侵襲。濕熱邪氣相搏，郁結(jié)不散而化瘀，瘀阻胞宮胞脈，不通則痛，發(fā)為盆腔炎。

4.2 銀甲片治療PID的中醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)

銀甲片源自川派婦科名家王渭川經(jīng)驗(yàn)方，主治濕熱瘀結(jié)下焦諸證，類(lèi)如西醫(yī)診斷之“盆腔炎”“子宮內(nèi)膜炎”“輸卵管不通”等[7]。銀甲片藥物組成：草紅藤、蒲公英、紫花地丁、茵陳、大青葉、蒲黃、鱉甲、琥珀、敗醬草、忍冬藤、姜黃、夏枯草、川楝子。方中蒲公英、紫花地丁、草紅藤、敗醬草、大青葉清熱解毒，消腫散結(jié)，利尿通淋，涼散風(fēng)熱，效專(zhuān)而力宏；茵陳清熱亦可除濕，可用于各種濕瘡瘙癢；蒲黃活血化瘀，善治氣血不和、瘀血腹疼，姜黃破血行氣，通經(jīng)止痛，兩藥共奏活血化瘀之功，附以夏枯草散結(jié)消腫，川楝子疏肝行氣止痛。全方共奏清熱利濕化瘀之功，療效顯著。既往臨床及實(shí)驗(yàn)研究已確定其對(duì)慢性盆腔炎性疾病的療效[8-9]。

4.3 研究結(jié)果分析

從組織形態(tài)學(xué)看，銀甲片對(duì)輸卵管、卵巢及子宮的組織形態(tài)恢復(fù)存在差異。經(jīng)銀甲片治療后輸卵管纖毛組織水腫、充血顯著改善，但纖維化仍存在，輸卵管肌層較正常大鼠薄，既往研究認(rèn)為可能與炎癥引起的端粒細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷相關(guān)[10]。纖毛是上皮細(xì)胞頂端表面的微管結(jié)構(gòu)，輸卵管纖毛結(jié)構(gòu)將影響輸卵管液、表皮細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)[11]，正常結(jié)構(gòu)與搏動(dòng)的輸卵管纖毛在拾卵、運(yùn)卵、為胚胎早起發(fā)育提供良好微環(huán)境等方面均能產(chǎn)生有利作用[12]。銀甲片對(duì)輸卵管纖毛形態(tài)恢復(fù)的治療效果推測(cè)這與銀甲片軟堅(jiān)散結(jié)、活血化瘀之功相關(guān)。

高劑量組、中劑量組、低劑量組、對(duì)照組TNF-α、hs-CRP、IL-6、IL-1β均顯著降低。其中TNF-α、IL-1β、IL-6是研究較為充分的炎性因子，TNF-α是炎癥反應(yīng)中的核心細(xì)胞因子，可通過(guò)“瀑布效應(yīng)”加重機(jī)體損傷[13]，其誘導(dǎo)的白細(xì)胞聚集可阻止炎癥彌散并促進(jìn)組織愈合，但在局部可加重炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)瘢痕形成。IL-6是炎癥反應(yīng)的主要標(biāo)志之一，是導(dǎo)致輸卵管慢性炎癥、粘連、肉芽纖維組織生長(zhǎng)的主要介質(zhì)[14]。IL-1β可促細(xì)胞因子聚集發(fā)揮促炎作用[15]。輸卵管內(nèi)含TNF-α、IL-6、IL-1β等多種細(xì)胞因子[16]，經(jīng)上述炎性機(jī)制導(dǎo)致輸卵管損傷、粘連、炎癥瘢痕等形成，輸卵管纖毛硬化、缺失。本研究結(jié)果顯示經(jīng)銀甲片治療后，PID模型大鼠炎性因子顯著下降，炎癥反應(yīng)顯著減輕。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)銀甲片可通過(guò)下調(diào)炎性因子水平改善PID炎癥反應(yīng)，并改善大鼠輸卵管、卵巢及子宮組織形態(tài)學(xué)表達(dá)，對(duì)輸卵管纖毛形態(tài)的病理改變有較顯著優(yōu)勢(shì)。